引用本文： 周吉, 肖軍. 抑制樁蛋白磷酸化對機械通氣所致肺損傷的效應. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(4): 362-367. doi: 10.7507/1671-6205.2015090 復制
目前，機械通氣已經廣泛應用于危重病人的救治，但隨著呼吸機應用頻繁，機械通氣相關性肺損傷(ventilation induced lung injury，VILI)發生率也在逐年提高[1]，因此研究VILI的發病機制和防治有著重要的臨床意義。來自機械通氣的過度機械應力和周期性機械拉伸會增加血管通透性以及發生危及生命的腦水腫和肺水腫的風險[2]。機械通氣引起的肺部牽拉增加了血管通透性，激活了炎癥因子的釋放，啟動了細胞凋亡程序。這些過程在生物體內主要表現為肺泡出血，炎癥細胞浸潤，血氧不足，且常常合并高發病率和高死亡率的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)[3]。肺內皮細胞在循環血液和組織液之間形成一層半通透膜，它受到循環中生物活性分子、血液動力學因素、肺在呼吸周期中膨脹的動態調節[4]。實驗研究表明細胞間裂隙的形成受到來自肌動球蛋白細胞骨架產生的兩種平衡的相反作用力的調節[5-6]。肌動球蛋白細胞骨架主要通過黏著斑和黏著連接來調節細胞的向心拉力、細胞和細胞間的附著、細胞和基質之間的連接、黏著斑和黏著連接共同調節細胞的形態改變和內皮細胞通透性。黏著斑是由一種稱為整聯蛋白-胞內蛋白復合物[包括樁蛋白(Paxillin)、踝蛋白、斑聯蛋白、黏著斑蛋白(FA)、Src激酶家族、黏著斑激酶(FAK)以及其他一些蛋白]的基質黏著受體聯合形成。Paxillin是一種多結構域FA蛋白，它包含了在N端部分的4個LD域以及C端部分的4個LIM域，它的主要功能是作為分子腳手架。雖然Paxillin分子本身可能不具有酶活性，但因為其分子中含有多種結構域能夠與一系列的信號蛋白和結構蛋白結合，決定了Paxillin可以作為一種“碼頭”或“支架”將來自上游的信號整合而高效地向下游傳遞。通過FAK或者Src家族非酪氨酸激酶受體介導的Paxillin的Tyr31和Tyr118的磷酸化為各種蛋白的連接創造了結合位點[7]。本實驗主要討究抑制Paxillin在Tyr31和Tyr118位點的磷酸化后機械通氣所致肺損傷以及對下游相關信號鏈的影響，從而為VILI的防治提供新的理論機制和治療策略。
材料與方法
一 材料
SPF級雄性SD大鼠60只，體重220~250 g，由桂林醫學院實驗動物中心提供。酪氨酸蛋白激酶抑制劑購自MedChem Express公司，Paxillin抗體和Paxillin(phospho-Y118)抗體均購自Bioworld。髓過氧化物酶(MPO)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。腫瘤壞死因子α(TNF-α)的ELISA測定試劑盒購自上海博古生物科技有限公司。TUNEL原位凋亡試劑盒購自Roche公司。
二 方法
1. 動物分組及模型制備：60只雄性SD大鼠隨機分成正常對照組、保護性通氣組、大潮氣量通氣組、PP2抑制劑組共4個實驗組，每組15只。實驗前禁食12 h，自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 g/kg)麻醉大鼠，麻醉起效后行氣管插管。正常對照組只進行氣管切開插管，自然吸氣；保護性通氣組進行保護性通氣2 h；大潮氣量通氣組進行大潮氣量通氣2 h；PP2抑制劑組分別為酪氨酸蛋白激酶抑制劑(PP2，5 mg/kg)+大潮氣量機械通氣2 h，PP2在機械通氣前1 h腹腔注射。保護性通氣呼吸機設置：潮氣量6 mL/kg，頻率60次/min，吸呼比1/2，呼氣末正壓5 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)；大潮氣量通氣呼吸機設置：潮氣量40 mL/kg，頻率40次/min，吸呼比1/2，呼氣末正壓0 cm H2O。每組中各取5只大鼠用于伊文思藍(EB)檢測肺血管通透性。酪氨酸蛋白激酶抑制劑PP2溶解于0.3 mL二甲基亞砜(DMSO)中。正常對照組、保護性通氣組和大潮氣量通氣組試驗前1 h腹腔注射0.3 mL不含抑制劑的DMSO溶液。
2. 標本采集：機械通氣至預定時間點后于頸動脈放血處死大鼠。打開胸腔，結扎右側肺門，氣管切開，插入0.2 cm硅膠管，以4℃生理鹽水2 mL反復灌洗左肺2次，記錄每次灌洗液回收量后離心(3 000 r/min)10 min，取上凊－70℃保存備用。右肺上葉組織固定于10%多聚甲醛溶液用于病理切片和原位凋亡實驗。右肺中葉用于檢測肺濕/干重比值(W/D)。其余肺組織液氮冷凍用于蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測。
3. 檢測指標及方法
(1)?肺組織病理學觀察以及肺W/D測定：取右肺上葉組織固定于10%多聚甲醛溶液中，HE染色后光鏡下觀察組織切片。取右肺中葉稱濕重后，60℃恒溫箱烤72 h至肺干重恒定，稱干重，計算W/D。
(2)?彌漫性肺泡損傷(diffused alveolar damage，DAD)評分[8]：由病理科醫師按雙盲法根據肺間質內中性粒細胞浸潤、肺泡內出血、肺泡內纖維素滲出、肺間質水腫、肺泡內中性粒細胞浸潤等5個方面，按照正常、輕、中、重分別評為0、1、2、3分，DAD評分為各項指標之和。
(3)?EB法測定肺血管通透性：機械通氣后頸外靜脈注射1% EB 2 mg/kg，1 h后頸動脈放血處死大鼠，完整取出全肺，吸干表面水分及血液，稱量濕重后剪下右肺中葉置于干試管中，按1 mL/100 mg濕肺組織加入甲酰胺。試管置于50℃恒溫水浴24 h，浸出液用752型分光光度計(波長620 nm)上定量。左肺稱重后剪碎，50℃干烤72 h至恒重，稱量干重。以每克肺組織干重含有的EB質量表示。
(4)?TUNEL原位細胞凋亡檢測：取右肺上葉組織固定于10%多聚甲醛中，石蠟包埋，組織切片，脫蠟水化處理，用TUNEL反應混合物孵育(60 min，37℃)，洗脫樣本熒光顯微鏡分析。
(5)?Western blot檢測肺組織中磷酸化樁蛋白(p-Paxillin)和Paxillin的表達：每組取100 mg肺組織，提取蛋白BCA法定量。各組取50μg蛋白樣本加入上樣緩沖液后開水煮沸8 min，SDS-PAGE電泳，采用半干法轉膜(恒流100 mA，60 min)，PVDF膜放入5%脫脂牛奶中常溫封閉1 h，孵育一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，室溫孵育二抗1 h后，TBST洗膜，發光、顯影后拍照并進行圖像分析。
(6)?酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測TNF-α：ELISA法檢測各組大鼠肺泡灌洗液中的TNF-α的水平。
(7)?肺組織MPO活性測定：取等質量－80℃凍存的肺組織，在冰浴中制作成10%的肺組織勻漿。組織勻漿后照試劑盒說明測定肺組織中的MPO活性。
三 統計學處理
采用SPSS 18.0統計軟件做數據分析，實驗數據以
結果
一 大鼠肺組織病理觀察、DAD評分、EB滲出量、W/D、肺泡灌洗液中TNF-α濃度以及肺組織MPO活性
正常對照組與保護性通氣組比較，DAD評分、EB滲出量、W/D、MPO及TNF-α差異均無統計學意義(P＞0.05)。大潮氣量通氣組與PP2抑制劑組比較，以上指標差異均有統計學意義(P＜0.05)。肺組織病理觀察發現，正常對照組肺組織正常，沒有組織學損傷改變；保護性通氣組肺泡結構比較完整，有少量炎細胞浸潤，肺泡間隔無水腫，肺泡腔無明顯滲出物；大潮氣量通氣組肺泡間隔增厚，肺泡腔內彌漫浸潤炎性細胞，肺泡腔大量滲出物，部分肺泡萎陷或破裂；PP2抑制劑組肺損傷明顯減輕，肺泡結構完整，少量炎細胞浸潤，肺泡腔有少量滲出物。結果見表 1和圖 1。
表1
各組大鼠肺DAD評分、EB滲出量、W/D、MPO及TNF-α濃度比較(n=15，
圖1
光鏡下各組大鼠肺組織病理組織像(HE×200)?a. 正常對照組；b. 保護性通氣組；c. 大潮氣量通氣組；d. PP2抑制劑組
二 TUNEL原位細胞凋亡檢測
正常對照組與保護性通氣組比較，肺組織原位細胞凋亡率差異無統計學意義[(8.21±2.24)%比(9.36±3.31)%，P＞0.05]。大潮氣量通氣組與PP2抑制劑組比較，凋亡率差異有統計學意義[(63.01±5.21)%比(25.12±4.37)%，P＜0.05]。各組凋亡率從高到低排序為：大潮氣量通氣組＞PP2抑制劑組＞保護性通氣組＞正常對照組。結果見圖 2。
圖2
各組TUNEL原位細胞凋亡檢測像?a. 正常對照組；b. 保護性通氣組；c. 大潮氣量通氣組；d. PP2抑制劑組
三 Western blot檢測p-Paxillin和Paxillin表達
大潮氣量通氣組與PP2抑制劑組比較，p-Paxillin的表達量明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.05)，Paxillin的表達量差異無統計學意義(P＞0.05)。保護性通氣組與正常對照組比較，p-Paxillin和Paxillin表達量均較高，差異有統計學意義(P＜0.05)。正常對照組與保護性通氣組、大潮氣量通氣組、PP2抑制劑組比較，p-Paxillin和Paxillin表達量差異均有統計學意義(P＜0.05)。保護性通氣組、大潮氣量通氣組和PP2抑制劑組間Paxillin的表達量差異無統計學意義(P＞0.05)。結果見圖 3和表 2。
圖3
各組p-Paxillin和Paxillin表達電泳圖
1：正常對照組；2：保護性通氣組；3：大潮氣量通氣組；4：PP2抑制劑組
表2
各組p-Paxillin和Paxillin相對表達量(n=15，討論
近年來隨著機械通氣的廣泛應用，VILI發生率也逐年提高，關于VILI的研究也日趨深入。最近研究表明，在過度機械應力下出現的細胞及組織損傷是肺生物學一個比較新的、過去被忽略的領域，也是肺損傷發生及發展的主要原因之一[9]。機械應力損傷可造成早期組織間隙水腫，內皮細胞細胞膜水泡以及連接細胞之間的基底膜缺失，長時間的損傷造成細胞內及細胞間裂隙的形成以及廣泛細胞破壞后基底膜的裸露[10]。因此，研究內皮細胞屏障受損以及細胞間裂隙的形成機制非常重要。
Paxillin最早是在V-SRC轉染的細胞中發現的，后在平滑肌組織中得到了它的純化蛋白，并確定它是黏著斑蛋白的結合蛋白。Paxillin通過FAK或Src激酶介導的Tyr31和Tyr118位點的磷酸化產生了SH2結合結構域，是一種調節蛋白質相互作用的重要方式。FA特定的蛋白間相互作用和特定的磷酸化位點與內皮細胞在受到機械應力和化學刺激時屏障保護和屏障破壞反應有關[11-12]。
本實驗中我們使用SD大鼠復制機械通氣肺損傷模型，使用Src酪氨酸蛋白激酶抑制劑PP2活體注射來研究Paxillin的Tyr118和Tyr31磷酸化在機械通氣肺損傷過程中的作用。結果發現大潮氣量通氣組的大鼠肺部病理切片表現出明顯的炎癥損傷改變，原位細胞凋亡檢測、W/D、TNF-α濃度和MPO活性等指標均顯示VILI模型復制成功，而小潮氣量高PEEP的保護性通氣組和PP2抑制劑組的大鼠肺損傷程度較大潮氣量通氣組明顯減輕。由此可見，抑制劑PP2對減輕大鼠呼吸機肺損傷作用明顯。Western blot結果顯示，在機械通氣后Paxillin的表達量在保護性通氣組、大潮氣量通氣組和PP2抑制劑組中基本相同；而p-Paxillin在大潮氣量通氣組中顯著增高，在正常對照組和保護性通氣中組p-Paxillin表達量較低，PP2抑制劑組中p-Paxillin表達量很低。以上結果說明PP2對Paxillin Tyr31和Tyr118位點磷酸化產生了明顯的抑制效應。綜合以上實驗數據，我們認為抑制Paxillin磷酸化可明顯降低肺毛細血管通透性，減少肺損傷，同時能夠抑制炎癥因子、炎癥細胞的趨化，抑制細胞凋亡，機械通氣肺損傷明顯減輕。
FAK和Src都能調節Paxillin在Tyr31和Tyr118處的磷酸化，而我們使用了Src激酶抑制PP2來抑制Paxillin磷酸化，Paxillin無法產生SH2結合結構域，沒有該結構域提供特異性的結合位點，導致FA的特定的幾種蛋白間交互作用無法進行，進而細胞屏障破壞進程被終止，阻止了肺內皮細胞通透性降低。這些變化主要體現在大鼠在機械通氣時肺部的炎性改變明顯減輕。Petit等[13]在研究中也有類似的發現，膠原蛋白誘導的NBT-II細胞運動伴隨著Paxillin的酪氨酸磷酸化，如果把其分子中兩個最主要的酪氨酸Y31和Y118突變為苯丙氨酸并在細胞中過表達，則可以有效抑制細胞的遷徙。
生物機械力作用在血管內皮細胞上，刺激引起了一系列的信號級聯放大，由MAP激酶(p42/44 MAPK、JNK和p38)、非受體酪氨酸激酶(Src和FAK)、整聯蛋白信號、離子通道和Rho家族的GTPases，共同決定了內皮細胞的通透性[14-16]。周期牽拉誘導實驗中，Rho-GTPase信號通路的激活可以加劇內皮細胞細胞屏障的破環，而在體內和體外急性肺損傷模型中減弱Rho激酶的活性可以減少肺血管的滲出和促進屏障功能的恢復[11, 17]。結合本實驗研究結果，可以推測大潮氣量機械通氣激活了Src和FAK，使Paxillin Tyr31和Tyr118位點磷酸化，產生SH2結合結構域，其為p42/44 MAPK，JNK、p38、Paxillin之間發生交互作用提供一個反應平臺，形成某些特定的復合物，該復合物作為一種信號小體進一步激活下游RHO-GTPase信號通路，加劇細胞屏障破環，肺血管滲出加重，激活炎癥因子的釋放，啟動細胞凋亡程序，進而引發嚴重的呼吸機相關性肺損傷。
雖然我們的研究發現了抑制Paxillin磷酸化可以明顯改善機械通氣肺損傷，但Paxillin磷酸化后對下游MAP激酶、整聯蛋白等的確切影響以及它們之間相互作用方式仍尚待研究。總而言之，抑制Paxillin磷酸化能夠降低肺毛細血管通透性，減少炎性因子釋放，抑制細胞凋亡程序的啟動。Paxillin的Tyr118和Tyr31磷酸化位點在機械通氣肺損傷的病理損傷過程中發揮了重要的功能。對于Paxillin磷酸化后下游信號鏈的變化及對機械通氣肺損傷效應的確切機制仍需更深入的研究。
目前，機械通氣已經廣泛應用于危重病人的救治，但隨著呼吸機應用頻繁，機械通氣相關性肺損傷(ventilation induced lung injury，VILI)發生率也在逐年提高[1]，因此研究VILI的發病機制和防治有著重要的臨床意義。來自機械通氣的過度機械應力和周期性機械拉伸會增加血管通透性以及發生危及生命的腦水腫和肺水腫的風險[2]。機械通氣引起的肺部牽拉增加了血管通透性，激活了炎癥因子的釋放，啟動了細胞凋亡程序。這些過程在生物體內主要表現為肺泡出血，炎癥細胞浸潤，血氧不足，且常常合并高發病率和高死亡率的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)[3]。肺內皮細胞在循環血液和組織液之間形成一層半通透膜，它受到循環中生物活性分子、血液動力學因素、肺在呼吸周期中膨脹的動態調節[4]。實驗研究表明細胞間裂隙的形成受到來自肌動球蛋白細胞骨架產生的兩種平衡的相反作用力的調節[5-6]。肌動球蛋白細胞骨架主要通過黏著斑和黏著連接來調節細胞的向心拉力、細胞和細胞間的附著、細胞和基質之間的連接、黏著斑和黏著連接共同調節細胞的形態改變和內皮細胞通透性。黏著斑是由一種稱為整聯蛋白-胞內蛋白復合物[包括樁蛋白(Paxillin)、踝蛋白、斑聯蛋白、黏著斑蛋白(FA)、Src激酶家族、黏著斑激酶(FAK)以及其他一些蛋白]的基質黏著受體聯合形成。Paxillin是一種多結構域FA蛋白，它包含了在N端部分的4個LD域以及C端部分的4個LIM域，它的主要功能是作為分子腳手架。雖然Paxillin分子本身可能不具有酶活性，但因為其分子中含有多種結構域能夠與一系列的信號蛋白和結構蛋白結合，決定了Paxillin可以作為一種“碼頭”或“支架”將來自上游的信號整合而高效地向下游傳遞。通過FAK或者Src家族非酪氨酸激酶受體介導的Paxillin的Tyr31和Tyr118的磷酸化為各種蛋白的連接創造了結合位點[7]。本實驗主要討究抑制Paxillin在Tyr31和Tyr118位點的磷酸化后機械通氣所致肺損傷以及對下游相關信號鏈的影響，從而為VILI的防治提供新的理論機制和治療策略。
材料與方法
一 材料
SPF級雄性SD大鼠60只，體重220~250 g，由桂林醫學院實驗動物中心提供。酪氨酸蛋白激酶抑制劑購自MedChem Express公司，Paxillin抗體和Paxillin(phospho-Y118)抗體均購自Bioworld。髓過氧化物酶(MPO)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。腫瘤壞死因子α(TNF-α)的ELISA測定試劑盒購自上海博古生物科技有限公司。TUNEL原位凋亡試劑盒購自Roche公司。
二 方法
1. 動物分組及模型制備：60只雄性SD大鼠隨機分成正常對照組、保護性通氣組、大潮氣量通氣組、PP2抑制劑組共4個實驗組，每組15只。實驗前禁食12 h，自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 g/kg)麻醉大鼠，麻醉起效后行氣管插管。正常對照組只進行氣管切開插管，自然吸氣；保護性通氣組進行保護性通氣2 h；大潮氣量通氣組進行大潮氣量通氣2 h；PP2抑制劑組分別為酪氨酸蛋白激酶抑制劑(PP2，5 mg/kg)+大潮氣量機械通氣2 h，PP2在機械通氣前1 h腹腔注射。保護性通氣呼吸機設置：潮氣量6 mL/kg，頻率60次/min，吸呼比1/2，呼氣末正壓5 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)；大潮氣量通氣呼吸機設置：潮氣量40 mL/kg，頻率40次/min，吸呼比1/2，呼氣末正壓0 cm H2O。每組中各取5只大鼠用于伊文思藍(EB)檢測肺血管通透性。酪氨酸蛋白激酶抑制劑PP2溶解于0.3 mL二甲基亞砜(DMSO)中。正常對照組、保護性通氣組和大潮氣量通氣組試驗前1 h腹腔注射0.3 mL不含抑制劑的DMSO溶液。
2. 標本采集：機械通氣至預定時間點后于頸動脈放血處死大鼠。打開胸腔，結扎右側肺門，氣管切開，插入0.2 cm硅膠管，以4℃生理鹽水2 mL反復灌洗左肺2次，記錄每次灌洗液回收量后離心(3 000 r/min)10 min，取上凊－70℃保存備用。右肺上葉組織固定于10%多聚甲醛溶液用于病理切片和原位凋亡實驗。右肺中葉用于檢測肺濕/干重比值(W/D)。其余肺組織液氮冷凍用于蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測。
3. 檢測指標及方法
(1)?肺組織病理學觀察以及肺W/D測定：取右肺上葉組織固定于10%多聚甲醛溶液中，HE染色后光鏡下觀察組織切片。取右肺中葉稱濕重后，60℃恒溫箱烤72 h至肺干重恒定，稱干重，計算W/D。
(2)?彌漫性肺泡損傷(diffused alveolar damage，DAD)評分[8]：由病理科醫師按雙盲法根據肺間質內中性粒細胞浸潤、肺泡內出血、肺泡內纖維素滲出、肺間質水腫、肺泡內中性粒細胞浸潤等5個方面，按照正常、輕、中、重分別評為0、1、2、3分，DAD評分為各項指標之和。
(3)?EB法測定肺血管通透性：機械通氣后頸外靜脈注射1% EB 2 mg/kg，1 h后頸動脈放血處死大鼠，完整取出全肺，吸干表面水分及血液，稱量濕重后剪下右肺中葉置于干試管中，按1 mL/100 mg濕肺組織加入甲酰胺。試管置于50℃恒溫水浴24 h，浸出液用752型分光光度計(波長620 nm)上定量。左肺稱重后剪碎，50℃干烤72 h至恒重，稱量干重。以每克肺組織干重含有的EB質量表示。
(4)?TUNEL原位細胞凋亡檢測：取右肺上葉組織固定于10%多聚甲醛中，石蠟包埋，組織切片，脫蠟水化處理，用TUNEL反應混合物孵育(60 min，37℃)，洗脫樣本熒光顯微鏡分析。
(5)?Western blot檢測肺組織中磷酸化樁蛋白(p-Paxillin)和Paxillin的表達：每組取100 mg肺組織，提取蛋白BCA法定量。各組取50μg蛋白樣本加入上樣緩沖液后開水煮沸8 min，SDS-PAGE電泳，采用半干法轉膜(恒流100 mA，60 min)，PVDF膜放入5%脫脂牛奶中常溫封閉1 h，孵育一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，室溫孵育二抗1 h后，TBST洗膜，發光、顯影后拍照并進行圖像分析。
(6)?酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測TNF-α：ELISA法檢測各組大鼠肺泡灌洗液中的TNF-α的水平。
(7)?肺組織MPO活性測定：取等質量－80℃凍存的肺組織，在冰浴中制作成10%的肺組織勻漿。組織勻漿后照試劑盒說明測定肺組織中的MPO活性。
三 統計學處理
采用SPSS 18.0統計軟件做數據分析，實驗數據以
結果
一 大鼠肺組織病理觀察、DAD評分、EB滲出量、W/D、肺泡灌洗液中TNF-α濃度以及肺組織MPO活性
正常對照組與保護性通氣組比較，DAD評分、EB滲出量、W/D、MPO及TNF-α差異均無統計學意義(P＞0.05)。大潮氣量通氣組與PP2抑制劑組比較，以上指標差異均有統計學意義(P＜0.05)。肺組織病理觀察發現，正常對照組肺組織正常，沒有組織學損傷改變；保護性通氣組肺泡結構比較完整，有少量炎細胞浸潤，肺泡間隔無水腫，肺泡腔無明顯滲出物；大潮氣量通氣組肺泡間隔增厚，肺泡腔內彌漫浸潤炎性細胞，肺泡腔大量滲出物，部分肺泡萎陷或破裂；PP2抑制劑組肺損傷明顯減輕，肺泡結構完整，少量炎細胞浸潤，肺泡腔有少量滲出物。結果見表 1和圖 1。
表1
各組大鼠肺DAD評分、EB滲出量、W/D、MPO及TNF-α濃度比較(n=15，
圖1
光鏡下各組大鼠肺組織病理組織像(HE×200)?a. 正常對照組；b. 保護性通氣組；c. 大潮氣量通氣組；d. PP2抑制劑組
二 TUNEL原位細胞凋亡檢測
正常對照組與保護性通氣組比較，肺組織原位細胞凋亡率差異無統計學意義[(8.21±2.24)%比(9.36±3.31)%，P＞0.05]。大潮氣量通氣組與PP2抑制劑組比較，凋亡率差異有統計學意義[(63.01±5.21)%比(25.12±4.37)%，P＜0.05]。各組凋亡率從高到低排序為：大潮氣量通氣組＞PP2抑制劑組＞保護性通氣組＞正常對照組。結果見圖 2。
圖2
各組TUNEL原位細胞凋亡檢測像?a. 正常對照組；b. 保護性通氣組；c. 大潮氣量通氣組；d. PP2抑制劑組
三 Western blot檢測p-Paxillin和Paxillin表達
大潮氣量通氣組與PP2抑制劑組比較，p-Paxillin的表達量明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.05)，Paxillin的表達量差異無統計學意義(P＞0.05)。保護性通氣組與正常對照組比較，p-Paxillin和Paxillin表達量均較高，差異有統計學意義(P＜0.05)。正常對照組與保護性通氣組、大潮氣量通氣組、PP2抑制劑組比較，p-Paxillin和Paxillin表達量差異均有統計學意義(P＜0.05)。保護性通氣組、大潮氣量通氣組和PP2抑制劑組間Paxillin的表達量差異無統計學意義(P＞0.05)。結果見圖 3和表 2。
圖3
各組p-Paxillin和Paxillin表達電泳圖
1：正常對照組；2：保護性通氣組；3：大潮氣量通氣組；4：PP2抑制劑組
表2
各組p-Paxillin和Paxillin相對表達量(n=15，討論
近年來隨著機械通氣的廣泛應用，VILI發生率也逐年提高，關于VILI的研究也日趨深入。最近研究表明，在過度機械應力下出現的細胞及組織損傷是肺生物學一個比較新的、過去被忽略的領域，也是肺損傷發生及發展的主要原因之一[9]。機械應力損傷可造成早期組織間隙水腫，內皮細胞細胞膜水泡以及連接細胞之間的基底膜缺失，長時間的損傷造成細胞內及細胞間裂隙的形成以及廣泛細胞破壞后基底膜的裸露[10]。因此，研究內皮細胞屏障受損以及細胞間裂隙的形成機制非常重要。
Paxillin最早是在V-SRC轉染的細胞中發現的，后在平滑肌組織中得到了它的純化蛋白，并確定它是黏著斑蛋白的結合蛋白。Paxillin通過FAK或Src激酶介導的Tyr31和Tyr118位點的磷酸化產生了SH2結合結構域，是一種調節蛋白質相互作用的重要方式。FA特定的蛋白間相互作用和特定的磷酸化位點與內皮細胞在受到機械應力和化學刺激時屏障保護和屏障破壞反應有關[11-12]。
本實驗中我們使用SD大鼠復制機械通氣肺損傷模型，使用Src酪氨酸蛋白激酶抑制劑PP2活體注射來研究Paxillin的Tyr118和Tyr31磷酸化在機械通氣肺損傷過程中的作用。結果發現大潮氣量通氣組的大鼠肺部病理切片表現出明顯的炎癥損傷改變，原位細胞凋亡檢測、W/D、TNF-α濃度和MPO活性等指標均顯示VILI模型復制成功，而小潮氣量高PEEP的保護性通氣組和PP2抑制劑組的大鼠肺損傷程度較大潮氣量通氣組明顯減輕。由此可見，抑制劑PP2對減輕大鼠呼吸機肺損傷作用明顯。Western blot結果顯示，在機械通氣后Paxillin的表達量在保護性通氣組、大潮氣量通氣組和PP2抑制劑組中基本相同；而p-Paxillin在大潮氣量通氣組中顯著增高，在正常對照組和保護性通氣中組p-Paxillin表達量較低，PP2抑制劑組中p-Paxillin表達量很低。以上結果說明PP2對Paxillin Tyr31和Tyr118位點磷酸化產生了明顯的抑制效應。綜合以上實驗數據，我們認為抑制Paxillin磷酸化可明顯降低肺毛細血管通透性，減少肺損傷，同時能夠抑制炎癥因子、炎癥細胞的趨化，抑制細胞凋亡，機械通氣肺損傷明顯減輕。
FAK和Src都能調節Paxillin在Tyr31和Tyr118處的磷酸化，而我們使用了Src激酶抑制PP2來抑制Paxillin磷酸化，Paxillin無法產生SH2結合結構域，沒有該結構域提供特異性的結合位點，導致FA的特定的幾種蛋白間交互作用無法進行，進而細胞屏障破壞進程被終止，阻止了肺內皮細胞通透性降低。這些變化主要體現在大鼠在機械通氣時肺部的炎性改變明顯減輕。Petit等[13]在研究中也有類似的發現，膠原蛋白誘導的NBT-II細胞運動伴隨著Paxillin的酪氨酸磷酸化，如果把其分子中兩個最主要的酪氨酸Y31和Y118突變為苯丙氨酸并在細胞中過表達，則可以有效抑制細胞的遷徙。
生物機械力作用在血管內皮細胞上，刺激引起了一系列的信號級聯放大，由MAP激酶(p42/44 MAPK、JNK和p38)、非受體酪氨酸激酶(Src和FAK)、整聯蛋白信號、離子通道和Rho家族的GTPases，共同決定了內皮細胞的通透性[14-16]。周期牽拉誘導實驗中，Rho-GTPase信號通路的激活可以加劇內皮細胞細胞屏障的破環，而在體內和體外急性肺損傷模型中減弱Rho激酶的活性可以減少肺血管的滲出和促進屏障功能的恢復[11, 17]。結合本實驗研究結果，可以推測大潮氣量機械通氣激活了Src和FAK，使Paxillin Tyr31和Tyr118位點磷酸化，產生SH2結合結構域，其為p42/44 MAPK，JNK、p38、Paxillin之間發生交互作用提供一個反應平臺，形成某些特定的復合物，該復合物作為一種信號小體進一步激活下游RHO-GTPase信號通路，加劇細胞屏障破環，肺血管滲出加重，激活炎癥因子的釋放，啟動細胞凋亡程序，進而引發嚴重的呼吸機相關性肺損傷。
雖然我們的研究發現了抑制Paxillin磷酸化可以明顯改善機械通氣肺損傷，但Paxillin磷酸化后對下游MAP激酶、整聯蛋白等的確切影響以及它們之間相互作用方式仍尚待研究。總而言之，抑制Paxillin磷酸化能夠降低肺毛細血管通透性，減少炎性因子釋放，抑制細胞凋亡程序的啟動。Paxillin的Tyr118和Tyr31磷酸化位點在機械通氣肺損傷的病理損傷過程中發揮了重要的功能。對于Paxillin磷酸化后下游信號鏈的變化及對機械通氣肺損傷效應的確切機制仍需更深入的研究。
