引用本文： 張衍民, 賈曉民, 趙杰, 李海泉, 馬雷, 徐俊馬, 杭文璐. 氨溴索對胃內容物吸入性肺損傷中c-Jun氨基末端激酶信號通路的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(4): 368-371. doi: 10.7507/1671-6205.2015091 復制
急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發病及肺保護機制一直是重癥呼吸病學關注的主要方面[1-3]。引起ALI/ARDS的病因是多種多樣的，而胃內容物吸入作為化學性因素之一，在國外的報道中占發病原因的首位。呼吸專科醫師面臨著胃腸反流疾病、肥胖高腹壓、醉酒狀態及各種腦血管疾病發生后并發誤吸、反流等引起的肺損傷問題。因此，積極探索胃內容物吸入性肺損傷發病及其保護機制有著重要的臨床意義。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)作為絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路之一，在細胞外信號轉導至細胞核的過程中起到重要作用，參與內毒素誘發的肺損傷細胞生物學炎癥反應[4]。研究發現氨溴索具有化痰、抗炎、抗氧化及促進肺表面活性物質合成等作用，在氣管黏膜損傷甚至ALI/ARDS中具有保護作用[5-6]，我們之前的研究也發現氨溴索在胃內容物吸入性肺損傷中具有抗炎保護作用[7-8]。本實驗建立大鼠胃內容物吸入性肺損傷動物模型，進一步研究氨溴索對JNK信號通路蛋白表達的影響。
材料與方法
一 材料
健康清潔級雄性SD大鼠，體重250~300 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供。氨溴索購于德國勃林格殷格翰公司；丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒由南京建成生化試劑公司提供；JNK、磷酸化JNK(p-JNK)及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抗體、JNK抑制劑SP600125為Promega公司產品。
二 方法
1. 大鼠胃內容物吸入性肺損傷模型的建立及分組：SD大鼠40只，按隨機數字表法分為4組，每組10只。(1)?對照組：實驗動物僅進行氣管插管，氣道內予等量生理鹽水滴入。(2)?損傷組：采用Krishnan等[9]的方法建立動物模型，使用3%戊巴比妥鈉50 mg/kg體重腹腔注射麻醉動物，予14G靜脈導管行氣管插管術，通過氣管插管向氣道內滴入胃內容物(劑量為1.2 mL/kg)。胃內容物制備：取正常飼養大鼠予生理鹽水灌胃，灌洗物通過薄紗濾過，成分包含40 mg/mL胃食物微粒，將其pH值調定為1.25。損傷發生后24 h處死大鼠并取材。(3)?SP600125組：術前給予尾靜脈注射JNK特異性抑制劑SP600125(3 mg/100 g)，其余步驟同損傷組。(4)?氨溴索組：損傷發生后2 h尾靜脈注射氨溴索(50 mg/kg)，其余步驟同損傷組。
2. 取材及制備標本：開胸取出肺組織，取右上葉肺用于病理學檢查；取右中葉肺稱重；剩余右肺制成肺組織勻漿液[每100 mg肺組織加入0.9 mL PBS(pH7.4)，在冰浴下用組織勻漿器制成10%肺組織勻漿]。肺組織勻漿液分別于4℃、3 000 r/min離心15 min，取上清于－80℃凍存。左肺予4℃生理鹽水灌洗，灌洗回收率＞85%。左肺組織充分漂洗后置液氮中保存供蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測。
3. 檢測指標與方法
(1)?支氣管肺泡灌洗液(BALF)相關指標：BALF行中性粒細胞計數，按照試劑盒說明進行MDA活性檢測，并于最大吸收峰532 nm處測定吸光度。
(2)?肺組織相關指標：肺濕/干重比值(W/D)測定：取右中葉肺組織稱重后置于烤箱中，70℃烘烤至恒重后稱干重，計算肺W/D。采用四甲基聯苯胺法測定肺組織MPO活性，以每克組織中MPO活性單位(U/g)表示。采用Western blot檢測肺組織JNK、p-JNK、iNOS蛋白表達：自液氮中取出標本，迅速置于冰勻漿緩沖液中冰浴，用Teflon勻漿器高速勻漿(10 s×6次)，800 r/min，離心10 min，取上清為細胞蛋白提取液，按改良Lowry法測定其蛋白濃度；牛血清清蛋白為標準品，取相同蛋白量(100μg)的樣品經10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，以半干電轉移法轉至硝酸纖維素膜上，電轉條件2.5 mA/cm2，電轉時間50 min；轉移完畢，加入封閉液，室溫封閉1 h；封閉后，加入用封閉液稀釋的一抗4℃孵育過夜；使用清洗緩沖液[10 mmol/L Tris(pH7.4)，0.1 mol/L NaCl，0.05%Tween-20]洗膜3次，加入熒光二抗(兔抗鼠IgG-AP)室溫搖床上孵育2 h；清洗緩沖液洗膜后顯色，結果使用Image軟件半定量分析。
(3)?病理學觀察：取右上葉肺組織用10%甲醛固定，經石蠟包埋切片，HE染色后，光鏡下觀察病理學變化。
三 統計學處理
應用SPSS 13.0軟件包進行處理，計量資料以
結果
一 大鼠BALF中性粒細胞計數、MDA活性、W/D、MPO活性
與對照組比較，損傷組BALF中性粒細胞計數、MDA活性、肺組織W/D及MPO活性顯著增加(均P＜0.05)；與損傷組比較，SP600125組和氨溴索組BALF中性粒細胞計數與MDA活性、肺組織W/D及MPO活性下降，差異有統計學意義(均P＜0.05)。結果見表 1。
表1
大鼠BALF中性粒細胞計數、MDA活性、肺組織W/D、MPO活性比較(n=10, 二 大鼠肺組織JNK、p-JNK、iNOS蛋白表達
Western blot結果顯示各組大鼠肺組織JNK蛋白表達差異無統計學意義(P＞0.05)；與對照組比較，損傷組中p-JNK與iNOS蛋白表達均顯著增高(均P＜0.05)；與損傷組比較，SP600125組和氨溴索組中p-JNK與iNOS蛋白表達均顯著下降(均P＜0.05)。結果見圖 1~3和表 2。
圖1
JNK蛋白表達電泳圖
圖2
p-JNK蛋白表達電泳圖
圖3
iNOS蛋白表達電泳圖
表2
大鼠肺組織JNK/β-actin和p-JNK/β-actin及iNOS/β-actin蛋白表達灰度比值(n=10, 三 病理學改變
對照組肺組織無明顯病理學改變，肺泡間隔正常，未見明顯滲出，偶見少量炎性細胞。損傷組肺組織病理學改變明顯，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔內可見滲出，可見炎性細胞及肺泡內出血表現。SP600125組與氨溴索組肺組織損傷較損傷組減輕，肺泡間隔有增厚但不如損傷組明顯，肺泡內滲出減少，炎性細胞及肺泡內出血減少。結果見圖 4。
圖4
大鼠肺組織病理像(HE×100)?a. 對照組；b. 損傷組；c. SP600125組；d. 氨溴索組
討論
氧化應激與炎癥反應在胃內容物吸入性肺損傷的發生發展中發揮重要作用。急性損傷發生后中性粒細胞的“呼吸爆發”可產生大量活性氧自由基，多種炎癥細胞因子、炎性介質、氧化應激因子的表達增多，同時機體抗氧化機制出現障礙，均會造成肺組織氧化/抗氧化系統嚴重破壞[10]。MDA是由氧自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸而形成的脂質過氧化物；肺組織W/D的變化可較好地反映肺間質及肺泡血管通透性改變的程度；肺組織中的MPO活性在一定程度上反映了中性粒細胞在肺內的聚集程度。在本實驗中與對照組比較發現，損傷組中BALF中性粒細胞計數、MDA活性、肺組織W/D及MPO活性均明顯增加，說明胃內容物吸入后肺組織發生了明顯的脂質過氧化等炎癥反應。
研究發現JNK作為絲裂原活化蛋白激酶的主要成員之一，可參與炎癥信號轉導[11]。iNOS是細胞信號轉導的下游啟動炎癥反應的關鍵酶，iNOS在組織中大量表達會造成NO與ONOO－增多，作為強氧化劑損傷肺組織[12]。本實驗條件下各組大鼠肺組織JNK蛋白表達差異無統計學意義，而損傷發生=后p-JNK表達增多；與損傷組比較發現，應用JNK特異性抑制劑干預后p-JNK表達減少，同時BALF中性粒細胞計數與MDA活性、肺組織W/D以及MPO活性均下降；光鏡下組織病理學較損傷組減輕；Western blot顯示SP600125組iNOS蛋白表達下降。上述結果提示JNK參與了胃內容物吸入后肺損傷炎癥反應，其生物學活性是在其磷酸化狀態下實現的，抑制p-JNK表達在一定程度上可抑制胃內容物吸入后肺損傷炎癥反應，抑制p-JNK表達可減少iNOS蛋白表達。
氨溴索已不單純作為化痰藥物在臨床上應用，研究發現大劑量氨溴索應用于ALI/ARDS治療主要依賴于其抗氧化及抗炎作用[13]。本實驗條件下，與損傷組比較，氨溴索組BALF中性粒細胞計數、MDA活性、肺組織W/D及MPO活性下降，肺組織病理學損傷減輕，p-JNK與iNOS蛋白表達均顯著下降。上述結果提示氨溴索在胃內容物吸入性肺損傷中具有抗炎性細胞聚集以及抗脂質過氧化作用，氨溴索可抑制p-JNK及iNOS蛋白表達。
綜上所述，本實驗研究結果顯示在大鼠胃內容物吸入性肺損傷動物模型中，氨溴索可能通過抑制JNK信號通路減輕氧化應激反應發揮保護作用。至于氨溴索抑制JNK活化的確切分子機制，還有待于進一步研究。
急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發病及肺保護機制一直是重癥呼吸病學關注的主要方面[1-3]。引起ALI/ARDS的病因是多種多樣的，而胃內容物吸入作為化學性因素之一，在國外的報道中占發病原因的首位。呼吸專科醫師面臨著胃腸反流疾病、肥胖高腹壓、醉酒狀態及各種腦血管疾病發生后并發誤吸、反流等引起的肺損傷問題。因此，積極探索胃內容物吸入性肺損傷發病及其保護機制有著重要的臨床意義。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)作為絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路之一，在細胞外信號轉導至細胞核的過程中起到重要作用，參與內毒素誘發的肺損傷細胞生物學炎癥反應[4]。研究發現氨溴索具有化痰、抗炎、抗氧化及促進肺表面活性物質合成等作用，在氣管黏膜損傷甚至ALI/ARDS中具有保護作用[5-6]，我們之前的研究也發現氨溴索在胃內容物吸入性肺損傷中具有抗炎保護作用[7-8]。本實驗建立大鼠胃內容物吸入性肺損傷動物模型，進一步研究氨溴索對JNK信號通路蛋白表達的影響。
材料與方法
一 材料
健康清潔級雄性SD大鼠，體重250~300 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供。氨溴索購于德國勃林格殷格翰公司；丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒由南京建成生化試劑公司提供；JNK、磷酸化JNK(p-JNK)及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抗體、JNK抑制劑SP600125為Promega公司產品。
二 方法
1. 大鼠胃內容物吸入性肺損傷模型的建立及分組：SD大鼠40只，按隨機數字表法分為4組，每組10只。(1)?對照組：實驗動物僅進行氣管插管，氣道內予等量生理鹽水滴入。(2)?損傷組：采用Krishnan等[9]的方法建立動物模型，使用3%戊巴比妥鈉50 mg/kg體重腹腔注射麻醉動物，予14G靜脈導管行氣管插管術，通過氣管插管向氣道內滴入胃內容物(劑量為1.2 mL/kg)。胃內容物制備：取正常飼養大鼠予生理鹽水灌胃，灌洗物通過薄紗濾過，成分包含40 mg/mL胃食物微粒，將其pH值調定為1.25。損傷發生后24 h處死大鼠并取材。(3)?SP600125組：術前給予尾靜脈注射JNK特異性抑制劑SP600125(3 mg/100 g)，其余步驟同損傷組。(4)?氨溴索組：損傷發生后2 h尾靜脈注射氨溴索(50 mg/kg)，其余步驟同損傷組。
2. 取材及制備標本：開胸取出肺組織，取右上葉肺用于病理學檢查；取右中葉肺稱重；剩余右肺制成肺組織勻漿液[每100 mg肺組織加入0.9 mL PBS(pH7.4)，在冰浴下用組織勻漿器制成10%肺組織勻漿]。肺組織勻漿液分別于4℃、3 000 r/min離心15 min，取上清于－80℃凍存。左肺予4℃生理鹽水灌洗，灌洗回收率＞85%。左肺組織充分漂洗后置液氮中保存供蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測。
3. 檢測指標與方法
(1)?支氣管肺泡灌洗液(BALF)相關指標：BALF行中性粒細胞計數，按照試劑盒說明進行MDA活性檢測，并于最大吸收峰532 nm處測定吸光度。
(2)?肺組織相關指標：肺濕/干重比值(W/D)測定：取右中葉肺組織稱重后置于烤箱中，70℃烘烤至恒重后稱干重，計算肺W/D。采用四甲基聯苯胺法測定肺組織MPO活性，以每克組織中MPO活性單位(U/g)表示。采用Western blot檢測肺組織JNK、p-JNK、iNOS蛋白表達：自液氮中取出標本，迅速置于冰勻漿緩沖液中冰浴，用Teflon勻漿器高速勻漿(10 s×6次)，800 r/min，離心10 min，取上清為細胞蛋白提取液，按改良Lowry法測定其蛋白濃度；牛血清清蛋白為標準品，取相同蛋白量(100μg)的樣品經10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，以半干電轉移法轉至硝酸纖維素膜上，電轉條件2.5 mA/cm2，電轉時間50 min；轉移完畢，加入封閉液，室溫封閉1 h；封閉后，加入用封閉液稀釋的一抗4℃孵育過夜；使用清洗緩沖液[10 mmol/L Tris(pH7.4)，0.1 mol/L NaCl，0.05%Tween-20]洗膜3次，加入熒光二抗(兔抗鼠IgG-AP)室溫搖床上孵育2 h；清洗緩沖液洗膜后顯色，結果使用Image軟件半定量分析。
(3)?病理學觀察：取右上葉肺組織用10%甲醛固定，經石蠟包埋切片，HE染色后，光鏡下觀察病理學變化。
三 統計學處理
應用SPSS 13.0軟件包進行處理，計量資料以
結果
一 大鼠BALF中性粒細胞計數、MDA活性、W/D、MPO活性
與對照組比較，損傷組BALF中性粒細胞計數、MDA活性、肺組織W/D及MPO活性顯著增加(均P＜0.05)；與損傷組比較，SP600125組和氨溴索組BALF中性粒細胞計數與MDA活性、肺組織W/D及MPO活性下降，差異有統計學意義(均P＜0.05)。結果見表 1。
表1
大鼠BALF中性粒細胞計數、MDA活性、肺組織W/D、MPO活性比較(n=10, 二 大鼠肺組織JNK、p-JNK、iNOS蛋白表達
Western blot結果顯示各組大鼠肺組織JNK蛋白表達差異無統計學意義(P＞0.05)；與對照組比較，損傷組中p-JNK與iNOS蛋白表達均顯著增高(均P＜0.05)；與損傷組比較，SP600125組和氨溴索組中p-JNK與iNOS蛋白表達均顯著下降(均P＜0.05)。結果見圖 1~3和表 2。
圖1
JNK蛋白表達電泳圖
圖2
p-JNK蛋白表達電泳圖
圖3
iNOS蛋白表達電泳圖
表2
大鼠肺組織JNK/β-actin和p-JNK/β-actin及iNOS/β-actin蛋白表達灰度比值(n=10, 三 病理學改變
對照組肺組織無明顯病理學改變，肺泡間隔正常，未見明顯滲出，偶見少量炎性細胞。損傷組肺組織病理學改變明顯，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔內可見滲出，可見炎性細胞及肺泡內出血表現。SP600125組與氨溴索組肺組織損傷較損傷組減輕，肺泡間隔有增厚但不如損傷組明顯，肺泡內滲出減少，炎性細胞及肺泡內出血減少。結果見圖 4。
圖4
大鼠肺組織病理像(HE×100)?a. 對照組；b. 損傷組；c. SP600125組；d. 氨溴索組
討論
氧化應激與炎癥反應在胃內容物吸入性肺損傷的發生發展中發揮重要作用。急性損傷發生后中性粒細胞的“呼吸爆發”可產生大量活性氧自由基，多種炎癥細胞因子、炎性介質、氧化應激因子的表達增多，同時機體抗氧化機制出現障礙，均會造成肺組織氧化/抗氧化系統嚴重破壞[10]。MDA是由氧自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸而形成的脂質過氧化物；肺組織W/D的變化可較好地反映肺間質及肺泡血管通透性改變的程度；肺組織中的MPO活性在一定程度上反映了中性粒細胞在肺內的聚集程度。在本實驗中與對照組比較發現，損傷組中BALF中性粒細胞計數、MDA活性、肺組織W/D及MPO活性均明顯增加，說明胃內容物吸入后肺組織發生了明顯的脂質過氧化等炎癥反應。
研究發現JNK作為絲裂原活化蛋白激酶的主要成員之一，可參與炎癥信號轉導[11]。iNOS是細胞信號轉導的下游啟動炎癥反應的關鍵酶，iNOS在組織中大量表達會造成NO與ONOO－增多，作為強氧化劑損傷肺組織[12]。本實驗條件下各組大鼠肺組織JNK蛋白表達差異無統計學意義，而損傷發生=后p-JNK表達增多；與損傷組比較發現，應用JNK特異性抑制劑干預后p-JNK表達減少，同時BALF中性粒細胞計數與MDA活性、肺組織W/D以及MPO活性均下降；光鏡下組織病理學較損傷組減輕；Western blot顯示SP600125組iNOS蛋白表達下降。上述結果提示JNK參與了胃內容物吸入后肺損傷炎癥反應，其生物學活性是在其磷酸化狀態下實現的，抑制p-JNK表達在一定程度上可抑制胃內容物吸入后肺損傷炎癥反應，抑制p-JNK表達可減少iNOS蛋白表達。
氨溴索已不單純作為化痰藥物在臨床上應用，研究發現大劑量氨溴索應用于ALI/ARDS治療主要依賴于其抗氧化及抗炎作用[13]。本實驗條件下，與損傷組比較，氨溴索組BALF中性粒細胞計數、MDA活性、肺組織W/D及MPO活性下降，肺組織病理學損傷減輕，p-JNK與iNOS蛋白表達均顯著下降。上述結果提示氨溴索在胃內容物吸入性肺損傷中具有抗炎性細胞聚集以及抗脂質過氧化作用，氨溴索可抑制p-JNK及iNOS蛋白表達。
綜上所述，本實驗研究結果顯示在大鼠胃內容物吸入性肺損傷動物模型中，氨溴索可能通過抑制JNK信號通路減輕氧化應激反應發揮保護作用。至于氨溴索抑制JNK活化的確切分子機制，還有待于進一步研究。
