引用本文： 劉敏龍, 王國恩, 張軍. 程序性細胞死亡因子配體1在輕型和重型膿毒癥小鼠單核細胞的表達和差異. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(4): 358-361. doi: 10.7507/1671-6205.2015089 復制
抗生素是治療膿毒癥的主要武器，但細菌耐藥率增高使抗生素選擇越來越困難[1]。研究發現膿毒癥發展伴隨免疫功能抑制，功能抑制的免疫細胞不能有效殺滅病原菌是治療失敗和繼發二次感染的原因之一，因此免疫治療成為膿毒癥的研究熱點[2]。T淋巴細胞活化是雙信號機制，單核細胞不僅遞呈抗原給T細胞，而且單核細胞表達第二信號(協同共抑制信號)與T細胞表面受體結合，使得T細胞進入抑制狀態。程序性細胞死亡因子1(programmed death-1，PD-1)及其配體(programmed death-1 ligand，PD-L1)是B7/CD28家族成員，屬于協同抑制分子，發揮負性免疫調節作用。單核細胞PD-L1與T淋巴細胞PD-1結合使T細胞處于抑制狀態[3-4]。研究指出膿毒癥發展伴隨PD-1/PD-L1高表達，PD-1/PD-L1高表達與免疫功能抑制有關[2]。單核細胞是重要的固有免疫細胞，發揮抗原遞呈及吞噬病原體等作用。本研究采用盲腸結扎穿孔法復制小鼠膿毒癥模型，觀察膿毒癥單核細胞PD-L1表達，并探討輕型、重型膿毒癥PD-L1表達差異。
材料與方法
一 材料
1. 試劑和儀器：免疫熒光抗體PE-anti-mouse-CD115、APC-anti-mouse-PD-L1及同型對照抗體、Fc阻滯劑及紅細胞裂解液購自美國Biolegend公司。腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA kit和白細胞介素10(IL-10)ELISA kit購自上海西唐生物科技有限公司；流式細胞儀BD FACSAriaⅡ；酶標儀為Thermo公司Denley Dragon Wellscan MK3。
2. 實驗動物和分組：雄性C57BL/6共90只。30只小鼠隨機分為輕型膿毒癥組、重型膿毒癥組及假手術組，每組10只，采用盲腸結扎穿孔法造模，以盲腸結扎長短區分病情輕重，造模成功后觀察生存率。60只C57小鼠隨機分輕型膿毒癥組、重型膿毒癥組及假手術組，每組為20只。分別在造模后6 h、24 h取外周血，每個時間點10只。
二 方法
1. 模型制備：異氟烷麻醉，麻醉成功后腹部備皮，75%酒精消毒后腹中線切開進腹，提出盲腸，輕型膿毒癥組于盲腸中段結扎，重型膿毒癥組膿毒癥在距盲腸遠端長度為整個盲腸75%處結扎。結扎后21G針穿通遠端盲腸，將腸內容物從穿刺點擠出，隨后還納盲腸關腹。術畢于小鼠背部皮下注射1 mL生理鹽水。假手術組不進行盲腸結扎和穿孔，余同手術造模組。造模成功后小鼠自由飲水和進食。在6 h、24 h摘眼球法取外周血。
2. 血漿TNF-α和IL-10水平檢測：按ELISA試劑盒說明書完成。
3. 外周血樣品制備和流式細胞儀檢測：流失管中加100μL EDTA抗凝血，加入2 mL紅細胞裂解液冰上避光孵育5 min，加2 mL PBS液終止，300 g離心5 min，棄上清。輕彈管底，再次加入2 mL PBS液，如上法離心棄上清，加Fc阻滯劑振蕩混勻，冰上避光孵育5 min。再分別加入PE-anti-mouse-CD115和APC-anti-mouse-PD-L1抗體冰上孵育30 min。加500μL PBS液混勻，4℃避光1 h內上機檢測。每次檢測均設陰性、同型和單染管對照。
三 統計學處理
采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。實驗數據以
結果
一 各組小鼠生存率觀察
造模成功后第4 d重型膿毒癥組小鼠全部死亡，輕型膿毒癥組存活4只，至第9 d仍有1只存活。
圖1
各組小鼠生存率曲線
二 膿毒癥小鼠外周血血清TNF-α和IL-10水平
TNF-α、IL-10水平在6 h、24 h膿毒癥組較假手組增高(P＜0.01)；6 h、24 h重型膿毒癥組TNF-α水平較輕型膿毒癥組增高(P＜0.01)；6 h重型膿毒癥組IL-10水平與輕型膿毒癥組差異無統計學意義(P＞0.05)，24 h重型膿毒癥組IL-10水平較輕型膿毒癥組增高(P＜0.05)。結果見表 1和表 2。
表1
6 h膿毒癥小鼠各組血清TNF-α、IL-10水平及單核細胞PD-L1表達(n=20，
表2
24 h膿毒癥小鼠各組血清TNF-α、IL-10水平及單核細胞PD-L1表達(n=20，三 膿毒癥小鼠外周血單核細胞PD-L1表達
6 h、24 h膿毒癥組單核細胞PD-L1表達均較假手術組升高(P＜0.05)，24 h膿毒癥組PD-L1表達水平升高更顯著(P＜0.01)。重型膿毒癥組PD-L1表達較輕型膿毒癥組有升高趨勢，但兩組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。結果見表 1和表 2。單核細胞PD-L1流式細胞圖見圖 2。
圖2
單核細胞PD-L1表達流式細胞圖?a. 假手術組；b. 6 h重型膿毒癥組；c. 24 h重型膿毒癥組
Q2為單核細胞PD-L1陽性表達區域
討論
PD-1/PD-L1途徑參與許多疾病發生發展。腫瘤的發生與局部的免疫功能障礙有關，腫瘤組織局部PD-L1高表達提示免疫功能抑制。2014年國外臨床Ⅰ期研究報應用抗PD-L1抗體(MPDL3280A)治療膀胱癌取得成功，對于免疫組織化學顯示腫瘤細胞陽性表達PD-L1或腫瘤旁免疫細胞陽性表達PD-L1的患者，MPDL3280A治療可明顯抑制腫瘤生長致瘤體縮小[5]。在病毒感染方面，阻斷PD-1/PD-L1信號通路能夠有效促使病毒特異性T細胞增殖，恢復抗病毒能力[6]。在膿毒癥方面，比較野生型與PD-L1基因敲除的膿毒癥小鼠，后者生存時間延長，炎性細胞因子表達水平降低[7]。以上研究提示PD-1/PD-L1途徑參與機體負性免疫調節，阻斷PD-1/PD-L1途徑可以改善機體免疫，達到對疾病的免疫治療作用。
單核細胞是重要的固有免疫細胞，也是重要的抗原遞呈細胞，在感染初期機體首先啟動固有免疫應答，因此研究單核細胞PD-L1表達是研究早期膿毒癥免疫抑制功能的切入點。本研究顯示，6 h、24 h膿毒癥組單核細胞PD-L1表達較假手術組明顯增加，24 h表達更顯著。說明膿毒癥早期單核細胞PD-L1表達增加，推測膿毒癥早期機體負性免疫調節作用即啟動。我們的結果與Huang等[7]研究結果一致，Huang等[7]研究指出膿毒癥PD-L1基因敲出小鼠較野生型小鼠生存時間長。國內劉茜等[8]報道膿毒癥小鼠脾臟樹突細胞PD-L1表達在6 h即明顯升高(P＜0.05)，而后迅速下降，至24 h時恢復正常水平，與我們的結果不一致，分析可能與PD-L1在不同免疫細胞表達不同有關。研究發現膿毒癥患者單核細胞PD-L1表達增高，T淋巴細胞PD-1表達增高，體外用抗PD-L1抗體阻斷將減少TNF-α誘導的T淋巴細胞凋亡[9]。Guignant等[10]研究發現單核細胞PD-L1表達水平及T淋巴細胞PD-1表達水平與患者住院死亡率及二次感染相關。綜合以上研究說明膿毒癥單核細胞PD-L1表達增高，PD-L1表達增高參與負性免疫調節，單核細胞PD-L1可能是膿毒癥免疫治療的潛在靶點。
盲腸結扎穿孔法是復制膿毒癥的經典模型，Rittirsch等[11]報道盲腸結扎長短與病情輕重相關，結扎點距離盲腸遠端越長死亡率越高。我們的實驗顯示結扎點在距盲腸遠端75%的死亡率較50%明顯增高，觀察結果與Rittirsch等[11]一致。Singleton等[12]報道隨著結扎點距離盲腸遠端越長，TNF-α水平升高，我們的結果也顯示TNF-α水平重型膿毒癥組較輕型膿毒癥組高(P＜0.01)。因此，本實驗中復制的小鼠輕型、重型膿毒癥模型是可靠的。實驗預期是隨著膿毒癥嚴重程度增加，炎癥反應更強烈，抑炎反應會增加，PD-L1表達可能會更高。但實驗結果表明重型膿毒癥PD-L1表達較輕型有升高趨勢，但差異無統計學意義。這個結果與預期有差異，分析可能與觀察時間短有關，仍需進一步實驗驗證。
抗生素是治療膿毒癥的主要武器，但細菌耐藥率增高使抗生素選擇越來越困難[1]。研究發現膿毒癥發展伴隨免疫功能抑制，功能抑制的免疫細胞不能有效殺滅病原菌是治療失敗和繼發二次感染的原因之一，因此免疫治療成為膿毒癥的研究熱點[2]。T淋巴細胞活化是雙信號機制，單核細胞不僅遞呈抗原給T細胞，而且單核細胞表達第二信號(協同共抑制信號)與T細胞表面受體結合，使得T細胞進入抑制狀態。程序性細胞死亡因子1(programmed death-1，PD-1)及其配體(programmed death-1 ligand，PD-L1)是B7/CD28家族成員，屬于協同抑制分子，發揮負性免疫調節作用。單核細胞PD-L1與T淋巴細胞PD-1結合使T細胞處于抑制狀態[3-4]。研究指出膿毒癥發展伴隨PD-1/PD-L1高表達，PD-1/PD-L1高表達與免疫功能抑制有關[2]。單核細胞是重要的固有免疫細胞，發揮抗原遞呈及吞噬病原體等作用。本研究采用盲腸結扎穿孔法復制小鼠膿毒癥模型，觀察膿毒癥單核細胞PD-L1表達，并探討輕型、重型膿毒癥PD-L1表達差異。
材料與方法
一 材料
1. 試劑和儀器：免疫熒光抗體PE-anti-mouse-CD115、APC-anti-mouse-PD-L1及同型對照抗體、Fc阻滯劑及紅細胞裂解液購自美國Biolegend公司。腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA kit和白細胞介素10(IL-10)ELISA kit購自上海西唐生物科技有限公司；流式細胞儀BD FACSAriaⅡ；酶標儀為Thermo公司Denley Dragon Wellscan MK3。
2. 實驗動物和分組：雄性C57BL/6共90只。30只小鼠隨機分為輕型膿毒癥組、重型膿毒癥組及假手術組，每組10只，采用盲腸結扎穿孔法造模，以盲腸結扎長短區分病情輕重，造模成功后觀察生存率。60只C57小鼠隨機分輕型膿毒癥組、重型膿毒癥組及假手術組，每組為20只。分別在造模后6 h、24 h取外周血，每個時間點10只。
二 方法
1. 模型制備：異氟烷麻醉，麻醉成功后腹部備皮，75%酒精消毒后腹中線切開進腹，提出盲腸，輕型膿毒癥組于盲腸中段結扎，重型膿毒癥組膿毒癥在距盲腸遠端長度為整個盲腸75%處結扎。結扎后21G針穿通遠端盲腸，將腸內容物從穿刺點擠出，隨后還納盲腸關腹。術畢于小鼠背部皮下注射1 mL生理鹽水。假手術組不進行盲腸結扎和穿孔，余同手術造模組。造模成功后小鼠自由飲水和進食。在6 h、24 h摘眼球法取外周血。
2. 血漿TNF-α和IL-10水平檢測：按ELISA試劑盒說明書完成。
3. 外周血樣品制備和流式細胞儀檢測：流失管中加100μL EDTA抗凝血，加入2 mL紅細胞裂解液冰上避光孵育5 min，加2 mL PBS液終止，300 g離心5 min，棄上清。輕彈管底，再次加入2 mL PBS液，如上法離心棄上清，加Fc阻滯劑振蕩混勻，冰上避光孵育5 min。再分別加入PE-anti-mouse-CD115和APC-anti-mouse-PD-L1抗體冰上孵育30 min。加500μL PBS液混勻，4℃避光1 h內上機檢測。每次檢測均設陰性、同型和單染管對照。
三 統計學處理
采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。實驗數據以
結果
一 各組小鼠生存率觀察
造模成功后第4 d重型膿毒癥組小鼠全部死亡，輕型膿毒癥組存活4只，至第9 d仍有1只存活。
圖1
各組小鼠生存率曲線
二 膿毒癥小鼠外周血血清TNF-α和IL-10水平
TNF-α、IL-10水平在6 h、24 h膿毒癥組較假手組增高(P＜0.01)；6 h、24 h重型膿毒癥組TNF-α水平較輕型膿毒癥組增高(P＜0.01)；6 h重型膿毒癥組IL-10水平與輕型膿毒癥組差異無統計學意義(P＞0.05)，24 h重型膿毒癥組IL-10水平較輕型膿毒癥組增高(P＜0.05)。結果見表 1和表 2。
表1
6 h膿毒癥小鼠各組血清TNF-α、IL-10水平及單核細胞PD-L1表達(n=20，
表2
24 h膿毒癥小鼠各組血清TNF-α、IL-10水平及單核細胞PD-L1表達(n=20，三 膿毒癥小鼠外周血單核細胞PD-L1表達
6 h、24 h膿毒癥組單核細胞PD-L1表達均較假手術組升高(P＜0.05)，24 h膿毒癥組PD-L1表達水平升高更顯著(P＜0.01)。重型膿毒癥組PD-L1表達較輕型膿毒癥組有升高趨勢，但兩組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。結果見表 1和表 2。單核細胞PD-L1流式細胞圖見圖 2。
圖2
單核細胞PD-L1表達流式細胞圖?a. 假手術組；b. 6 h重型膿毒癥組；c. 24 h重型膿毒癥組
Q2為單核細胞PD-L1陽性表達區域
討論
PD-1/PD-L1途徑參與許多疾病發生發展。腫瘤的發生與局部的免疫功能障礙有關，腫瘤組織局部PD-L1高表達提示免疫功能抑制。2014年國外臨床Ⅰ期研究報應用抗PD-L1抗體(MPDL3280A)治療膀胱癌取得成功，對于免疫組織化學顯示腫瘤細胞陽性表達PD-L1或腫瘤旁免疫細胞陽性表達PD-L1的患者，MPDL3280A治療可明顯抑制腫瘤生長致瘤體縮小[5]。在病毒感染方面，阻斷PD-1/PD-L1信號通路能夠有效促使病毒特異性T細胞增殖，恢復抗病毒能力[6]。在膿毒癥方面，比較野生型與PD-L1基因敲除的膿毒癥小鼠，后者生存時間延長，炎性細胞因子表達水平降低[7]。以上研究提示PD-1/PD-L1途徑參與機體負性免疫調節，阻斷PD-1/PD-L1途徑可以改善機體免疫，達到對疾病的免疫治療作用。
單核細胞是重要的固有免疫細胞，也是重要的抗原遞呈細胞，在感染初期機體首先啟動固有免疫應答，因此研究單核細胞PD-L1表達是研究早期膿毒癥免疫抑制功能的切入點。本研究顯示，6 h、24 h膿毒癥組單核細胞PD-L1表達較假手術組明顯增加，24 h表達更顯著。說明膿毒癥早期單核細胞PD-L1表達增加，推測膿毒癥早期機體負性免疫調節作用即啟動。我們的結果與Huang等[7]研究結果一致，Huang等[7]研究指出膿毒癥PD-L1基因敲出小鼠較野生型小鼠生存時間長。國內劉茜等[8]報道膿毒癥小鼠脾臟樹突細胞PD-L1表達在6 h即明顯升高(P＜0.05)，而后迅速下降，至24 h時恢復正常水平，與我們的結果不一致，分析可能與PD-L1在不同免疫細胞表達不同有關。研究發現膿毒癥患者單核細胞PD-L1表達增高，T淋巴細胞PD-1表達增高，體外用抗PD-L1抗體阻斷將減少TNF-α誘導的T淋巴細胞凋亡[9]。Guignant等[10]研究發現單核細胞PD-L1表達水平及T淋巴細胞PD-1表達水平與患者住院死亡率及二次感染相關。綜合以上研究說明膿毒癥單核細胞PD-L1表達增高，PD-L1表達增高參與負性免疫調節，單核細胞PD-L1可能是膿毒癥免疫治療的潛在靶點。
盲腸結扎穿孔法是復制膿毒癥的經典模型，Rittirsch等[11]報道盲腸結扎長短與病情輕重相關，結扎點距離盲腸遠端越長死亡率越高。我們的實驗顯示結扎點在距盲腸遠端75%的死亡率較50%明顯增高，觀察結果與Rittirsch等[11]一致。Singleton等[12]報道隨著結扎點距離盲腸遠端越長，TNF-α水平升高，我們的結果也顯示TNF-α水平重型膿毒癥組較輕型膿毒癥組高(P＜0.01)。因此，本實驗中復制的小鼠輕型、重型膿毒癥模型是可靠的。實驗預期是隨著膿毒癥嚴重程度增加，炎癥反應更強烈，抑炎反應會增加，PD-L1表達可能會更高。但實驗結果表明重型膿毒癥PD-L1表達較輕型有升高趨勢，但差異無統計學意義。這個結果與預期有差異，分析可能與觀察時間短有關，仍需進一步實驗驗證。
