引用本文： 劉海平, 黃平, 杜秀芳. 慢性阻塞性肺疾病急性加重患者血清和呼出氣冷凝液中肺表面活性蛋白D與趨化因子配體18的表達及其臨床意義. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(2): 204-207. doi: 10.7507/1671-6205.2015052 復制
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一組氣流受限不完全可逆的肺部疾病，呈進行性發展，嚴重影響患者的生活質量，并給人類帶來巨大的社會經濟負擔[1]。病毒性上呼吸道感染以及氣管支氣管感染是慢阻肺急性加重的最常見原因[2]。肺表面活性蛋白D(SP-D)、趨化因子配體18(CCL18)主要在肺部產生，參與人體免疫調節，近年來研究顯示SP-D、 CCL18在慢阻肺急性加重的發生、發展中具有一定作用[3-5]。本研究通過觀察慢阻肺急性加重患者治療前后以及對照者血清和呼出氣冷凝液(EBC)中SP-D、CCL18表達水平變化，分析其與年齡、煙齡、體重指數(BMI)、肺功能的相關性，以探討SP-D、 CCL18在病情監測中的意義以及EBC的臨床價值。
對象與方法
一 對象
慢阻肺急性加重組：廣東醫學院附屬南山人民醫院2012年4月至2013年4月慢阻肺急性加重男性患者。納入標準：年齡40～75歲；吸煙≥10包年；無免疫系統疾病、冠心病、急性心功能衰竭、惡性腫瘤疾病史；治療前咳嗽、咳痰、喘息、呼吸困難等癥狀中至少有2項癥狀新發，或原有癥狀加重且至少持續48 h；治療后前述癥狀在48 h內恢復至基線水平，或癥狀在30 d內仍沒有完全緩解，但癥狀穩定超過48 h且不需要增加急性用藥治療，或抗生素和/或糖皮質激素治療療程結束。對照組：2012年4月至2013年4月深圳市當地居民或工作者。納入標準：男性；年齡40～75歲；吸煙≥10包年；無免疫系統疾病、冠心病、急性心功能衰竭、惡性腫瘤疾病史；血常規、尿常規、肝功能、腎功能、心電圖、胸部X線檢查均正常；肺功能第1秒用力呼氣容積(FEV1)>80%預計值，用力肺活量(FVC)>80%預計值，并且FEV1與FVC比值(FEV1/FVC)>70%。
二 方法
1、一般資料的收集：記錄研究對象的年齡、煙齡、身高、體質量、肺功能檢查結果，包括FEV1、FEV1占預計值百分比(FEV1%pred)、FVC及FEV1/FVC。因多數慢阻肺急性加重患者治療前無法配合肺功能檢查，故慢阻肺急性加重組患者只有治療后肺功能檢查結果。
2、血清和EBC中SP-D、CCL18的檢測：分別采集慢阻肺急性加重組治療前、后以及對照組研究對象靜脈血5 mL，3 000 r/min，離心5 min，離心后取上清液400 μL分裝于兩個EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存備測。應用Ecoscreen(德國Jaeger公司)分別收集慢阻肺急性加重組治療前、后以及對照組研究對象EBC，收集溫度設置為-5 ℃。收集前受試者用蒸餾水漱口3次，取坐位，以鼻夾夾閉鼻腔，經口、平靜、潮式呼吸，收集冷凝液400 μL，放置于-80 ℃冰箱保存備測。SP-D、CCL18試劑盒均由武漢EIAab公司提供，2種指標的測定均采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，具體操作按試劑盒說明書進行。
三 統計學處理
采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料用
結果
一 一般情況
共納入研究對象44例，其中慢阻肺急性加重組22例，對照組22例。慢阻肺急性加重組和對照組年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。慢阻肺急性加重組患者煙齡較對照組顯著升高(P<0.05)，而BMI、FEV1、FEV1%pred、FVC及FEV1/FVC較對照組顯著降低(P<0.05)。結果見表 1。
表1
兩組研究對象一般臨床資料比較(n=22,二 血清SP-D、CCL18表達的比較
所有研究對象血清中SP-D、CCL18的平均值分別為(292.9±204.5)ng/mL、(2.1±0.9) ng/mL。與對照組比較，慢阻肺急性加重組患者治療前血清SP-D表達明顯升高(P<0.05)，而治療后血清SP-D表達差異無統計學意義(P>0.05)。慢阻肺急性加重組患者治療前后血清SP-D表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。對照組、慢阻肺急性加重組治療前、慢阻肺急性加重組治療后血清CCL18表達兩兩比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。結果見表 2。
表2
慢阻肺急性加重組與對照組研究對象血清SP-D、CCL18表達的比較(n=22,三 EBC中SP-D、CCL18表達的比較
所有研究對象EBC中SP-D、CCL18的平均值分別為(2.3±1.0) ng/mL、(17.6±6.4) pg/mL。與對照組比較，慢阻肺急性加重組患者治療前EBC中SP-D表達明顯升高(P<0.05)，而治療后EBC中SP-D表達差異無統計學意義(P>0.05)。慢阻肺急性加重組患者治療前后EBC中SP-D表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。慢阻肺急性加重組患者治療前EBC中CCL18表達顯著低于治療后以及對照組(P<0.05)，而治療后與對照組EBC中CCL18表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表 3。
表3
慢阻肺急性加重組與對照組研究對象EBC中SP-D、CCL18水平的比較(n=22,四 相關性分析
研究對象血清中SP-D表達與煙齡正相關(r=0.34，P=0.02)，與FEV1負相關(r=-0.35，P=0.02)，與FEV1%pred負相關(r=-0.34，P=0.03)，與FVC負相關(r=-0.31，P=0.04)，與FEV1/FVC負相關(r=-0.36，P=0.02)，與年齡、BMI均不相關(P>0.05)；EBC中SP-D表達與煙齡正相關(r=0.11，P=0.03)，與FEV1/FVC負相關(r=-0.37，P=0.01)，與年齡、BMI、FEV1、FEV1%pred、FVC均不相關(P>0.05)；血清和EBC中CCL18表達與年齡、煙齡、BMI、FEV1、FEV1%pred、FVC及FEV1/FVC均不相關(P>0.05)。
討論
慢阻肺是一種常見病、多發病，反復慢阻肺急性加重將嚴重損害患者肺功能，降低臨床療效，還將對患者心理產生不良影響[6]。SP-D、CCL18主要在肺部產生，與慢阻肺急性加重病情變化關系密切[4, 7]。本試驗中我們按照統一標準收集血清及EBC，直接檢測EBC中SP-D、CCL18表達并與血清中表達進行比較，同時所有研究對象均行肺功能檢查，分析SP-D、CCL18表達與肺功能檢查的關系。研究結果顯示，研究對象血清中SP-D、CCL18表達顯著高于EBC中SP-D、CCL18表達；血清中SP-D表達與煙齡正相關，與肺功能負相關；EBC中SP-D表達與煙齡正相關，與FEV1/FVC負相關；血清和EBC中CCL18表達與年齡、煙齡、BMI、FEV1、FEV1%pred、FVC及FEV1/FVC均不相關。與對照組比較，慢阻肺急性加重患者血清和EBC中SP-D表達顯著升高，而EBC中治療前CCL18表達顯著降低，且治療后表達升高。
SP-D是膠原凝集素蛋白家族的一員，由10號染色體基因所編碼，主要在肺泡Ⅱ型細胞和Clara細胞中表達，在宿主免疫調節中具有重要作用[3-4, 8]。研究發現，慢阻肺患者血清SP-D表達比健康吸煙者及非吸煙者都高，吸煙者血清SP-D表達比非吸煙者高，慢阻肺急性加重患者血清SP-D表達比穩定期慢阻肺患者高[8-9]；吸煙者血清SP-D表達與FEV1、FVC負相關[10]。這與本研究結果是一致的。炎癥及損傷可引起肺部SP-D mRNA及蛋白質表達增加[11]，慢阻肺急性加重導致炎癥及肺部損傷，SP-D產生因而增加。SP-D溶于液相顆粒中或直接以固態小顆粒形式隨氣流呼出，遇冷凝集成EBC，從而使EBC中SP-D表達升高；同時，氣道炎癥、氧化應激等引起肺泡-毛細血管屏障通透性增加，SP-D進入血液，最終使血清中SP-D升高。Hirama等[12]在動物實驗中發現，暴露于煙霧中的小鼠肺部SP-D mRNA及蛋白質表達均增加。激素的應用不僅能誘導SP-D mRNA表達增加，還能降低肺泡-毛細血管膜的通透性，減少SP-D蛋白的滲出[13]。因此，我們認為血清和EBC中SP-D表達變化在慢阻肺急性加重病情監測中具有重要意義。
CCL18是一種分子量為7 kD的蛋白，主要存在于肺中，由單核細胞和樹突狀細胞分泌[14]。CCL18能在Th2細胞因子輔助下，選擇性活化M2巨噬細胞，表達炎癥抑制因子，從而抑制炎癥反應；它還能通過上調細胞外信號調節激酶-1/2旁路刺激肺成纖維細胞產生膠原蛋白，參與氣道重塑[5, 15]。Sin等[7]研究發現慢阻肺患者血清中CCL18表達比健康吸煙者及非吸煙者高，而且CCL18表達在慢阻肺急性加重患者中上升尤為明顯。然而我們并未發現慢阻肺急性加重患者治療前、后以及健康吸煙者之間血清CCL18表達差異有統計學意義，且在EBC中我們發現慢阻肺急性加重患者治療前CCL18表達顯著低于治療后和健康吸煙者，可能與下列原因有關：(1)慢阻肺急性加重患者由于脂多糖類暴露和刺激，肺部CCL18產生減少[16]。(2)CCL18在前列腺、骨髓、血管、肝臟、淋巴結中也有少量表達[14]。血清CCL18不僅受到肺泡-毛細血管膜通透性影響，而且還受到這些肺外器官分泌的影響；而EBC中的CCL18隨呼出氣冷凝而成，器官特異性高。因此我們推測EBC中CCL18能更靈敏地反映肺部CCL18表達變化，但需更多臨床試驗證實。
EBC是由多種生物標志物構成的混合物[17-18]，其各種成分含量的變化可能在疾病病情監測及療效評估中具有重要價值[18]。相對于血清，EBC在慢阻肺急性加重病情監測中具有獨特的優勢：(1)EBC收集具有簡便、無創等特點，患者的依從性較高[19]。(2)EBC來自于肺部，具有較高的器官特異性，不受肺外器官分泌的影響，能夠更直接地反映肺部情況的變化。本研究結果顯示慢阻肺急性加重患者治療前EBC中CCL18表達顯著低于治療后和健康吸煙者，而血清中CCL18表達在各組之間的差異均沒有統計學意義，表明檢測慢阻肺急性加重患者治療前EBC中CCL18表達可能較檢測血清中CCL18表達更有意義。
綜上所述，血清和EBC中SP-D、CCL18表達在慢阻肺急性加重患者病情監測中具有一定價值。與血清相比，EBC中SP-D、CCL18表達變化在慢阻肺急性加重患者病情監測中更具獨特的優勢。但本研究也存在一些不足：(1)實驗樣本量小，抽樣誤差增大，其臨床意義需更大規模研究證實；(2)EBC中生物標志物含量低，而且目前國際上尚無統一的收集標準[20]，有待進一步改進；(3)未能獨立對慢阻肺急性加重患者的肺功能特別是治療前后肺功能變化與SP-D、CCL18表達關系進行研究。
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一組氣流受限不完全可逆的肺部疾病，呈進行性發展，嚴重影響患者的生活質量，并給人類帶來巨大的社會經濟負擔[1]。病毒性上呼吸道感染以及氣管支氣管感染是慢阻肺急性加重的最常見原因[2]。肺表面活性蛋白D(SP-D)、趨化因子配體18(CCL18)主要在肺部產生，參與人體免疫調節，近年來研究顯示SP-D、 CCL18在慢阻肺急性加重的發生、發展中具有一定作用[3-5]。本研究通過觀察慢阻肺急性加重患者治療前后以及對照者血清和呼出氣冷凝液(EBC)中SP-D、CCL18表達水平變化，分析其與年齡、煙齡、體重指數(BMI)、肺功能的相關性，以探討SP-D、 CCL18在病情監測中的意義以及EBC的臨床價值。
對象與方法
一 對象
慢阻肺急性加重組：廣東醫學院附屬南山人民醫院2012年4月至2013年4月慢阻肺急性加重男性患者。納入標準：年齡40～75歲；吸煙≥10包年；無免疫系統疾病、冠心病、急性心功能衰竭、惡性腫瘤疾病史；治療前咳嗽、咳痰、喘息、呼吸困難等癥狀中至少有2項癥狀新發，或原有癥狀加重且至少持續48 h；治療后前述癥狀在48 h內恢復至基線水平，或癥狀在30 d內仍沒有完全緩解，但癥狀穩定超過48 h且不需要增加急性用藥治療，或抗生素和/或糖皮質激素治療療程結束。對照組：2012年4月至2013年4月深圳市當地居民或工作者。納入標準：男性；年齡40～75歲；吸煙≥10包年；無免疫系統疾病、冠心病、急性心功能衰竭、惡性腫瘤疾病史；血常規、尿常規、肝功能、腎功能、心電圖、胸部X線檢查均正常；肺功能第1秒用力呼氣容積(FEV1)>80%預計值，用力肺活量(FVC)>80%預計值，并且FEV1與FVC比值(FEV1/FVC)>70%。
二 方法
1、一般資料的收集：記錄研究對象的年齡、煙齡、身高、體質量、肺功能檢查結果，包括FEV1、FEV1占預計值百分比(FEV1%pred)、FVC及FEV1/FVC。因多數慢阻肺急性加重患者治療前無法配合肺功能檢查，故慢阻肺急性加重組患者只有治療后肺功能檢查結果。
2、血清和EBC中SP-D、CCL18的檢測：分別采集慢阻肺急性加重組治療前、后以及對照組研究對象靜脈血5 mL，3 000 r/min，離心5 min，離心后取上清液400 μL分裝于兩個EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存備測。應用Ecoscreen(德國Jaeger公司)分別收集慢阻肺急性加重組治療前、后以及對照組研究對象EBC，收集溫度設置為-5 ℃。收集前受試者用蒸餾水漱口3次，取坐位，以鼻夾夾閉鼻腔，經口、平靜、潮式呼吸，收集冷凝液400 μL，放置于-80 ℃冰箱保存備測。SP-D、CCL18試劑盒均由武漢EIAab公司提供，2種指標的測定均采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，具體操作按試劑盒說明書進行。
三 統計學處理
采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料用
結果
一 一般情況
共納入研究對象44例，其中慢阻肺急性加重組22例，對照組22例。慢阻肺急性加重組和對照組年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。慢阻肺急性加重組患者煙齡較對照組顯著升高(P<0.05)，而BMI、FEV1、FEV1%pred、FVC及FEV1/FVC較對照組顯著降低(P<0.05)。結果見表 1。
表1
兩組研究對象一般臨床資料比較(n=22,二 血清SP-D、CCL18表達的比較
所有研究對象血清中SP-D、CCL18的平均值分別為(292.9±204.5)ng/mL、(2.1±0.9) ng/mL。與對照組比較，慢阻肺急性加重組患者治療前血清SP-D表達明顯升高(P<0.05)，而治療后血清SP-D表達差異無統計學意義(P>0.05)。慢阻肺急性加重組患者治療前后血清SP-D表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。對照組、慢阻肺急性加重組治療前、慢阻肺急性加重組治療后血清CCL18表達兩兩比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。結果見表 2。
表2
慢阻肺急性加重組與對照組研究對象血清SP-D、CCL18表達的比較(n=22,三 EBC中SP-D、CCL18表達的比較
所有研究對象EBC中SP-D、CCL18的平均值分別為(2.3±1.0) ng/mL、(17.6±6.4) pg/mL。與對照組比較，慢阻肺急性加重組患者治療前EBC中SP-D表達明顯升高(P<0.05)，而治療后EBC中SP-D表達差異無統計學意義(P>0.05)。慢阻肺急性加重組患者治療前后EBC中SP-D表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。慢阻肺急性加重組患者治療前EBC中CCL18表達顯著低于治療后以及對照組(P<0.05)，而治療后與對照組EBC中CCL18表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表 3。
表3
慢阻肺急性加重組與對照組研究對象EBC中SP-D、CCL18水平的比較(n=22,四 相關性分析
研究對象血清中SP-D表達與煙齡正相關(r=0.34，P=0.02)，與FEV1負相關(r=-0.35，P=0.02)，與FEV1%pred負相關(r=-0.34，P=0.03)，與FVC負相關(r=-0.31，P=0.04)，與FEV1/FVC負相關(r=-0.36，P=0.02)，與年齡、BMI均不相關(P>0.05)；EBC中SP-D表達與煙齡正相關(r=0.11，P=0.03)，與FEV1/FVC負相關(r=-0.37，P=0.01)，與年齡、BMI、FEV1、FEV1%pred、FVC均不相關(P>0.05)；血清和EBC中CCL18表達與年齡、煙齡、BMI、FEV1、FEV1%pred、FVC及FEV1/FVC均不相關(P>0.05)。
討論
慢阻肺是一種常見病、多發病，反復慢阻肺急性加重將嚴重損害患者肺功能，降低臨床療效，還將對患者心理產生不良影響[6]。SP-D、CCL18主要在肺部產生，與慢阻肺急性加重病情變化關系密切[4, 7]。本試驗中我們按照統一標準收集血清及EBC，直接檢測EBC中SP-D、CCL18表達并與血清中表達進行比較，同時所有研究對象均行肺功能檢查，分析SP-D、CCL18表達與肺功能檢查的關系。研究結果顯示，研究對象血清中SP-D、CCL18表達顯著高于EBC中SP-D、CCL18表達；血清中SP-D表達與煙齡正相關，與肺功能負相關；EBC中SP-D表達與煙齡正相關，與FEV1/FVC負相關；血清和EBC中CCL18表達與年齡、煙齡、BMI、FEV1、FEV1%pred、FVC及FEV1/FVC均不相關。與對照組比較，慢阻肺急性加重患者血清和EBC中SP-D表達顯著升高，而EBC中治療前CCL18表達顯著降低，且治療后表達升高。
SP-D是膠原凝集素蛋白家族的一員，由10號染色體基因所編碼，主要在肺泡Ⅱ型細胞和Clara細胞中表達，在宿主免疫調節中具有重要作用[3-4, 8]。研究發現，慢阻肺患者血清SP-D表達比健康吸煙者及非吸煙者都高，吸煙者血清SP-D表達比非吸煙者高，慢阻肺急性加重患者血清SP-D表達比穩定期慢阻肺患者高[8-9]；吸煙者血清SP-D表達與FEV1、FVC負相關[10]。這與本研究結果是一致的。炎癥及損傷可引起肺部SP-D mRNA及蛋白質表達增加[11]，慢阻肺急性加重導致炎癥及肺部損傷，SP-D產生因而增加。SP-D溶于液相顆粒中或直接以固態小顆粒形式隨氣流呼出，遇冷凝集成EBC，從而使EBC中SP-D表達升高；同時，氣道炎癥、氧化應激等引起肺泡-毛細血管屏障通透性增加，SP-D進入血液，最終使血清中SP-D升高。Hirama等[12]在動物實驗中發現，暴露于煙霧中的小鼠肺部SP-D mRNA及蛋白質表達均增加。激素的應用不僅能誘導SP-D mRNA表達增加，還能降低肺泡-毛細血管膜的通透性，減少SP-D蛋白的滲出[13]。因此，我們認為血清和EBC中SP-D表達變化在慢阻肺急性加重病情監測中具有重要意義。
CCL18是一種分子量為7 kD的蛋白，主要存在于肺中，由單核細胞和樹突狀細胞分泌[14]。CCL18能在Th2細胞因子輔助下，選擇性活化M2巨噬細胞，表達炎癥抑制因子，從而抑制炎癥反應；它還能通過上調細胞外信號調節激酶-1/2旁路刺激肺成纖維細胞產生膠原蛋白，參與氣道重塑[5, 15]。Sin等[7]研究發現慢阻肺患者血清中CCL18表達比健康吸煙者及非吸煙者高，而且CCL18表達在慢阻肺急性加重患者中上升尤為明顯。然而我們并未發現慢阻肺急性加重患者治療前、后以及健康吸煙者之間血清CCL18表達差異有統計學意義，且在EBC中我們發現慢阻肺急性加重患者治療前CCL18表達顯著低于治療后和健康吸煙者，可能與下列原因有關：(1)慢阻肺急性加重患者由于脂多糖類暴露和刺激，肺部CCL18產生減少[16]。(2)CCL18在前列腺、骨髓、血管、肝臟、淋巴結中也有少量表達[14]。血清CCL18不僅受到肺泡-毛細血管膜通透性影響，而且還受到這些肺外器官分泌的影響；而EBC中的CCL18隨呼出氣冷凝而成，器官特異性高。因此我們推測EBC中CCL18能更靈敏地反映肺部CCL18表達變化，但需更多臨床試驗證實。
EBC是由多種生物標志物構成的混合物[17-18]，其各種成分含量的變化可能在疾病病情監測及療效評估中具有重要價值[18]。相對于血清，EBC在慢阻肺急性加重病情監測中具有獨特的優勢：(1)EBC收集具有簡便、無創等特點，患者的依從性較高[19]。(2)EBC來自于肺部，具有較高的器官特異性，不受肺外器官分泌的影響，能夠更直接地反映肺部情況的變化。本研究結果顯示慢阻肺急性加重患者治療前EBC中CCL18表達顯著低于治療后和健康吸煙者，而血清中CCL18表達在各組之間的差異均沒有統計學意義，表明檢測慢阻肺急性加重患者治療前EBC中CCL18表達可能較檢測血清中CCL18表達更有意義。
綜上所述，血清和EBC中SP-D、CCL18表達在慢阻肺急性加重患者病情監測中具有一定價值。與血清相比，EBC中SP-D、CCL18表達變化在慢阻肺急性加重患者病情監測中更具獨特的優勢。但本研究也存在一些不足：(1)實驗樣本量小，抽樣誤差增大，其臨床意義需更大規模研究證實；(2)EBC中生物標志物含量低，而且目前國際上尚無統一的收集標準[20]，有待進一步改進；(3)未能獨立對慢阻肺急性加重患者的肺功能特別是治療前后肺功能變化與SP-D、CCL18表達關系進行研究。
