引用本文： 李妍, 韓鋒鋒, 李艷利, 於海洋, 羅勇, 徐衛國. 自噬-溶酶體系統在慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌萎縮中的作用機制. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(6): 534-540. doi: 10.7507/1671-6205.2015132 復制
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是全球范圍內普遍危害成人健康的全身性疾病之一，其發病率和死亡率均較高，慢阻肺是由多種危險因素共同參與、多種生物機制同時介導的全身多系統性、慢性炎癥反應性疾病，而不只是局限于氣道和肺部的疾病[1-2]。慢阻肺患者常并發營養不良，發生率可高達70%，主要表現為骨骼肌消耗與萎縮，患者可發生嚴重的骨骼肌肌力和耐力下降，嚴重影響其生活質量及預后，加重自身和社會的經濟負擔[3]。目前認為嚴重骨骼肌營養不良的本質在于蛋白質降解和合成之間的失平衡[4]。我們的前期研究發現慢阻肺大鼠全身骨骼肌總蛋白明顯降解，骨骼肌肌纖維蛋白消耗尤為顯著[5]；慢阻肺患者骨骼肌肌纖維萎縮，肌纖維截面積減小；骨骼肌肌纖維類型改變，運動神經元功能減弱，并有末梢運動神經受損的表現[6-7]。因此，對慢阻肺患者骨骼肌蛋白高分解代謝的研究具有重要意義。骨骼肌細胞蛋白降解途徑主要包括泛素-蛋白酶體途徑、自噬-溶酶體途徑和Ca2+依賴性途徑[8]。本研究擬檢測慢阻肺大鼠模型中骨骼肌組織FOXO轉錄因子以及自噬相關基因Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5的mRNA及蛋白表達，探討自噬-溶酶體系統在慢阻肺大鼠骨骼肌萎縮中的作用機制，進一步探索骨骼肌萎縮的機制。
材料與方法
一 材料
1.實驗動物：清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠24只，6周齡，體重150～200 g，動物反應良好，性情溫和，毛色均勻，無脫毛、斷尾現象，由上海交通大學醫學院附屬新華醫院實驗動物房提供。購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)2003-0002，使用許可證號：SYXK(滬)2003-0031。
2.主要試劑和儀器：大前門香煙(尼古丁含量0.9 mg，焦油含量12 mg，煙氣堿含量14 mg，購自上海煙草公司)，逆轉錄試劑盒[TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司]，Real time PCR試劑盒[TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司]，一抗(Abcam，美國)，一抗稀釋液(CST，美國)，二抗(碧云天，中國),化學發光劑(Millipore，美國)，大鼠白細胞介素6 (IL-6)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(達科為，中國)，大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(達科為，中國)。
二 方法
1.模型制備與分組：采用隨機數字表方法分為兩組：對照組(12只)和實驗組(12只)。每箱6只大鼠飼養，實驗組采用熏香煙法：實驗組大鼠每天被動吸煙2次，間隔至少2 h，每次4個循環，每個循環4支大前門香煙，燃盡后開始下一個循環，每周6 d，持續12周。對照組吸入正常空氣。所有大鼠均普通飲食飼養，自由進食、進水。12周后，應用小動物肺功能儀(BUXCO，美國)測定兩組大鼠肺功能情況。測定以下數據：吸氣量(IC)，肺活量(VC)，用力肺活量(FVC)，功能殘氣量(FRC)，肺總量(TLC)，第1秒用力呼氣容積(FEV1)，第2秒用力呼氣容積(FEV2)，用力呼氣中段流量(FEF25、FEF50及FEF75)。肺功能檢測結束后，用戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功后，暴露胸腔心臟抽血致死，盡量去除外周血，收集血液，離心(3 000 r/min，15 min)收集上清。死亡15 min內，無創游離雙側趾長伸肌，沿肌束方向取1 mm×2 mm×1 mm肌肉組織放于戊二醛中固定留作電鏡，其余組織放入凍存管中，液氮凍存，留做以下實驗。結扎右肺，自環狀軟骨至劍突處剪開，充分暴露氣管。在環狀軟骨處氣管剪一“V”型切口，預先穿過一根絲線，將靜脈留置針插入氣管至氣管隆突處，適度扎緊。靜脈留置針連接一5 mL注射器，先抽盡左肺內的剩余氣體，再用PBS液灌洗肺組織，每次約3 mL，回抽BALF 1～2 mL，共3次，回收灌洗液大約1.5 mL。離心(1 500 r/min，10 min)收集上清，置于-80 ℃保存。于右肺矢狀面最大周徑處取肺組織，浸入4%多聚甲醛中固定，6 h內包埋，另取1 mm×1 mm×1 mm肺組織放于戊二醛中固定留作電鏡。
2.肺組織病理切片的制備：按已固定好的肺組織矢狀面中外1/3取材，標本常規脫水、石蠟包埋、二甲苯脫蠟、經各級乙醇至水洗，然后經蘇木素、伊紅染色，常規脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。
3.透射電鏡觀察：將已用戊二醛固定2 h以上的組織標本，1%鋨酸固定2 h，丙酮逐級脫水，618環氧樹脂包埋，半薄切片定位，切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色。電鏡下觀察。
4.ELISA測定大鼠肺泡灌洗液上清和血清中的IL-6、TNF-α的表達：按照ELISA試劑盒廠家所提供的操作指南進行操作，將不同濃度的標準品和樣品加入相應的孔中，37 ℃孵育2 h，洗板。然后依次加入辣根過氧化物酶工作液、標準色液、終止液，用自動酶標儀處在30 min內讀取光密度值(OD)。根據標準曲線計算待測樣品的IL-6、TNF-α含量。
5.實時定量-PCR檢測大鼠趾長伸肌組織中FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5的mRNA表達：取相同質量50 mg的趾長伸肌放入勻漿器內，加入1 mL Trizol提取RNA，用分光光度計測定RNA的濃度和OD260/280比值。各樣本均按1 μg RNA相對應的體積(nμL)根據逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，轉錄體系為20 μL體系，將混合好的液體放置在PCR儀中，反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。將經過逆轉錄得到的cDNA按照Real time PCR說明書進行半定量PCR，使用ABI7500進行反應，反應條件為95 ℃ 30 s 1個循環，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s為40個循環，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s 1個循環，內參為GAPDH，引物序列見表 1。Real time PCR得到的相應的Ct值用2-ΔΔCt法進行分析。
表1
引物序列
6.Western blot測定大鼠趾長伸肌組織中FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5的蛋白表達：用RIPA裂解液提取大鼠趾長伸肌組織中的樣品總蛋白，然后用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定大鼠趾長伸肌組織中的樣品總蛋白濃度。將所提取總蛋白樣品與5×上樣緩沖液按比例混合，沸水浴變性10 min，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后蛋白電轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，再放入含有適量稀釋后的一抗(用一抗稀釋液以1∶1 000稀釋)，4 ℃振蕩過夜。洗滌。敷二抗(用5%脫脂奶粉溶液以1∶3 000稀釋)，室溫振蕩1 h，洗滌，最終使用化學發光劑顯影成像。結果經Image LabTM軟件進行灰度值分析。
三 統計學處理
應用GraphPad Prism5統計軟件對實驗數據進行統計學分析，數據以
結果
一 體重變化
煙熏0周和煙熏4周時實驗組和對照組大鼠的平均體重差異不具有統計學意義，煙熏8周時實驗組大鼠體重明顯低于對照組大鼠體重，但尚未達到營養不良的標準。煙熏12周時實驗組大鼠體重明顯低于對照組大鼠體重(P<0.01)，且體重下降已超過預計值的10%，出現營養不良改變。結果見圖 1。
圖1
大鼠體重變化
與對照組比較，*
二 肺功能變化
兩組肺功能各項指標實驗組較對照組下降(P<0.01)。結果見表 2。
表2
兩組大鼠肺功能結果(三 肺組織形態學改變
肺組織石蠟切片HE染色，光學顯微鏡下可見：對照組大鼠肺泡結構正常，無炎癥細胞聚集，無支氣管擴張；實驗組大鼠肺泡破裂、融合形成肺大皰，炎癥細胞浸潤，支氣管擴張，呈細支氣管慢性炎及肺氣腫的典型改變。結果見圖 2。
圖2
大鼠肺組織病理檢查像(HE ×100) a.對照組,大鼠肺泡結構正常，無炎癥細胞聚集，無支氣管擴張；b.實驗組,大鼠肺泡破裂、融合形成肺大皰，炎癥細胞浸潤，支氣管擴張
四 大鼠趾長伸肌及肺組織的電鏡觀察結果
透射電鏡下可見，對照組大鼠趾長伸肌組織胞漿內未發現自噬溶酶體(圖 3a)，實驗組大鼠趾長伸肌組織胞漿內發現自噬溶酶體增多(圖 3b)；對照組肺組織未發現明顯異常(圖 3c)，實驗組肺組織電鏡下發現纖維化和炎癥細胞增多(圖 3d)。
圖3
大鼠趾長伸肌組織和肺組織的透射電鏡檢查像(×24 500) a.對照組大鼠趾長伸肌組織,胞漿內未發現自噬溶酶體；b.實驗組大鼠趾長伸肌組織,自噬溶酶體(黑箭)增多；c.對照組肺組織,肺組織未發現明顯異常；d.實驗組肺組織,纖維化和炎癥細胞(黑箭)增多
五 大鼠肺泡灌洗液上清和血清中的IL-6、TNF-α的表達
實驗組與正常對照組相比，肺泡灌洗液上清和血清中的炎癥因子IL-6顯著升高(P<0.05)；在肺泡灌洗液上清中炎癥因子TNF-α實驗組較對照組顯著升高(P<0.01)，血清中TNF-α在兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。結果見圖 4。
圖4
大鼠肺泡灌洗液上清和血清中的IL-6(a)、TNF-α(b)的表達
與對照組比較，*
六 FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5的mRNA表達變化
Real time PCR分析結果顯示，大鼠趾長伸肌組織中FOXO轉錄因子以及自噬相關基因Bnip3、Beclin1、p62及Atg5的mRNA表達實驗組顯著高于對照組(P<0.05，其中Bnip3兩組對照P<0.01)。MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ的mRNA表達兩組間的差異無統計學意義(P>0.05)。結果見圖 5。
圖5
大鼠趾長伸肌內FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5的mRNA表達
與對照組比較，*
七 FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5蛋白表達變化
Western blot分析結果顯示，FOXO轉錄因子以及自噬相關基因Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ 及Atg5的蛋白表達實驗組顯著高于對照組(P<0.05，其中Bnip3、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1兩組對照P<0.01)。結果見圖 6和圖 7。
圖6
大鼠趾長伸肌內Atg5、Bnip3及MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達 a. Western blot檢測像； b.蛋白相對表達量比較
與對照組比較，*
圖7
大鼠趾長伸肌內Beclin1、p62及FOXO的蛋白表達 a.Western blot檢測像；b.蛋白相對表達量比較
與對照組比較，*
討論
慢阻肺患者骨骼肌萎縮引起骨骼肌功能障礙，導致骨骼肌肌力及耐力下降，直接影響疾病的進展和預后，加重患者和社會的經濟負擔[3, 9]。慢阻肺患者發生的骨骼肌萎縮是一種多因素、多機制共同參與的復雜過程，其最終歸結為骨骼肌蛋白降解和合成之間的不平衡，蛋白降解增加大于蛋白合成，導致骨骼肌萎縮[10]。骨骼肌細胞蛋白降解途徑主要包括泛素-蛋白酶體途徑、自噬-溶酶體途徑和Ca2+依賴性途徑[8]。
泛素-蛋白酶體系統主要由泛素、泛素相關酶(包括E1、E2S、E3S等)和蛋白酶體三部分組成，在多種蛋白質降解的過程中發揮重要作用，是骨骼肌蛋白降解的主要途徑[11-12]。Ottenheijm等[13]于2006年首次報道了慢阻肺患者膈肌20s蛋白酶體水平升高。我們前期的研究發現慢阻肺大鼠膈肌組織和伸趾長肌中泛素和E2-14K的mRNA和蛋白表達明顯高于正常對照組[14-15]；慢阻肺大鼠骨骼肌中泛素-蛋白酶體系統中20s蛋白酶體C2亞基的mRNA和蛋白表達均顯著增強[16]，提示慢阻肺的骨骼肌消耗和營養不良與泛素-蛋白酶體系統的過度激活有關。體外研究資料顯示，E3連接酶的兩個肌肉萎縮特異性指標——atrogin-1(muscle atrophy F-box)和MuRF-1(muscle ring finger 1)，通過泛素連接肌肉細胞從而降解肌肉細胞中蛋白質，被稱為泛素連接酶[17-18]。我們前期的研究發現慢阻肺大鼠骨骼肌atrogin-1和MuRF-1的基因和蛋白表達明顯上調，并受AKT/FOXO信號通路調控，說明AKT/FOXOs/Atrogin-1/MuRF-l信號通路參與慢阻肺骨骼肌消耗和萎縮機制[6]。
自噬是一種不同于凋亡的程序性細胞死亡方式，指細胞受到刺激后吞噬自身細胞器或細胞質并最終在溶酶體內降解吞噬物的過程，自噬-溶酶體系統是真核細胞內的另一蛋白降解系統。按吞噬物進入溶酶體的方式,可將細胞自噬分為微自噬、巨自噬和分子伴侶介導的自噬[19-21]。最新發現，多種疾病所致的骨骼肌萎縮，其骨骼肌中自噬-溶酶體系統上調，抑制自噬可改善骨骼肌萎縮，提示自噬激活可促進骨骼肌萎縮的發生[22]。Lecker等[21]通過對癌癥、禁食、糖尿病及尿毒癥的動物模型的骨骼肌進行基因檢測，發現泛素-蛋白酶體系統的標志物atrogin-1和MuRF-1以及自噬-溶酶體系統的標志物GABAA受體相關蛋白相似蛋1(Gabarapl 1)、微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)、Bcl2/腺病毒E1B結合蛋白3(Bnip3)、組織蛋白酶L(Cathepsin I)上調。隨后的多項研究發現，不同病因所致的骨骼肌萎縮模型及臨床相關疾病的骨骼肌標本中均存在著活躍的自噬-溶酶體系統[21-27]。骨骼肌中自噬的調控機制較為復雜，多種調節自噬的分子可通過直接或間接與Atg的作用調節自噬。p62蛋白與LC3(哺乳動物中Atg8的同源蛋白)可直接作用，介導多泛素樣蛋白經ALS降解[28]，第三類磷脂酰肌醇3激酶(class Ⅲ PI3)與Beclin l(Atg6的同源蛋白)相互作可形成class Ⅲ PI3-Beclin l復合體，調節骨骼肌細胞自噬途徑[29]。其中FOXO轉錄因子是十分關鍵的自噬調控因子[30]，可通過Bnip3促進自噬小體形成[22]，并引起自體吞噬基因包括LC3、VPs34、Bnip3和溶酶體組織蛋白酶L的表達上調[31]，并且這種作用不受蛋白酶體抑制劑的影響，說明FOXO可獨立的調控骨骼肌中的兩條降解途徑，即泛素-蛋白酶體途徑、自噬-溶酶體途徑[22]。有研究發現在慢阻肺患者和暴露于香煙或香煙萃取物的小鼠的肺組織中，存在自噬作用增強的證據[32-33]，而吸煙是慢阻肺的最常見的原因。因此，我們推測在慢阻肺的發生、發展中自噬作用發揮了相當重要的作用，同時其也受到慢阻肺發病中其他機制或過程的調節。但自噬系統在慢阻肺骨骼肌萎縮中的作用及調控目前尚未有報道。
在本研究中我們檢測了慢阻肺大鼠模型中骨骼肌組織中FOXO轉錄因子以及自噬相關基因Bnip3、Beclin1、P62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5的mRNA及蛋白表達，結果顯示：煙熏12周的實驗組大鼠趾長伸肌FOXO轉錄因子以及自噬相關基因Bnip3、Beclin1、p62及Atg5的mRNA及蛋白表達量顯著高于對照組。透射電鏡下，我們也觀察到，與對照組比較，實驗組大鼠趾長伸肌組織中自噬溶酶體增多，肺組織中出現肺組織纖維化和炎癥細胞增多，說明慢阻肺大鼠趾長伸肌組織內自噬-溶酶體系統被激活。結合我們的前期研究結果，可得出結論：在慢阻肺大鼠模型的骨骼肌萎縮中，兩條降解途徑泛素-蛋白酶體系統和自噬-溶酶體系統均被激活，可能是慢阻肺大鼠模型中骨骼肌萎縮的機制之一。
泛素-蛋白酶體系統和自噬-溶酶體系統長期以來一直被認作是完全獨立的系統，然而越來越多的證據顯示兩者是功能相關的分解代謝過程：最初發現單泛素化可作為胞吞關鍵信號，隨后又有一系列證據顯示泛素可作為選擇性自噬的特異信號[34-35]，這兩條降解系統分享某些調節分子和底物，表現為協同作用，在某些背景下又顯示補償功能。在接下來的實驗中，我們將著重探討泛素-蛋白酶體系統和自噬-溶酶體系統之間的相互關系，為慢阻肺患者骨骼肌萎縮的治療提供新的理論依據。
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是全球范圍內普遍危害成人健康的全身性疾病之一，其發病率和死亡率均較高，慢阻肺是由多種危險因素共同參與、多種生物機制同時介導的全身多系統性、慢性炎癥反應性疾病，而不只是局限于氣道和肺部的疾病[1-2]。慢阻肺患者常并發營養不良，發生率可高達70%，主要表現為骨骼肌消耗與萎縮，患者可發生嚴重的骨骼肌肌力和耐力下降，嚴重影響其生活質量及預后，加重自身和社會的經濟負擔[3]。目前認為嚴重骨骼肌營養不良的本質在于蛋白質降解和合成之間的失平衡[4]。我們的前期研究發現慢阻肺大鼠全身骨骼肌總蛋白明顯降解，骨骼肌肌纖維蛋白消耗尤為顯著[5]；慢阻肺患者骨骼肌肌纖維萎縮，肌纖維截面積減小；骨骼肌肌纖維類型改變，運動神經元功能減弱，并有末梢運動神經受損的表現[6-7]。因此，對慢阻肺患者骨骼肌蛋白高分解代謝的研究具有重要意義。骨骼肌細胞蛋白降解途徑主要包括泛素-蛋白酶體途徑、自噬-溶酶體途徑和Ca2+依賴性途徑[8]。本研究擬檢測慢阻肺大鼠模型中骨骼肌組織FOXO轉錄因子以及自噬相關基因Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5的mRNA及蛋白表達，探討自噬-溶酶體系統在慢阻肺大鼠骨骼肌萎縮中的作用機制，進一步探索骨骼肌萎縮的機制。
材料與方法
一 材料
1.實驗動物：清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠24只，6周齡，體重150～200 g，動物反應良好，性情溫和，毛色均勻，無脫毛、斷尾現象，由上海交通大學醫學院附屬新華醫院實驗動物房提供。購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)2003-0002，使用許可證號：SYXK(滬)2003-0031。
2.主要試劑和儀器：大前門香煙(尼古丁含量0.9 mg，焦油含量12 mg，煙氣堿含量14 mg，購自上海煙草公司)，逆轉錄試劑盒[TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司]，Real time PCR試劑盒[TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司]，一抗(Abcam，美國)，一抗稀釋液(CST，美國)，二抗(碧云天，中國),化學發光劑(Millipore，美國)，大鼠白細胞介素6 (IL-6)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(達科為，中國)，大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(達科為，中國)。
二 方法
1.模型制備與分組：采用隨機數字表方法分為兩組：對照組(12只)和實驗組(12只)。每箱6只大鼠飼養，實驗組采用熏香煙法：實驗組大鼠每天被動吸煙2次，間隔至少2 h，每次4個循環，每個循環4支大前門香煙，燃盡后開始下一個循環，每周6 d，持續12周。對照組吸入正常空氣。所有大鼠均普通飲食飼養，自由進食、進水。12周后，應用小動物肺功能儀(BUXCO，美國)測定兩組大鼠肺功能情況。測定以下數據：吸氣量(IC)，肺活量(VC)，用力肺活量(FVC)，功能殘氣量(FRC)，肺總量(TLC)，第1秒用力呼氣容積(FEV1)，第2秒用力呼氣容積(FEV2)，用力呼氣中段流量(FEF25、FEF50及FEF75)。肺功能檢測結束后，用戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功后，暴露胸腔心臟抽血致死，盡量去除外周血，收集血液，離心(3 000 r/min，15 min)收集上清。死亡15 min內，無創游離雙側趾長伸肌，沿肌束方向取1 mm×2 mm×1 mm肌肉組織放于戊二醛中固定留作電鏡，其余組織放入凍存管中，液氮凍存，留做以下實驗。結扎右肺，自環狀軟骨至劍突處剪開，充分暴露氣管。在環狀軟骨處氣管剪一“V”型切口，預先穿過一根絲線，將靜脈留置針插入氣管至氣管隆突處，適度扎緊。靜脈留置針連接一5 mL注射器，先抽盡左肺內的剩余氣體，再用PBS液灌洗肺組織，每次約3 mL，回抽BALF 1～2 mL，共3次，回收灌洗液大約1.5 mL。離心(1 500 r/min，10 min)收集上清，置于-80 ℃保存。于右肺矢狀面最大周徑處取肺組織，浸入4%多聚甲醛中固定，6 h內包埋，另取1 mm×1 mm×1 mm肺組織放于戊二醛中固定留作電鏡。
2.肺組織病理切片的制備：按已固定好的肺組織矢狀面中外1/3取材，標本常規脫水、石蠟包埋、二甲苯脫蠟、經各級乙醇至水洗，然后經蘇木素、伊紅染色，常規脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。
3.透射電鏡觀察：將已用戊二醛固定2 h以上的組織標本，1%鋨酸固定2 h，丙酮逐級脫水，618環氧樹脂包埋，半薄切片定位，切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色。電鏡下觀察。
4.ELISA測定大鼠肺泡灌洗液上清和血清中的IL-6、TNF-α的表達：按照ELISA試劑盒廠家所提供的操作指南進行操作，將不同濃度的標準品和樣品加入相應的孔中，37 ℃孵育2 h，洗板。然后依次加入辣根過氧化物酶工作液、標準色液、終止液，用自動酶標儀處在30 min內讀取光密度值(OD)。根據標準曲線計算待測樣品的IL-6、TNF-α含量。
5.實時定量-PCR檢測大鼠趾長伸肌組織中FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5的mRNA表達：取相同質量50 mg的趾長伸肌放入勻漿器內，加入1 mL Trizol提取RNA，用分光光度計測定RNA的濃度和OD260/280比值。各樣本均按1 μg RNA相對應的體積(nμL)根據逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，轉錄體系為20 μL體系，將混合好的液體放置在PCR儀中，反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。將經過逆轉錄得到的cDNA按照Real time PCR說明書進行半定量PCR，使用ABI7500進行反應，反應條件為95 ℃ 30 s 1個循環，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s為40個循環，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s 1個循環，內參為GAPDH，引物序列見表 1。Real time PCR得到的相應的Ct值用2-ΔΔCt法進行分析。
表1
引物序列
6.Western blot測定大鼠趾長伸肌組織中FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5的蛋白表達：用RIPA裂解液提取大鼠趾長伸肌組織中的樣品總蛋白，然后用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定大鼠趾長伸肌組織中的樣品總蛋白濃度。將所提取總蛋白樣品與5×上樣緩沖液按比例混合，沸水浴變性10 min，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后蛋白電轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，再放入含有適量稀釋后的一抗(用一抗稀釋液以1∶1 000稀釋)，4 ℃振蕩過夜。洗滌。敷二抗(用5%脫脂奶粉溶液以1∶3 000稀釋)，室溫振蕩1 h，洗滌，最終使用化學發光劑顯影成像。結果經Image LabTM軟件進行灰度值分析。
三 統計學處理
應用GraphPad Prism5統計軟件對實驗數據進行統計學分析，數據以
結果
一 體重變化
煙熏0周和煙熏4周時實驗組和對照組大鼠的平均體重差異不具有統計學意義，煙熏8周時實驗組大鼠體重明顯低于對照組大鼠體重，但尚未達到營養不良的標準。煙熏12周時實驗組大鼠體重明顯低于對照組大鼠體重(P<0.01)，且體重下降已超過預計值的10%，出現營養不良改變。結果見圖 1。
圖1
大鼠體重變化
與對照組比較，*
二 肺功能變化
兩組肺功能各項指標實驗組較對照組下降(P<0.01)。結果見表 2。
表2
兩組大鼠肺功能結果(三 肺組織形態學改變
肺組織石蠟切片HE染色，光學顯微鏡下可見：對照組大鼠肺泡結構正常，無炎癥細胞聚集，無支氣管擴張；實驗組大鼠肺泡破裂、融合形成肺大皰，炎癥細胞浸潤，支氣管擴張，呈細支氣管慢性炎及肺氣腫的典型改變。結果見圖 2。
圖2
大鼠肺組織病理檢查像(HE ×100) a.對照組,大鼠肺泡結構正常，無炎癥細胞聚集，無支氣管擴張；b.實驗組,大鼠肺泡破裂、融合形成肺大皰，炎癥細胞浸潤，支氣管擴張
四 大鼠趾長伸肌及肺組織的電鏡觀察結果
透射電鏡下可見，對照組大鼠趾長伸肌組織胞漿內未發現自噬溶酶體(圖 3a)，實驗組大鼠趾長伸肌組織胞漿內發現自噬溶酶體增多(圖 3b)；對照組肺組織未發現明顯異常(圖 3c)，實驗組肺組織電鏡下發現纖維化和炎癥細胞增多(圖 3d)。
圖3
大鼠趾長伸肌組織和肺組織的透射電鏡檢查像(×24 500) a.對照組大鼠趾長伸肌組織,胞漿內未發現自噬溶酶體；b.實驗組大鼠趾長伸肌組織,自噬溶酶體(黑箭)增多；c.對照組肺組織,肺組織未發現明顯異常；d.實驗組肺組織,纖維化和炎癥細胞(黑箭)增多
五 大鼠肺泡灌洗液上清和血清中的IL-6、TNF-α的表達
實驗組與正常對照組相比，肺泡灌洗液上清和血清中的炎癥因子IL-6顯著升高(P<0.05)；在肺泡灌洗液上清中炎癥因子TNF-α實驗組較對照組顯著升高(P<0.01)，血清中TNF-α在兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。結果見圖 4。
圖4
大鼠肺泡灌洗液上清和血清中的IL-6(a)、TNF-α(b)的表達
與對照組比較，*
六 FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5的mRNA表達變化
Real time PCR分析結果顯示，大鼠趾長伸肌組織中FOXO轉錄因子以及自噬相關基因Bnip3、Beclin1、p62及Atg5的mRNA表達實驗組顯著高于對照組(P<0.05，其中Bnip3兩組對照P<0.01)。MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ的mRNA表達兩組間的差異無統計學意義(P>0.05)。結果見圖 5。
圖5
大鼠趾長伸肌內FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5的mRNA表達
與對照組比較，*
七 FOXO、Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5蛋白表達變化
Western blot分析結果顯示，FOXO轉錄因子以及自噬相關基因Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ 及Atg5的蛋白表達實驗組顯著高于對照組(P<0.05，其中Bnip3、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1兩組對照P<0.01)。結果見圖 6和圖 7。
圖6
大鼠趾長伸肌內Atg5、Bnip3及MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達 a. Western blot檢測像； b.蛋白相對表達量比較
與對照組比較，*
圖7
大鼠趾長伸肌內Beclin1、p62及FOXO的蛋白表達 a.Western blot檢測像；b.蛋白相對表達量比較
與對照組比較，*
討論
慢阻肺患者骨骼肌萎縮引起骨骼肌功能障礙，導致骨骼肌肌力及耐力下降，直接影響疾病的進展和預后，加重患者和社會的經濟負擔[3, 9]。慢阻肺患者發生的骨骼肌萎縮是一種多因素、多機制共同參與的復雜過程，其最終歸結為骨骼肌蛋白降解和合成之間的不平衡，蛋白降解增加大于蛋白合成，導致骨骼肌萎縮[10]。骨骼肌細胞蛋白降解途徑主要包括泛素-蛋白酶體途徑、自噬-溶酶體途徑和Ca2+依賴性途徑[8]。
泛素-蛋白酶體系統主要由泛素、泛素相關酶(包括E1、E2S、E3S等)和蛋白酶體三部分組成，在多種蛋白質降解的過程中發揮重要作用，是骨骼肌蛋白降解的主要途徑[11-12]。Ottenheijm等[13]于2006年首次報道了慢阻肺患者膈肌20s蛋白酶體水平升高。我們前期的研究發現慢阻肺大鼠膈肌組織和伸趾長肌中泛素和E2-14K的mRNA和蛋白表達明顯高于正常對照組[14-15]；慢阻肺大鼠骨骼肌中泛素-蛋白酶體系統中20s蛋白酶體C2亞基的mRNA和蛋白表達均顯著增強[16]，提示慢阻肺的骨骼肌消耗和營養不良與泛素-蛋白酶體系統的過度激活有關。體外研究資料顯示，E3連接酶的兩個肌肉萎縮特異性指標——atrogin-1(muscle atrophy F-box)和MuRF-1(muscle ring finger 1)，通過泛素連接肌肉細胞從而降解肌肉細胞中蛋白質，被稱為泛素連接酶[17-18]。我們前期的研究發現慢阻肺大鼠骨骼肌atrogin-1和MuRF-1的基因和蛋白表達明顯上調，并受AKT/FOXO信號通路調控，說明AKT/FOXOs/Atrogin-1/MuRF-l信號通路參與慢阻肺骨骼肌消耗和萎縮機制[6]。
自噬是一種不同于凋亡的程序性細胞死亡方式，指細胞受到刺激后吞噬自身細胞器或細胞質并最終在溶酶體內降解吞噬物的過程，自噬-溶酶體系統是真核細胞內的另一蛋白降解系統。按吞噬物進入溶酶體的方式,可將細胞自噬分為微自噬、巨自噬和分子伴侶介導的自噬[19-21]。最新發現，多種疾病所致的骨骼肌萎縮，其骨骼肌中自噬-溶酶體系統上調，抑制自噬可改善骨骼肌萎縮，提示自噬激活可促進骨骼肌萎縮的發生[22]。Lecker等[21]通過對癌癥、禁食、糖尿病及尿毒癥的動物模型的骨骼肌進行基因檢測，發現泛素-蛋白酶體系統的標志物atrogin-1和MuRF-1以及自噬-溶酶體系統的標志物GABAA受體相關蛋白相似蛋1(Gabarapl 1)、微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)、Bcl2/腺病毒E1B結合蛋白3(Bnip3)、組織蛋白酶L(Cathepsin I)上調。隨后的多項研究發現，不同病因所致的骨骼肌萎縮模型及臨床相關疾病的骨骼肌標本中均存在著活躍的自噬-溶酶體系統[21-27]。骨骼肌中自噬的調控機制較為復雜，多種調節自噬的分子可通過直接或間接與Atg的作用調節自噬。p62蛋白與LC3(哺乳動物中Atg8的同源蛋白)可直接作用，介導多泛素樣蛋白經ALS降解[28]，第三類磷脂酰肌醇3激酶(class Ⅲ PI3)與Beclin l(Atg6的同源蛋白)相互作可形成class Ⅲ PI3-Beclin l復合體，調節骨骼肌細胞自噬途徑[29]。其中FOXO轉錄因子是十分關鍵的自噬調控因子[30]，可通過Bnip3促進自噬小體形成[22]，并引起自體吞噬基因包括LC3、VPs34、Bnip3和溶酶體組織蛋白酶L的表達上調[31]，并且這種作用不受蛋白酶體抑制劑的影響，說明FOXO可獨立的調控骨骼肌中的兩條降解途徑，即泛素-蛋白酶體途徑、自噬-溶酶體途徑[22]。有研究發現在慢阻肺患者和暴露于香煙或香煙萃取物的小鼠的肺組織中，存在自噬作用增強的證據[32-33]，而吸煙是慢阻肺的最常見的原因。因此，我們推測在慢阻肺的發生、發展中自噬作用發揮了相當重要的作用，同時其也受到慢阻肺發病中其他機制或過程的調節。但自噬系統在慢阻肺骨骼肌萎縮中的作用及調控目前尚未有報道。
在本研究中我們檢測了慢阻肺大鼠模型中骨骼肌組織中FOXO轉錄因子以及自噬相關基因Bnip3、Beclin1、P62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ及Atg5的mRNA及蛋白表達，結果顯示：煙熏12周的實驗組大鼠趾長伸肌FOXO轉錄因子以及自噬相關基因Bnip3、Beclin1、p62及Atg5的mRNA及蛋白表達量顯著高于對照組。透射電鏡下，我們也觀察到，與對照組比較，實驗組大鼠趾長伸肌組織中自噬溶酶體增多，肺組織中出現肺組織纖維化和炎癥細胞增多，說明慢阻肺大鼠趾長伸肌組織內自噬-溶酶體系統被激活。結合我們的前期研究結果，可得出結論：在慢阻肺大鼠模型的骨骼肌萎縮中，兩條降解途徑泛素-蛋白酶體系統和自噬-溶酶體系統均被激活，可能是慢阻肺大鼠模型中骨骼肌萎縮的機制之一。
泛素-蛋白酶體系統和自噬-溶酶體系統長期以來一直被認作是完全獨立的系統，然而越來越多的證據顯示兩者是功能相關的分解代謝過程：最初發現單泛素化可作為胞吞關鍵信號，隨后又有一系列證據顯示泛素可作為選擇性自噬的特異信號[34-35]，這兩條降解系統分享某些調節分子和底物，表現為協同作用，在某些背景下又顯示補償功能。在接下來的實驗中，我們將著重探討泛素-蛋白酶體系統和自噬-溶酶體系統之間的相互關系，為慢阻肺患者骨骼肌萎縮的治療提供新的理論依據。
