引用本文： 趙順鑫, 劉劍波. 醫用臭氧對特發性肺間質纖維化大鼠的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(1): 39-42. doi: 10.7507/1671-6205.2016010 復制
特發性肺纖維化(IPF)是一種纖維化性間質性肺炎，好發于老年人，多呈慢性、進行性加重[1]。迄今，IPF的發病原因及機制尚不明確，治療方面也無特效的治療手段，除肺移植外，尚無藥物對其有顯著的治療效果[2]。2015年美國胸科學會/歐洲呼吸學會(ATS/ERS)推薦比非尼酮和尼達尼布治療IPF，也只屬于有條件的推薦藥物。目前，IPF患者的中位生存期僅2~3年，近年來發現IPF患者生存時間有所延長，這促使發現特效的治療方法或延緩纖維化進展速度成為當今肺間質纖維化研究的熱點。IPF的發病機制牽涉到諸多因素，其中氧自由基代謝紊亂是一個很重要的因素[3-4]。而醫用臭氧能增加機體抗氧化酶的含量，提高機體的抗氧化能力，有利于氧自由基的清除[5]。本研究通過氣管內滴入博來霉素建立大鼠肺纖維模型，測定肺組織超氧化物歧化酶含量以及直接反映肺纖維化程度的肺組織羥脯氨酸含量[6]，并觀察大鼠的肺功能變化等來探討醫用臭氧對IPF的影響。
材料與方法
一 材料
40只清潔級的雄性Wistar大鼠由鄭州大學動物實驗中心提供，10~11周齡，體重(200±23) g。試劑包括博來霉素注射液(由浙江海正藥業股份有限公司)，速眠新Ⅱ注射液(吉林省敦化市圣達藥品有限公司)，羥脯氨酸檢測試劑盒(由上海利域生物科技有限公司)，超氧化物歧化酶檢測試劑盒(浙江愛康生物科技有限公司)。儀器包括醫用臭氧發生器(山東淄博悅華醫療器械有限公司)，以及小動物肺功能測定系統HX200型呼吸流量換能器(北京新行興業科貿有限公司)。組織取材、切片、染色、采圖等在鄭州大學第二附屬醫院病理科完成。
二 方法
1．實驗動物分組及模型制備：將40只雄性大鼠隨機分為對照組20只和實驗組20只。實驗動物肺纖維化模型采用大鼠氣管內滴入博來霉素，劑量為5 mg/kg[7-8]。將40只大鼠腹腔內注射速眠新Ⅱ麻醉，固定在鼠板上，無菌操作下沿氣管前正中縱向將皮膚切開，并逐層分離，使氣管暴露，于氣管軟骨環間朝向心端插入1 mL注射器，然后注入博來霉素(5 mg/kg)水溶液0.3 mL，360°旋轉大鼠，以使博來霉素溶液均勻涂布于肺表面，將切口縫合。實驗組20只大鼠從第2 d起隔日腹腔內注射醫用臭氧1 mL，醫用臭氧濃度為60μg/ mL[9]，對照組20只大鼠隔日注射生理鹽水1 mL作為對照。
2．肺功能測定：第28 d從對照組和實驗組中分別隨機選取10只大鼠，腹腔內注射速眠新Ⅱ麻醉，固定在鼠板上，無菌操作下沿氣管前正中縱向將皮膚切開，并逐層分離，使氣管暴露，于氣管軟骨環間水平剪破氣管，插入Y形管，連接HX200型呼吸流量換能器，采用AniRes2005動物肺功能分析系統測定大鼠第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)、第0.3秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV0.3/FVC)及呼氣峰流速(PEF)。應用MS4000U-IC生物信號定量記錄分析系統，經微機處理計算上述指標。
3．肺組織切片的制備：檢測肺功能后處死大鼠，取左側肺組織于液氮中保存，以備檢測超氧化物歧化酶及羥脯氨酸。取右側肺組織于10%中性福爾馬林液中固定，取材、切片、HE染色，根據文獻[10]的方法對肺組織切片纖維化程度進行評級，具體分級標準及評分見表 1。
表1
肺纖維化評級標準表
4．超氧化物歧化酶及羥脯氨酸測定：取大鼠左側肺組織(提前存于液氮中的新鮮肺組織)100 mg，碾碎，用1 mL生理鹽水稀釋后，嚴格按照相關試劑說明書步驟進行超氧化物歧化酶及羥脯氨酸測定。
5．生存時間觀察：28 d后兩組剩余各10只大鼠飼養條件不變，對照組大鼠繼續隔日腹腔內注射生理鹽水，實驗組大鼠繼續隔日腹腔內注射醫用臭氧，觀察記錄每只大鼠生存時間。
三 統計學處理
應用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理分析，數據采用
結果
一 大鼠一般情況
實驗組大鼠較對照組大鼠體重增加明顯，食欲較旺盛，皮膚毛發較具光澤，活動度較好，兩組大鼠至28 d均存活。
二 肺功能測定
對照組大鼠較實驗組大鼠肺功能下降明顯，差異有統計學意義(P < 0.05)。結果見表 2。
表2
大鼠肺功能測定結果(n=10，三 肺組織病理結果
實驗組大鼠肺組織切片肺纖維化程度多為+，以小片肺組織實變為主，肺泡壁輕度增厚，有少量炎細胞浸潤以及少量膠原沉積。對照組大鼠肺組織切片肺纖維化程度多為++，肺組織中有較多片狀實變區，實變區間見肺泡壁增厚較明顯，間隔增寬，有較多的炎細胞浸潤及較多膠原沉積。結果見圖 1。
圖1
大鼠第28 d肺組織病理像(HE×200)
a．對照組；b．實驗組
四 肺纖維化程度分級統計及評分
第28 d對大鼠肺組織切片肺纖維化程度分級統計并評分，對照組肺纖維化評分明顯高于實驗組，差異有統計學意義(P < 0.05)。結果見表 3。
表3
大鼠肺纖維化程度分級及評分(n=10，五 檢測指標對比分析
實驗組肺組織超氧化物歧化酶的含量明顯高于對照組，差異有統計學意義(P < 0.05)；實驗組肺組織羥脯氨酸含量明顯低于對照組，差異有統計學意義(P < 0.05)。結果見表 4。
表4
肺組織超氧化物歧化酶及羥脯氨酸含量(n=10，六 生存分析
對照組大鼠的中位生存期為59 d，實驗組大鼠的中位生存期為79 d，實驗組大鼠生存期長于對照組大鼠，兩組生存曲線間差異有統計學意義(P < 0.05)。結果見圖 2。
圖2
大鼠生存分析
討論
迄今為止，對IPF的治療主要分為藥物治療和手術治療，有條件推薦的藥物如吡非尼酮、尼達尼布、常規抑酸劑等，有條件不推薦的藥物如N-乙酰半胱氨酸、波生坦、西地那非等，手術治療如肺移植[11]。肺纖維化一旦形成，除肺移植外均無顯著療效，然而肺移植風險大、成本高、并發癥多、不良反應大。尤其IPF進展速度快，生存期短，使得發現特效的治療方法或延緩纖維化進展速度成為當今關于IPF研究的關鍵。
目前，IPF形成機制雖然不十分清楚，但已有證據表明肺纖維化與氧自由基的代謝紊亂有關。Oruqaj等[12]證實如果機體缺乏清除氧自由基的過氧化物酶，將使機體IPF的纖維化發展速度加快。在正常的生理條件下，氧自由基的產生與抗氧化系統維持平衡狀態；當抗氧化系統不足以對抗氧自由基的產生時，大量產生的氧自由基造成組織細胞的不可逆損傷，使細胞外基質產生過多[13]。細胞外基質中含有大量的膠原蛋白，且膠原蛋白多以纖維形式存在，使肺組織纖維化形成。羥脯氨酸在膠原蛋白中含量較高，在其他蛋白中含量較低，通過測定羥脯氨酸的含量可以反映肺纖維化的程度[14]。
醫用臭氧能促進多種抗氧化酶的產生，如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等，從而清除機體內的氧自由基，減少氧自由基對細胞損害[15]。有文獻報道在肺組織中超氧化物歧化酶是最主要的抗氧化劑，細胞表面及細胞外基質分布較多，在抑制細胞外基質的過度產生中起關鍵作用[16]。
本實驗通過大鼠腹腔內注射醫用臭氧，臭氧由腹膜血管吸收進入血液，使血液活化，增加體內超氧化物歧化酶等的含量，提高機體清除氧自由基的能力，從而對抗博來霉素對肺組織細胞的損害，減輕肺纖維化程度。實驗結果顯示，實驗組大鼠肺組織中過氧化物歧化酶的含量較對照組明顯增高，羥脯氨酸的含量較對照組明顯減少，說明醫用臭氧確實能激活機體自身的抗氧化系統，增加超氧化物歧化酶等的含量，提高機體清除氧自由基的能力，使肺組織中的羥脯氨酸產生減少，減輕肺纖維化，這也能從肺組織切片肺纖維化程度評分上得到證實。實驗還證實醫用臭氧能減輕肺纖維化對肺功能的破壞，延長大鼠生存期。此外，肺纖維化易反復合并肺部感染，造成IPF患者生活質量下降，有研究證實醫用臭氧能減少炎癥介質的釋放，破壞細菌結構，具有一定的抗炎、抗感染作用[17]，這也間接說明醫用臭氧要比一般的抗氧化劑更適合IPF的治療。
綜上所述，醫用臭氧能延緩大鼠肺纖維化的進展速度，延長肺纖維化大鼠的生存期，并且安全、經濟，對于IPF的治療可能有一定的應用前景。
特發性肺纖維化(IPF)是一種纖維化性間質性肺炎，好發于老年人，多呈慢性、進行性加重[1]。迄今，IPF的發病原因及機制尚不明確，治療方面也無特效的治療手段，除肺移植外，尚無藥物對其有顯著的治療效果[2]。2015年美國胸科學會/歐洲呼吸學會(ATS/ERS)推薦比非尼酮和尼達尼布治療IPF，也只屬于有條件的推薦藥物。目前，IPF患者的中位生存期僅2~3年，近年來發現IPF患者生存時間有所延長，這促使發現特效的治療方法或延緩纖維化進展速度成為當今肺間質纖維化研究的熱點。IPF的發病機制牽涉到諸多因素，其中氧自由基代謝紊亂是一個很重要的因素[3-4]。而醫用臭氧能增加機體抗氧化酶的含量，提高機體的抗氧化能力，有利于氧自由基的清除[5]。本研究通過氣管內滴入博來霉素建立大鼠肺纖維模型，測定肺組織超氧化物歧化酶含量以及直接反映肺纖維化程度的肺組織羥脯氨酸含量[6]，并觀察大鼠的肺功能變化等來探討醫用臭氧對IPF的影響。
材料與方法
一 材料
40只清潔級的雄性Wistar大鼠由鄭州大學動物實驗中心提供，10~11周齡，體重(200±23) g。試劑包括博來霉素注射液(由浙江海正藥業股份有限公司)，速眠新Ⅱ注射液(吉林省敦化市圣達藥品有限公司)，羥脯氨酸檢測試劑盒(由上海利域生物科技有限公司)，超氧化物歧化酶檢測試劑盒(浙江愛康生物科技有限公司)。儀器包括醫用臭氧發生器(山東淄博悅華醫療器械有限公司)，以及小動物肺功能測定系統HX200型呼吸流量換能器(北京新行興業科貿有限公司)。組織取材、切片、染色、采圖等在鄭州大學第二附屬醫院病理科完成。
二 方法
1．實驗動物分組及模型制備：將40只雄性大鼠隨機分為對照組20只和實驗組20只。實驗動物肺纖維化模型采用大鼠氣管內滴入博來霉素，劑量為5 mg/kg[7-8]。將40只大鼠腹腔內注射速眠新Ⅱ麻醉，固定在鼠板上，無菌操作下沿氣管前正中縱向將皮膚切開，并逐層分離，使氣管暴露，于氣管軟骨環間朝向心端插入1 mL注射器，然后注入博來霉素(5 mg/kg)水溶液0.3 mL，360°旋轉大鼠，以使博來霉素溶液均勻涂布于肺表面，將切口縫合。實驗組20只大鼠從第2 d起隔日腹腔內注射醫用臭氧1 mL，醫用臭氧濃度為60μg/ mL[9]，對照組20只大鼠隔日注射生理鹽水1 mL作為對照。
2．肺功能測定：第28 d從對照組和實驗組中分別隨機選取10只大鼠，腹腔內注射速眠新Ⅱ麻醉，固定在鼠板上，無菌操作下沿氣管前正中縱向將皮膚切開，并逐層分離，使氣管暴露，于氣管軟骨環間水平剪破氣管，插入Y形管，連接HX200型呼吸流量換能器，采用AniRes2005動物肺功能分析系統測定大鼠第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)、第0.3秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV0.3/FVC)及呼氣峰流速(PEF)。應用MS4000U-IC生物信號定量記錄分析系統，經微機處理計算上述指標。
3．肺組織切片的制備：檢測肺功能后處死大鼠，取左側肺組織于液氮中保存，以備檢測超氧化物歧化酶及羥脯氨酸。取右側肺組織于10%中性福爾馬林液中固定，取材、切片、HE染色，根據文獻[10]的方法對肺組織切片纖維化程度進行評級，具體分級標準及評分見表 1。
表1
肺纖維化評級標準表
4．超氧化物歧化酶及羥脯氨酸測定：取大鼠左側肺組織(提前存于液氮中的新鮮肺組織)100 mg，碾碎，用1 mL生理鹽水稀釋后，嚴格按照相關試劑說明書步驟進行超氧化物歧化酶及羥脯氨酸測定。
5．生存時間觀察：28 d后兩組剩余各10只大鼠飼養條件不變，對照組大鼠繼續隔日腹腔內注射生理鹽水，實驗組大鼠繼續隔日腹腔內注射醫用臭氧，觀察記錄每只大鼠生存時間。
三 統計學處理
應用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理分析，數據采用
結果
一 大鼠一般情況
實驗組大鼠較對照組大鼠體重增加明顯，食欲較旺盛，皮膚毛發較具光澤，活動度較好，兩組大鼠至28 d均存活。
二 肺功能測定
對照組大鼠較實驗組大鼠肺功能下降明顯，差異有統計學意義(P < 0.05)。結果見表 2。
表2
大鼠肺功能測定結果(n=10，三 肺組織病理結果
實驗組大鼠肺組織切片肺纖維化程度多為+，以小片肺組織實變為主，肺泡壁輕度增厚，有少量炎細胞浸潤以及少量膠原沉積。對照組大鼠肺組織切片肺纖維化程度多為++，肺組織中有較多片狀實變區，實變區間見肺泡壁增厚較明顯，間隔增寬，有較多的炎細胞浸潤及較多膠原沉積。結果見圖 1。
圖1
大鼠第28 d肺組織病理像(HE×200)
a．對照組；b．實驗組
四 肺纖維化程度分級統計及評分
第28 d對大鼠肺組織切片肺纖維化程度分級統計并評分，對照組肺纖維化評分明顯高于實驗組，差異有統計學意義(P < 0.05)。結果見表 3。
表3
大鼠肺纖維化程度分級及評分(n=10，五 檢測指標對比分析
實驗組肺組織超氧化物歧化酶的含量明顯高于對照組，差異有統計學意義(P < 0.05)；實驗組肺組織羥脯氨酸含量明顯低于對照組，差異有統計學意義(P < 0.05)。結果見表 4。
表4
肺組織超氧化物歧化酶及羥脯氨酸含量(n=10，六 生存分析
對照組大鼠的中位生存期為59 d，實驗組大鼠的中位生存期為79 d，實驗組大鼠生存期長于對照組大鼠，兩組生存曲線間差異有統計學意義(P < 0.05)。結果見圖 2。
圖2
大鼠生存分析
討論
迄今為止，對IPF的治療主要分為藥物治療和手術治療，有條件推薦的藥物如吡非尼酮、尼達尼布、常規抑酸劑等，有條件不推薦的藥物如N-乙酰半胱氨酸、波生坦、西地那非等，手術治療如肺移植[11]。肺纖維化一旦形成，除肺移植外均無顯著療效，然而肺移植風險大、成本高、并發癥多、不良反應大。尤其IPF進展速度快，生存期短，使得發現特效的治療方法或延緩纖維化進展速度成為當今關于IPF研究的關鍵。
目前，IPF形成機制雖然不十分清楚，但已有證據表明肺纖維化與氧自由基的代謝紊亂有關。Oruqaj等[12]證實如果機體缺乏清除氧自由基的過氧化物酶，將使機體IPF的纖維化發展速度加快。在正常的生理條件下，氧自由基的產生與抗氧化系統維持平衡狀態；當抗氧化系統不足以對抗氧自由基的產生時，大量產生的氧自由基造成組織細胞的不可逆損傷，使細胞外基質產生過多[13]。細胞外基質中含有大量的膠原蛋白，且膠原蛋白多以纖維形式存在，使肺組織纖維化形成。羥脯氨酸在膠原蛋白中含量較高，在其他蛋白中含量較低，通過測定羥脯氨酸的含量可以反映肺纖維化的程度[14]。
醫用臭氧能促進多種抗氧化酶的產生，如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等，從而清除機體內的氧自由基，減少氧自由基對細胞損害[15]。有文獻報道在肺組織中超氧化物歧化酶是最主要的抗氧化劑，細胞表面及細胞外基質分布較多，在抑制細胞外基質的過度產生中起關鍵作用[16]。
本實驗通過大鼠腹腔內注射醫用臭氧，臭氧由腹膜血管吸收進入血液，使血液活化，增加體內超氧化物歧化酶等的含量，提高機體清除氧自由基的能力，從而對抗博來霉素對肺組織細胞的損害，減輕肺纖維化程度。實驗結果顯示，實驗組大鼠肺組織中過氧化物歧化酶的含量較對照組明顯增高，羥脯氨酸的含量較對照組明顯減少，說明醫用臭氧確實能激活機體自身的抗氧化系統，增加超氧化物歧化酶等的含量，提高機體清除氧自由基的能力，使肺組織中的羥脯氨酸產生減少，減輕肺纖維化，這也能從肺組織切片肺纖維化程度評分上得到證實。實驗還證實醫用臭氧能減輕肺纖維化對肺功能的破壞，延長大鼠生存期。此外，肺纖維化易反復合并肺部感染，造成IPF患者生活質量下降，有研究證實醫用臭氧能減少炎癥介質的釋放，破壞細菌結構，具有一定的抗炎、抗感染作用[17]，這也間接說明醫用臭氧要比一般的抗氧化劑更適合IPF的治療。
綜上所述，醫用臭氧能延緩大鼠肺纖維化的進展速度，延長肺纖維化大鼠的生存期，并且安全、經濟，對于IPF的治療可能有一定的應用前景。
