引用本文： 熊萍, 黃炎明, 左萬里, 張春來, 周偉. 辛伐他汀對慢性阻塞性肺疾病大鼠基質金屬蛋白酶及炎癥因子表達的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(6): 541-545. doi: 10.7507/1671-6205.2015133 復制
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一種可預防可治療的疾病，以進行性不完全可逆的氣流受限、氣道炎癥、系統性損害或合并癥為特征，其特征性的氣流受限與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關[1]。這種炎癥對糖皮質激素總體變反應性不佳，因此目前缺乏抑制慢阻肺氣道炎癥的藥物。雖然已有大量研究試圖去尋找可以提高慢阻肺患者生存率的治療方法，但至今只有氧療和戒煙可以提高慢阻肺患者的生存率。近年來大量研究發現，他汀類藥物在許多炎癥性疾病中表現出一定的治療作用。本研究采用香煙煙霧暴露法制備慢阻肺大鼠模型，利用辛伐他汀干預，探討其對慢阻肺大鼠基質金屬蛋白酶(MMP)及炎癥因子表達的影響，以了解其對慢阻肺肺部炎癥的抑制作用。
材料與方法
一 材料
雄性SPF級Wistar大鼠40只，體重(220.0±7.8) g；隨機均分為4組：正常對照組(A組)、辛伐他汀組(B組)、慢阻肺模型組(C組)及辛伐他汀干預組(D組)。動物提供及飼養均為中山大學動物實驗中心(動物合格證號：SCXK(粵)2011-0029)。參考文獻[2]中自制大鼠實驗性吸煙裝置，將C組與D組大鼠置于100 cm×57 cm×60 cm的有機玻璃箱內，將點燃的香煙接于煙嘴上，用60 mL 注射器連續抽吸煙霧并通過三通注入箱內，12支/次，抽吸完后等待30 min，2次/d，兩次煙熏時間間隔4 h以上。從第1 d開始B組與D組煙熏前給予辛伐他汀(5 mg/kg)灌胃1次，其他兩組用等體積的生理鹽水灌胃，共16周。本研究經醫院動物倫理委員會許可。
二 方法
1.大鼠肺功能測定：實驗第16周末造模結束后于廣州醫科大學呼吸疾病研究所對大鼠進行肺功能測定。將大鼠置于無創小動物肺功能測定儀中(美國BUXCO公司)，采用RC Invasive氣道阻力和肺順應性檢測系統測定大鼠氣道阻力變化。
2.標本采集：給予1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔內注射麻醉大鼠后，開胸腹，結扎大鼠左支氣管，取左肺，用冷生理鹽水洗凈血，吸干水分，置細胞裂解液中制成肺組織勻漿，10 000 r/min低溫離心10 min，吸取上清液置-70 ℃冰箱保存待測。大鼠右支氣管在持續25 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa) 壓力下注入4％的多聚甲醛溶液至右肺膨脹，邊緣變銳，胸膜展平。結扎右支氣管取右肺浸入4％多聚甲醛溶液中固定24 h以上，待HE染色，光鏡下觀察。
3.指標測定：肺組織勻漿中MMP-2、MMP-9、白細胞介素6(IL-6)、IL-8及腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量均采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定。上述ELISA檢測試劑盒均購自上海藍基生物科技有限公司，測量數據由微機處理。
三 統計學處理
應用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，計量資料用
結果
一 實驗前、后大鼠的一般情況
利用香煙煙熏造模的C組和辛伐他汀藥物干預的D組大鼠逐漸出現體重增長減慢、神情倦怠、活動減少、毛發失去光澤、脫落增多等情況。后期C組大鼠陸續出現打噴嚏及呼吸頻率快的癥狀，活動后加劇，持續至實驗結束。D組大鼠的上述癥狀無C組明顯，未見有打噴嚏癥狀。A組和B組大鼠飲食正常，反應靈敏，毛發光潔，體重穩定增長。實驗開始時各組大鼠體重差異無統計學意義(P>0.05)。 實驗終止時，A組和B組大鼠的體重無明顯差異，C組和D組大鼠較A組和B組大鼠體重減輕，但C組較D組大鼠體重減輕更明顯(P<0.05)。結果見表 1。
二 氣道內阻力變化
C組和D組的氣道內阻力較A組和B組明顯增高(P<0.01)。D組的氣道內阻力雖有增高，但與C組比較明顯減低(P<0.01)。結果見表 1。
表1
各組大鼠體重及氣道內阻力比較(n=10，三 大鼠肺組織病理切片觀察
C組大鼠氣道內黏膜上皮脫落、糜爛，纖毛倒伏，氣管黏膜下層及肌層可見大量炎癥細胞浸潤，局部有淋巴小結形成，黏膜杯狀細胞增生明顯，肌層平滑肌增殖紊亂。D組大鼠氣道有不同程度的上述病理改變，但較C組明顯減輕。此外，C組可見肺泡壁變薄、斷裂，肺泡融合，肺氣腫明顯，肺泡腔內可見分泌物，肺泡間隔增厚，可見炎癥細胞浸潤，肺泡周圍毛細血管擴張充血。 D組肺泡病理改變較C組減輕。A組及B組大鼠未見上述改變。結果見圖 1和圖 2。
圖1
各組大鼠氣道組織病理檢查像(HE ×200) a.A組；b.B組；c.C組；d.D組
圖2
各組大鼠肺組織病理檢查像(HE ×100) a.A組；b.B組；c.C組；d.D組
四 肺組織勻漿中MMP-2和MMP-9含量比較
C組肺組織勻漿中MMP-2和MMP-9的含量較A組、B組及D組均明顯增高(P<0.01)。D組中MMP-9的含量較A組和B組增加(P<0.01)，但較C組明顯減低(P<0.01)。A組、B組和D組中MMP-2的含量差異無統計學意義(P>0.05)。A組與B組中MMP-9的含量差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表 2。
表2
各組大鼠肺組織勻漿中MMP-2及MMP-9的含量比較 (n=10，ng/mL，五 肺組織勻漿中IL-6、IL-8及TNF-α含量比較
C組肺組織勻漿中IL-6、IL-8及TNF-α較A組、 B組和D組均明顯增高(P<0.01)。D組中IL-8的含量較A組和B組增加(P<0.01)，但較C組明顯減低(P<0.01)。A組、B組和D組中IL-6及TNF-α 的含量差異無統計學意義(P>0.05)。A組與B組中IL-8的含量差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表 3。
表3
各組大鼠肺組織勻漿中IL-6、IL-8及TNF-α含量比較(n=10，pg/mL，討論
慢阻肺是一種以氣流受限、肺實質和全身性炎癥為主要特征的疾病，吸煙是慢阻肺的主要危險因素之一[1]。本研究采用香煙煙霧暴露的方法建立慢阻肺大鼠模型，肺組織病理示大鼠支氣管黏膜部分上皮脫落、糜爛，纖毛倒伏，杯狀細胞增生，黏膜下層及肌層大量炎癥細胞浸潤，肺泡結構破壞，大小不一，肺泡壁變薄斷裂，肺泡相互融合，肺泡間隔可見大量炎癥細胞浸潤，周圍毛細血管擴張、充血。以上改變符合慢阻肺的病理特征，提示經過16周單純香煙煙霧暴露可造模成功。
慢阻肺被認為是炎癥反應失調，主要表現為氣道及肺部炎癥以及系統性多器官的損害。大量細胞因子和趨化因子及其他介質參與慢阻肺的炎癥機制[3]。吸煙是慢阻肺的重要危險因素，可導致支氣管上皮細胞、肺泡巨噬細胞及其他炎癥細胞活化，釋放大量趨化因子和細胞因子，包括TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8等。這些炎癥因子在慢阻肺的炎癥反應過程中有至關重要的作用。在穩定期慢阻肺患者痰液中可見IL-6、IL-8及TNF-α升高，急性加重期則明顯增加[4]。本實驗提示在C組和D組中均可見到肺組織勻漿中IL-6、IL-8及TNF-α較A組及B組明顯增高，尤其是IL-8水平，這與Keatings等[4]和Kuschner等[5]的研究結果相一致，證明吸煙可導致肺內炎癥因子的釋放增加。進一步分析可以看出，C組中上述各炎癥指標均較D升高更明顯，表明辛伐他汀可減少吸煙引起的上述炎癥因子的釋放。結合病理切片結果，C組病理切片可見小氣道及肺間質大量炎癥細胞浸潤，而D組比C組明顯減輕，且D組氣道內阻力升高程度顯著低于C組，據此推斷辛伐他汀可通過減少肺內炎癥因子的釋放來進一步減輕肺實質及氣道炎癥，降低氣道內阻力。
MMP作為蛋白水解酶的一種，可降解細胞外基質，在慢阻肺的發病機制中有重要作用，過多活化的MMP除了可導致肺部炎癥外，還可以直接導致慢阻肺肺實質的破壞[6-7]。MMP可降解多種肺實質結構組分，包括Ⅰ型膠原纖維，肺泡壁中的Ⅲ型膠原蛋白、基底膜中的Ⅳ型膠原蛋白以及其他的細胞外基質蛋白。這些都有理由讓我們相信在慢阻肺發病機制的蛋白酶-抗蛋白酶失衡學說中，至少應包括MMP類。大量研究表明在慢阻肺、肺氣腫患者中，尤其是在α1抗胰蛋白酶缺乏的患者中，血清MMP-9 明顯升高[8-9]，而且慢阻肺患者戒煙MMP-9仍然高于基礎水平[10]。Navratilova等[11]研究亦發現MMP-2 和MMP-9在慢阻肺患者痰液中明顯增高，且MMP-9與疾病的進展及嚴重程度有關。因此理論上減少基質蛋白酶的產生可能會延緩慢阻肺的進程。在本實驗中可發現C組和D組大鼠肺組織勻漿中的MMP-2 和MMP-9的含量較A組和B組明顯升高，其中MMP-9升高更明顯，這些均提示MMP-9在慢阻肺的發病過程中有一定影響。進一步分析可發現，D組中MMP-2及MMP-9的含量較C組明顯減低，且D組大鼠肺氣腫程度和氣道內阻力亦較C組明顯減輕，提示辛伐他汀可減輕肺內MMP的釋放，從而減輕肺氣腫程度及氣道內阻力。
辛伐他汀為羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，除有降脂作用外，還具有潛在的多效性，包括抗炎、抗氧化、抗血栓和改善血管內皮功能等。他汀類藥物主要通過抑制甲羥戊酸途徑來阻止Rho活化，從而減少類異戊二烯化產物的合成，最終可以減少大量前炎癥細胞因子的產生，如TNF-α、IL-1β、IL-6和γ干擾素[12]。 此外，他汀還可以減少MMP的產生，尤其是MMP-1、MMP-2及MMP-9[13]。本實驗結果亦表明，辛伐他汀可減輕肺部炎癥介質的釋放和減少MMP的產生，減輕氣道炎癥及肺氣腫程度，阻止氣道內阻力的進一步升高。
綜上所述，他汀類藥物有可能通過其抗炎作用來減輕慢阻肺患者氣道阻力的升高，延緩病情進展，但這仍需進一步研究證實。
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一種可預防可治療的疾病，以進行性不完全可逆的氣流受限、氣道炎癥、系統性損害或合并癥為特征，其特征性的氣流受限與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關[1]。這種炎癥對糖皮質激素總體變反應性不佳，因此目前缺乏抑制慢阻肺氣道炎癥的藥物。雖然已有大量研究試圖去尋找可以提高慢阻肺患者生存率的治療方法，但至今只有氧療和戒煙可以提高慢阻肺患者的生存率。近年來大量研究發現，他汀類藥物在許多炎癥性疾病中表現出一定的治療作用。本研究采用香煙煙霧暴露法制備慢阻肺大鼠模型，利用辛伐他汀干預，探討其對慢阻肺大鼠基質金屬蛋白酶(MMP)及炎癥因子表達的影響，以了解其對慢阻肺肺部炎癥的抑制作用。
材料與方法
一 材料
雄性SPF級Wistar大鼠40只，體重(220.0±7.8) g；隨機均分為4組：正常對照組(A組)、辛伐他汀組(B組)、慢阻肺模型組(C組)及辛伐他汀干預組(D組)。動物提供及飼養均為中山大學動物實驗中心(動物合格證號：SCXK(粵)2011-0029)。參考文獻[2]中自制大鼠實驗性吸煙裝置，將C組與D組大鼠置于100 cm×57 cm×60 cm的有機玻璃箱內，將點燃的香煙接于煙嘴上，用60 mL 注射器連續抽吸煙霧并通過三通注入箱內，12支/次，抽吸完后等待30 min，2次/d，兩次煙熏時間間隔4 h以上。從第1 d開始B組與D組煙熏前給予辛伐他汀(5 mg/kg)灌胃1次，其他兩組用等體積的生理鹽水灌胃，共16周。本研究經醫院動物倫理委員會許可。
二 方法
1.大鼠肺功能測定：實驗第16周末造模結束后于廣州醫科大學呼吸疾病研究所對大鼠進行肺功能測定。將大鼠置于無創小動物肺功能測定儀中(美國BUXCO公司)，采用RC Invasive氣道阻力和肺順應性檢測系統測定大鼠氣道阻力變化。
2.標本采集：給予1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔內注射麻醉大鼠后，開胸腹，結扎大鼠左支氣管，取左肺，用冷生理鹽水洗凈血，吸干水分，置細胞裂解液中制成肺組織勻漿，10 000 r/min低溫離心10 min，吸取上清液置-70 ℃冰箱保存待測。大鼠右支氣管在持續25 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa) 壓力下注入4％的多聚甲醛溶液至右肺膨脹，邊緣變銳，胸膜展平。結扎右支氣管取右肺浸入4％多聚甲醛溶液中固定24 h以上，待HE染色，光鏡下觀察。
3.指標測定：肺組織勻漿中MMP-2、MMP-9、白細胞介素6(IL-6)、IL-8及腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量均采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定。上述ELISA檢測試劑盒均購自上海藍基生物科技有限公司，測量數據由微機處理。
三 統計學處理
應用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，計量資料用
結果
一 實驗前、后大鼠的一般情況
利用香煙煙熏造模的C組和辛伐他汀藥物干預的D組大鼠逐漸出現體重增長減慢、神情倦怠、活動減少、毛發失去光澤、脫落增多等情況。后期C組大鼠陸續出現打噴嚏及呼吸頻率快的癥狀，活動后加劇，持續至實驗結束。D組大鼠的上述癥狀無C組明顯，未見有打噴嚏癥狀。A組和B組大鼠飲食正常，反應靈敏，毛發光潔，體重穩定增長。實驗開始時各組大鼠體重差異無統計學意義(P>0.05)。 實驗終止時，A組和B組大鼠的體重無明顯差異，C組和D組大鼠較A組和B組大鼠體重減輕，但C組較D組大鼠體重減輕更明顯(P<0.05)。結果見表 1。
二 氣道內阻力變化
C組和D組的氣道內阻力較A組和B組明顯增高(P<0.01)。D組的氣道內阻力雖有增高，但與C組比較明顯減低(P<0.01)。結果見表 1。
表1
各組大鼠體重及氣道內阻力比較(n=10，三 大鼠肺組織病理切片觀察
C組大鼠氣道內黏膜上皮脫落、糜爛，纖毛倒伏，氣管黏膜下層及肌層可見大量炎癥細胞浸潤，局部有淋巴小結形成，黏膜杯狀細胞增生明顯，肌層平滑肌增殖紊亂。D組大鼠氣道有不同程度的上述病理改變，但較C組明顯減輕。此外，C組可見肺泡壁變薄、斷裂，肺泡融合，肺氣腫明顯，肺泡腔內可見分泌物，肺泡間隔增厚，可見炎癥細胞浸潤，肺泡周圍毛細血管擴張充血。 D組肺泡病理改變較C組減輕。A組及B組大鼠未見上述改變。結果見圖 1和圖 2。
圖1
各組大鼠氣道組織病理檢查像(HE ×200) a.A組；b.B組；c.C組；d.D組
圖2
各組大鼠肺組織病理檢查像(HE ×100) a.A組；b.B組；c.C組；d.D組
四 肺組織勻漿中MMP-2和MMP-9含量比較
C組肺組織勻漿中MMP-2和MMP-9的含量較A組、B組及D組均明顯增高(P<0.01)。D組中MMP-9的含量較A組和B組增加(P<0.01)，但較C組明顯減低(P<0.01)。A組、B組和D組中MMP-2的含量差異無統計學意義(P>0.05)。A組與B組中MMP-9的含量差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表 2。
表2
各組大鼠肺組織勻漿中MMP-2及MMP-9的含量比較 (n=10，ng/mL，五 肺組織勻漿中IL-6、IL-8及TNF-α含量比較
C組肺組織勻漿中IL-6、IL-8及TNF-α較A組、 B組和D組均明顯增高(P<0.01)。D組中IL-8的含量較A組和B組增加(P<0.01)，但較C組明顯減低(P<0.01)。A組、B組和D組中IL-6及TNF-α 的含量差異無統計學意義(P>0.05)。A組與B組中IL-8的含量差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表 3。
表3
各組大鼠肺組織勻漿中IL-6、IL-8及TNF-α含量比較(n=10，pg/mL，討論
慢阻肺是一種以氣流受限、肺實質和全身性炎癥為主要特征的疾病，吸煙是慢阻肺的主要危險因素之一[1]。本研究采用香煙煙霧暴露的方法建立慢阻肺大鼠模型，肺組織病理示大鼠支氣管黏膜部分上皮脫落、糜爛，纖毛倒伏，杯狀細胞增生，黏膜下層及肌層大量炎癥細胞浸潤，肺泡結構破壞，大小不一，肺泡壁變薄斷裂，肺泡相互融合，肺泡間隔可見大量炎癥細胞浸潤，周圍毛細血管擴張、充血。以上改變符合慢阻肺的病理特征，提示經過16周單純香煙煙霧暴露可造模成功。
慢阻肺被認為是炎癥反應失調，主要表現為氣道及肺部炎癥以及系統性多器官的損害。大量細胞因子和趨化因子及其他介質參與慢阻肺的炎癥機制[3]。吸煙是慢阻肺的重要危險因素，可導致支氣管上皮細胞、肺泡巨噬細胞及其他炎癥細胞活化，釋放大量趨化因子和細胞因子，包括TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8等。這些炎癥因子在慢阻肺的炎癥反應過程中有至關重要的作用。在穩定期慢阻肺患者痰液中可見IL-6、IL-8及TNF-α升高，急性加重期則明顯增加[4]。本實驗提示在C組和D組中均可見到肺組織勻漿中IL-6、IL-8及TNF-α較A組及B組明顯增高，尤其是IL-8水平，這與Keatings等[4]和Kuschner等[5]的研究結果相一致，證明吸煙可導致肺內炎癥因子的釋放增加。進一步分析可以看出，C組中上述各炎癥指標均較D升高更明顯，表明辛伐他汀可減少吸煙引起的上述炎癥因子的釋放。結合病理切片結果，C組病理切片可見小氣道及肺間質大量炎癥細胞浸潤，而D組比C組明顯減輕，且D組氣道內阻力升高程度顯著低于C組，據此推斷辛伐他汀可通過減少肺內炎癥因子的釋放來進一步減輕肺實質及氣道炎癥，降低氣道內阻力。
MMP作為蛋白水解酶的一種，可降解細胞外基質，在慢阻肺的發病機制中有重要作用，過多活化的MMP除了可導致肺部炎癥外，還可以直接導致慢阻肺肺實質的破壞[6-7]。MMP可降解多種肺實質結構組分，包括Ⅰ型膠原纖維，肺泡壁中的Ⅲ型膠原蛋白、基底膜中的Ⅳ型膠原蛋白以及其他的細胞外基質蛋白。這些都有理由讓我們相信在慢阻肺發病機制的蛋白酶-抗蛋白酶失衡學說中，至少應包括MMP類。大量研究表明在慢阻肺、肺氣腫患者中，尤其是在α1抗胰蛋白酶缺乏的患者中，血清MMP-9 明顯升高[8-9]，而且慢阻肺患者戒煙MMP-9仍然高于基礎水平[10]。Navratilova等[11]研究亦發現MMP-2 和MMP-9在慢阻肺患者痰液中明顯增高，且MMP-9與疾病的進展及嚴重程度有關。因此理論上減少基質蛋白酶的產生可能會延緩慢阻肺的進程。在本實驗中可發現C組和D組大鼠肺組織勻漿中的MMP-2 和MMP-9的含量較A組和B組明顯升高，其中MMP-9升高更明顯，這些均提示MMP-9在慢阻肺的發病過程中有一定影響。進一步分析可發現，D組中MMP-2及MMP-9的含量較C組明顯減低，且D組大鼠肺氣腫程度和氣道內阻力亦較C組明顯減輕，提示辛伐他汀可減輕肺內MMP的釋放，從而減輕肺氣腫程度及氣道內阻力。
辛伐他汀為羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，除有降脂作用外，還具有潛在的多效性，包括抗炎、抗氧化、抗血栓和改善血管內皮功能等。他汀類藥物主要通過抑制甲羥戊酸途徑來阻止Rho活化，從而減少類異戊二烯化產物的合成，最終可以減少大量前炎癥細胞因子的產生，如TNF-α、IL-1β、IL-6和γ干擾素[12]。 此外，他汀還可以減少MMP的產生，尤其是MMP-1、MMP-2及MMP-9[13]。本實驗結果亦表明，辛伐他汀可減輕肺部炎癥介質的釋放和減少MMP的產生，減輕氣道炎癥及肺氣腫程度，阻止氣道內阻力的進一步升高。
綜上所述，他汀類藥物有可能通過其抗炎作用來減輕慢阻肺患者氣道阻力的升高，延緩病情進展，但這仍需進一步研究證實。
