引用本文： 楊永超, 楊東鵬, 楊博, 林曦, 董文鵬, 王曉武. 野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠心肺組織變化研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(4): 380-384. doi: 10.7507/1671-6205.2015094 復制
肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種發病率不高但極具破壞性的疾病，其特點是肺血管中膜進行性增厚和內膜纖維化，導致肺小動脈和微小阻力血管閉塞，最終形成血管叢狀增生改變，肺動脈內皮細胞程序性凋亡和功能障礙，在PAH早期發病機制中起重要作用[1]。目前除肺移植外尚沒有對PAH真正行之有效的治療手段。美國和英國大規模登記調查顯示，PAH患者的5年生存率僅在20%~57%之間[2-3]。野百合堿(monocrotaline，MCT)是一種從豆科植物豬屎豆種子中提取出的雙芐基異喹啉類生物堿，機體攝入MCT后會引起一種類似PAH的綜合表現[4]，因而被廣泛用于PAH造模。盡管應用廣泛，但目前國內外對MCT模型病理指標的觀察研究不夠系統全面。本實驗旨在通過對MCT誘導的PAH大鼠模型病理改變及相關指標進行觀察測量，觀察分析模型產生的病理機制，為科研選擇造模方式提供參考。
材料與方法
一 材料
由廣東醫學實驗動物中心提供SPF級健康雄性SD大鼠24只，體重(250±20)g，日齡60~80 d，動物合格證號No.44007200007336；飼養于廣州軍區廣州總醫院實驗動物中心SPF級實驗動物中心。16通道生理信號記錄分析系統(MP100，美國BIOPAC公司)；電子分析天平(AE-100，瑞士Mettler公司)；MCT(37024，美國Sigma公司)；正置熒光顯微鏡(BX51，日本OLYMPUS公司)；透射電子顯微鏡(H-7650，日本HITACHI公司)。
二 方法
1. 實驗分組及模型建立：大鼠分籠飼養(5~6只/籠)，常規飼料喂養，室溫22~24℃，相對濕度60%左右，早8點至晚8點自動照明。動物購置后適應性飼養1周。所有實驗動物稱重，隨機分為實驗組和對照組。實驗組予MCT溶液(無水乙醇與生理鹽水按1∶4混合溶解)60 mg/kg腹腔注射[4]，對照組給予無水乙醇與生理鹽水1∶4混合溶液等體積腹腔注射，正常飼養21 d。
2. 檢測指標：21 d后大鼠稱重，水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，胸前小切口開胸測量平均肺動脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)；放血處死大鼠，滅菌生理鹽水沖洗大鼠肺組織，切取右肺第2葉，放入4%多聚甲醛溶液中保存24 h，制作石蠟切塊用于HE染色和Masson染色，觀察肺組織中小動脈病理變化。切取左肺門組織6塊，每塊大小1 mm×1 mm×1 mm，放入3%戊二醛溶液保存，電子顯微鏡觀察肺中小動脈超微結構變化。切取大鼠完整心臟，完整分離右心室(right ventricle，RV)、左心室和室間隔(left ventricle and interventricular septum，LV+S)，電子分析天平分別稱重，計算右心室肥厚指數RV/(LV+S)。光鏡(×200)下觀察HE染色、Masson染色切片，應用Image-pro圖像分析系統，選擇直徑100~200μm的肺中小動脈，測量其外徑(external diameter，ED)、內徑(internal diameter，ID)、中膜厚度(media thickness of pulmonary arterioles，PAMT，PAWT=2×medial wall thickness/external diameter)，計算其中膜面積(wall area，WA)、血管總面積(total area，TA)、血管腔面積(lumen area，LA)、膜厚度與動脈外徑比值[WT%，WT%=2×PAMT/ED×100%]、中膜面積與血管總面積比值[WA%，WA%=(TA－LA)/TA×100%]作為肺血管重建的指標。每只大鼠各測量10根血管，并求其均值。計數肺中小動脈中膜平滑肌細胞核密度(smooth muscle cell nuclei density，SMC，以100μm×100μm大小范圍內細胞核數目表示)。測量心肌細胞直徑(cardiomyocyte diameter，CD)，計數心肌細胞核密度(myocardial nuclear density，MND，每100μm×100μm大小范圍內細胞核數)，作為右心室重塑的指標。
三 統計學處理
全部數據經SPSS 19.0統計軟件進行分析，實驗數據以
結果
一 大鼠一般狀態和大體病理
對照組大鼠從實驗開始至3周后終止未出現明顯異常改變，體重正常增長，全程無死亡。實驗組大鼠MCT腹腔注射1周內未出現明顯特征性改變。第2周開始逐漸出現活動減少，蜷臥閉眼，反應遲鈍，呼吸急促，進食進水明顯下降，毛發變黃，干枯雜亂，鼻部、唇周、趾端等處出現發紺，鼻周分泌物明顯增多，皮下脂肪明顯減少，體重下降。其中2只大鼠出現腹部膨隆，觸之有明顯波動感，并分別于第18 d和第20 d死亡，考慮為重度PAH導致右心衰竭所致。2只死亡大鼠解剖開胸后見明顯胸腔積液，心臟增大明顯，右心室游離壁明顯增厚，右心室腔擴大，腹腔大量積液，均約10 mL左右。后期解剖時見對照組大鼠肺組織表面光滑，粉紅色，富有彈性，心臟解剖未見異常。實驗組大鼠肺表面大量瘀斑瘀點，變硬，顏色紫暗，短軸橫切心臟可見右心室游離壁明顯增厚，右心室腔擴大。實驗開始前兩組體重無統計學差異，實驗結束后實驗組較對照組體重明顯下降(P＜0.01)，結果見表 1。
表1
兩組體重比較(n=12，g，二 心肺組織鏡下改變
1. 心肌組織HE染色比較：與對照組比較，實驗組大鼠心肌細胞排列明顯紊亂，心肌細胞間隙變窄，心肌細胞肥大。結果見圖 1。
圖1
心肌病理組織像(HE×100)?a. 對照組；b. 實驗組?圖 2 ?肺病理組織像示肺中小動脈(HE×200)?a. 對照組；b. 實驗組
2. 肺組織HE染色、MASSON染色比較：與對照組比較，實驗組大鼠肺組織中小動脈血管壁明顯增厚，管腔明顯狹窄甚至堵塞，肺泡結構明顯萎縮變形，間質中大量炎癥細胞浸潤；肺組織膠原纖維大量增生，血管周圍處增生更加明顯。結果見圖 2和圖 3。
圖3
肺病理組織像示肺中小動脈(Masson×200)?a. 對照組；b. 實驗組?圖 4?肺小動脈血管內皮細胞電子顯微鏡像(×30 000)?a. 對照組；b. 實驗組
3. 肺血管內皮細胞電鏡觀察：正常對照組大鼠肺動脈內皮細胞單層扁平排列，核緣光滑，染色質較少，細胞器數量正常。與對照組比較，實驗組大鼠肺動脈內皮細胞數量增多，形態腫脹并向管腔內突出，細胞核形態不規則，胞漿內空泡增多，細胞器明顯增多；彈力纖維增生且排列雜亂；間質內大量炎癥細胞浸潤。結果見圖 4。
4. 測量指標比較：與對照組比較，實驗組大鼠mPAP和RV/(LV+S)顯著升高(P＜0.01)，心肺組織檢測并計算的指標SMC、PAMT、WT%、WA%、AD、MND差異均有統計學意義(P＜0.05)。結果見表 2和表 3。
表2
兩組mPAP、RV/(LV+S)、AD和MND比較(
表3
兩組SMC、PAMT、WT%和WA%比較(討論
PAH造模方式有多種，主要分為單因素病理損傷模型、多因素病理損傷模型、基因敲除模型、基因過表達模型四大類，其中單因素病理損傷模型因作用機制明確、模型生成穩定、操作簡便且價格相對便宜而應用最廣，尤其MCT模型和慢性缺氧模型[5]。任何單因素模型不能完全復制復雜的臨床疾病[6]，因此應運而生出現多因素病理損傷模型。多因素病理損傷模型是兩種或兩種以上單因素病理損傷的疊加，如MCT+左肺切除等[7]，更加接近臨床PAH患者的發病情況，但因需要處理和涉及的變量較多，發病機制較為復雜，不便于操作以及后期對模型治療效果進行分析研究，故應用偏少。基因敲除模型，如敲除大鼠內皮素受體B基因等，同樣可誘發PAH形成，模型穩定性高、可重復性好，但實際操作中技術要求高且操作難度大，實驗費用昂貴，限制了其在科研中的應用。基因過表達模型，如血管生成素1等基因的過表達，其造模效果目前尚存在爭議[5]。
MCT在大鼠肝臟內經P450單氧化酶轉化后，可形成具有生物活性的脫氫產物MCT吡咯，后者在血流通過肺臟時，可沉積于肺小動脈壁及肺毛細血管，選擇性地引起肺動脈血管內皮細胞不可逆性損傷，誘導肺動脈血管壁重建并引起PAH[8]。從本實驗結果來看，MCT能夠顯著升高大鼠肺動脈壓力，引起右心室肥大，其中肺部血管重塑較為明顯，內皮細胞破壞甚至出現叢狀增生，結構完整性遭到破壞，亞細胞結構可見細胞核形態不規則改變，細胞質基質增多，細胞器數量增加形態改變，如內質網擴張、高爾基體增生和空泡增多等；內皮細胞連續性遭到破壞后引起平滑肌細胞暴露，受到各種刺激因素作用而出現大量增生，引起血管管腔明顯狹窄，增加肺血管阻力；纖維結構染色可見血管壁及其周圍纖維組織大量增生，排列雜亂，間質內炎癥細胞大量增生，引起血管過度收縮而加重PAH。心肌肥厚明顯，心肌細胞大量增生，細胞直徑增加，細胞間隙變窄，引起右心室重塑。因此，我們認為MCT可成功誘導形成穩定的PAH、右心室肥厚模型，其成因可能與大鼠肺血管內皮細胞叢狀增生、平滑肌細胞增生、膠原纖維大量增生引起血管腔嚴重狹窄甚至閉塞，心肌細胞代償性肥大、增生等變化有關。
對PAH的研究已經持續了百余年，但尚未能完全明確其發病機制。傳統對PAH發病的分子生物學機制的研究包括低氧誘導因子1、5-羥色胺、彈性蛋白酶活性、超氧化物歧化酶、鈣離子和鉀離子通道等，主要集中在個別信號分子及相關信號通路的研究。近幾年來隨著基因技術的快速發展，人們正在努力在基因水平上重新定義PAH。對細胞信號傳導、細胞轉化、細胞與細胞間相互作用、miRNA的加工、線粒體和離子通道的功能改變等機制的深入研究，極大幫助我們認識了PAH發病機制中基因水平的改變，深入解釋了血管細胞異常反應所帶來的損傷作用[9]。亞裔人口中最常見的骨形態發生蛋白型受體Ⅱ基因(BMPR2)突變已被確認可導致遺傳性肺動脈高壓(HPAH)[10]。而有可能引起PAH的基因突變還有SMAD、TBX4和TSP1等[11-13]。全基因組關聯研究(GWAS)提出了CBLN2軌跡與PAH的發生相關聯[14]。轉化生長因子β1和BMPR2信號之間的不平衡可能會刺激炎癥細胞因子的表達和白細胞外滲，引起肺血管重塑[15]。因此，深入研究PAH基因水平的發病機制，并同傳統信號分子研究相結合將是未來治療和研究PAH的重要方向。
肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種發病率不高但極具破壞性的疾病，其特點是肺血管中膜進行性增厚和內膜纖維化，導致肺小動脈和微小阻力血管閉塞，最終形成血管叢狀增生改變，肺動脈內皮細胞程序性凋亡和功能障礙，在PAH早期發病機制中起重要作用[1]。目前除肺移植外尚沒有對PAH真正行之有效的治療手段。美國和英國大規模登記調查顯示，PAH患者的5年生存率僅在20%~57%之間[2-3]。野百合堿(monocrotaline，MCT)是一種從豆科植物豬屎豆種子中提取出的雙芐基異喹啉類生物堿，機體攝入MCT后會引起一種類似PAH的綜合表現[4]，因而被廣泛用于PAH造模。盡管應用廣泛，但目前國內外對MCT模型病理指標的觀察研究不夠系統全面。本實驗旨在通過對MCT誘導的PAH大鼠模型病理改變及相關指標進行觀察測量，觀察分析模型產生的病理機制，為科研選擇造模方式提供參考。
材料與方法
一 材料
由廣東醫學實驗動物中心提供SPF級健康雄性SD大鼠24只，體重(250±20)g，日齡60~80 d，動物合格證號No.44007200007336；飼養于廣州軍區廣州總醫院實驗動物中心SPF級實驗動物中心。16通道生理信號記錄分析系統(MP100，美國BIOPAC公司)；電子分析天平(AE-100，瑞士Mettler公司)；MCT(37024，美國Sigma公司)；正置熒光顯微鏡(BX51，日本OLYMPUS公司)；透射電子顯微鏡(H-7650，日本HITACHI公司)。
二 方法
1. 實驗分組及模型建立：大鼠分籠飼養(5~6只/籠)，常規飼料喂養，室溫22~24℃，相對濕度60%左右，早8點至晚8點自動照明。動物購置后適應性飼養1周。所有實驗動物稱重，隨機分為實驗組和對照組。實驗組予MCT溶液(無水乙醇與生理鹽水按1∶4混合溶解)60 mg/kg腹腔注射[4]，對照組給予無水乙醇與生理鹽水1∶4混合溶液等體積腹腔注射，正常飼養21 d。
2. 檢測指標：21 d后大鼠稱重，水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，胸前小切口開胸測量平均肺動脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)；放血處死大鼠，滅菌生理鹽水沖洗大鼠肺組織，切取右肺第2葉，放入4%多聚甲醛溶液中保存24 h，制作石蠟切塊用于HE染色和Masson染色，觀察肺組織中小動脈病理變化。切取左肺門組織6塊，每塊大小1 mm×1 mm×1 mm，放入3%戊二醛溶液保存，電子顯微鏡觀察肺中小動脈超微結構變化。切取大鼠完整心臟，完整分離右心室(right ventricle，RV)、左心室和室間隔(left ventricle and interventricular septum，LV+S)，電子分析天平分別稱重，計算右心室肥厚指數RV/(LV+S)。光鏡(×200)下觀察HE染色、Masson染色切片，應用Image-pro圖像分析系統，選擇直徑100~200μm的肺中小動脈，測量其外徑(external diameter，ED)、內徑(internal diameter，ID)、中膜厚度(media thickness of pulmonary arterioles，PAMT，PAWT=2×medial wall thickness/external diameter)，計算其中膜面積(wall area，WA)、血管總面積(total area，TA)、血管腔面積(lumen area，LA)、膜厚度與動脈外徑比值[WT%，WT%=2×PAMT/ED×100%]、中膜面積與血管總面積比值[WA%，WA%=(TA－LA)/TA×100%]作為肺血管重建的指標。每只大鼠各測量10根血管，并求其均值。計數肺中小動脈中膜平滑肌細胞核密度(smooth muscle cell nuclei density，SMC，以100μm×100μm大小范圍內細胞核數目表示)。測量心肌細胞直徑(cardiomyocyte diameter，CD)，計數心肌細胞核密度(myocardial nuclear density，MND，每100μm×100μm大小范圍內細胞核數)，作為右心室重塑的指標。
三 統計學處理
全部數據經SPSS 19.0統計軟件進行分析，實驗數據以
結果
一 大鼠一般狀態和大體病理
對照組大鼠從實驗開始至3周后終止未出現明顯異常改變，體重正常增長，全程無死亡。實驗組大鼠MCT腹腔注射1周內未出現明顯特征性改變。第2周開始逐漸出現活動減少，蜷臥閉眼，反應遲鈍，呼吸急促，進食進水明顯下降，毛發變黃，干枯雜亂，鼻部、唇周、趾端等處出現發紺，鼻周分泌物明顯增多，皮下脂肪明顯減少，體重下降。其中2只大鼠出現腹部膨隆，觸之有明顯波動感，并分別于第18 d和第20 d死亡，考慮為重度PAH導致右心衰竭所致。2只死亡大鼠解剖開胸后見明顯胸腔積液，心臟增大明顯，右心室游離壁明顯增厚，右心室腔擴大，腹腔大量積液，均約10 mL左右。后期解剖時見對照組大鼠肺組織表面光滑，粉紅色，富有彈性，心臟解剖未見異常。實驗組大鼠肺表面大量瘀斑瘀點，變硬，顏色紫暗，短軸橫切心臟可見右心室游離壁明顯增厚，右心室腔擴大。實驗開始前兩組體重無統計學差異，實驗結束后實驗組較對照組體重明顯下降(P＜0.01)，結果見表 1。
表1
兩組體重比較(n=12，g，二 心肺組織鏡下改變
1. 心肌組織HE染色比較：與對照組比較，實驗組大鼠心肌細胞排列明顯紊亂，心肌細胞間隙變窄，心肌細胞肥大。結果見圖 1。
圖1
心肌病理組織像(HE×100)?a. 對照組；b. 實驗組?圖 2 ?肺病理組織像示肺中小動脈(HE×200)?a. 對照組；b. 實驗組
2. 肺組織HE染色、MASSON染色比較：與對照組比較，實驗組大鼠肺組織中小動脈血管壁明顯增厚，管腔明顯狹窄甚至堵塞，肺泡結構明顯萎縮變形，間質中大量炎癥細胞浸潤；肺組織膠原纖維大量增生，血管周圍處增生更加明顯。結果見圖 2和圖 3。
圖3
肺病理組織像示肺中小動脈(Masson×200)?a. 對照組；b. 實驗組?圖 4?肺小動脈血管內皮細胞電子顯微鏡像(×30 000)?a. 對照組；b. 實驗組
3. 肺血管內皮細胞電鏡觀察：正常對照組大鼠肺動脈內皮細胞單層扁平排列，核緣光滑，染色質較少，細胞器數量正常。與對照組比較，實驗組大鼠肺動脈內皮細胞數量增多，形態腫脹并向管腔內突出，細胞核形態不規則，胞漿內空泡增多，細胞器明顯增多；彈力纖維增生且排列雜亂；間質內大量炎癥細胞浸潤。結果見圖 4。
4. 測量指標比較：與對照組比較，實驗組大鼠mPAP和RV/(LV+S)顯著升高(P＜0.01)，心肺組織檢測并計算的指標SMC、PAMT、WT%、WA%、AD、MND差異均有統計學意義(P＜0.05)。結果見表 2和表 3。
表2
兩組mPAP、RV/(LV+S)、AD和MND比較(
表3
兩組SMC、PAMT、WT%和WA%比較(討論
PAH造模方式有多種，主要分為單因素病理損傷模型、多因素病理損傷模型、基因敲除模型、基因過表達模型四大類，其中單因素病理損傷模型因作用機制明確、模型生成穩定、操作簡便且價格相對便宜而應用最廣，尤其MCT模型和慢性缺氧模型[5]。任何單因素模型不能完全復制復雜的臨床疾病[6]，因此應運而生出現多因素病理損傷模型。多因素病理損傷模型是兩種或兩種以上單因素病理損傷的疊加，如MCT+左肺切除等[7]，更加接近臨床PAH患者的發病情況，但因需要處理和涉及的變量較多，發病機制較為復雜，不便于操作以及后期對模型治療效果進行分析研究，故應用偏少。基因敲除模型，如敲除大鼠內皮素受體B基因等，同樣可誘發PAH形成，模型穩定性高、可重復性好，但實際操作中技術要求高且操作難度大，實驗費用昂貴，限制了其在科研中的應用。基因過表達模型，如血管生成素1等基因的過表達，其造模效果目前尚存在爭議[5]。
MCT在大鼠肝臟內經P450單氧化酶轉化后，可形成具有生物活性的脫氫產物MCT吡咯，后者在血流通過肺臟時，可沉積于肺小動脈壁及肺毛細血管，選擇性地引起肺動脈血管內皮細胞不可逆性損傷，誘導肺動脈血管壁重建并引起PAH[8]。從本實驗結果來看，MCT能夠顯著升高大鼠肺動脈壓力，引起右心室肥大，其中肺部血管重塑較為明顯，內皮細胞破壞甚至出現叢狀增生，結構完整性遭到破壞，亞細胞結構可見細胞核形態不規則改變，細胞質基質增多，細胞器數量增加形態改變，如內質網擴張、高爾基體增生和空泡增多等；內皮細胞連續性遭到破壞后引起平滑肌細胞暴露，受到各種刺激因素作用而出現大量增生，引起血管管腔明顯狹窄，增加肺血管阻力；纖維結構染色可見血管壁及其周圍纖維組織大量增生，排列雜亂，間質內炎癥細胞大量增生，引起血管過度收縮而加重PAH。心肌肥厚明顯，心肌細胞大量增生，細胞直徑增加，細胞間隙變窄，引起右心室重塑。因此，我們認為MCT可成功誘導形成穩定的PAH、右心室肥厚模型，其成因可能與大鼠肺血管內皮細胞叢狀增生、平滑肌細胞增生、膠原纖維大量增生引起血管腔嚴重狹窄甚至閉塞，心肌細胞代償性肥大、增生等變化有關。
對PAH的研究已經持續了百余年，但尚未能完全明確其發病機制。傳統對PAH發病的分子生物學機制的研究包括低氧誘導因子1、5-羥色胺、彈性蛋白酶活性、超氧化物歧化酶、鈣離子和鉀離子通道等，主要集中在個別信號分子及相關信號通路的研究。近幾年來隨著基因技術的快速發展，人們正在努力在基因水平上重新定義PAH。對細胞信號傳導、細胞轉化、細胞與細胞間相互作用、miRNA的加工、線粒體和離子通道的功能改變等機制的深入研究，極大幫助我們認識了PAH發病機制中基因水平的改變，深入解釋了血管細胞異常反應所帶來的損傷作用[9]。亞裔人口中最常見的骨形態發生蛋白型受體Ⅱ基因(BMPR2)突變已被確認可導致遺傳性肺動脈高壓(HPAH)[10]。而有可能引起PAH的基因突變還有SMAD、TBX4和TSP1等[11-13]。全基因組關聯研究(GWAS)提出了CBLN2軌跡與PAH的發生相關聯[14]。轉化生長因子β1和BMPR2信號之間的不平衡可能會刺激炎癥細胞因子的表達和白細胞外滲，引起肺血管重塑[15]。因此，深入研究PAH基因水平的發病機制，并同傳統信號分子研究相結合將是未來治療和研究PAH的重要方向。
