引用本文： 杜娟, 高偉良, 馮清州, 劉晅. p38 MAPK信號通路在LPS誘導RAW264.7細胞表達sTREM-1中的作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(2): 161-164. doi: 10.7507/1671-6205.2015041 復制
有研究表明，可溶性髓樣細胞觸發受體1(soluble triggering receptor expressed on myeloid cell-1，sTREM-1)可與下游細胞因子形成一個正反饋的自分泌調節回路，促使炎癥反應增強、放大，影響膿毒癥的發生發展[1-2]。sTREM-1是膿毒癥發病中早期關鍵炎癥介質，但其被誘導表達的信號轉導機制尚不十分清楚。p38 MAPK是控制炎癥反應的絲裂原活化蛋白激酶(mitiogen activated protein kinase，MAPK)家族的主要成員之一。ARDS、嚴重燒傷、急性胰腺炎等急危重癥發病過程中，p38 MAPK均可被激活；阻斷p38 MAPK級聯反應有助于減輕炎癥反應[3]。在膿毒癥發病過程中，p38 MAPK信號轉導通路可能影響sTREM-1的表達，本研究對此作出探討，報告如下。
材料與方法
一 材料
小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞(美國ATCC細胞庫)；脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)(Sigma公司，批號L20122880)；胰蛋白酶(Sigma公司，批號H20120116)；DMEM培養基(Gibcol BRL公司，批號FMX2012006)；p38 MAPK 特異性抑制劑SB203580(Promega公司，批號S20123400)；p38 MAPK的基因引物(上海生工生物科技有限公司合成，批號FMX2012006)；RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司，批號T20120501)；兔抗鼠p38 MAPK單克隆抗體、兔抗鼠磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)多克隆抗體、羊抗兔IgG單克隆抗體(SantaCruz公司，批號分別為SC201267166、SC2012591213、SC2012282178)；羊抗鼠IgG-HRP(華美生物工程有限公司，批號HA20121006)；小鼠sTREM-1 ELISA試劑盒(深圳晶美公司，批號JS201216521)。
二 方法
1．實驗分組：在37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中，常規培養小鼠巨噬細胞株RAW264.7，培養基選用DMEM培養液，每48 h更換1次。細胞鋪滿瓶底時傳代，調整細胞密度為106/mL，接種6孔板，無血清培養基培養，72 h后隨機分組培養：①LPS組(5 mL)： 加入終濃度為100 mg/mL的LPS培養，在加入LPS后1、6、12、24、48 h等不同時間點收集細胞；②SB+LPS組(5 mL)：加入不同終濃度為5.0、10.0、20.0 μmol/L的SB203580液預處理細胞1 h后，加入100 mg/mL LPS刺激1 h后收集細胞。
2．p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表達檢測：采用Western blott法，收集細胞經PBS洗滌2次，加入裂解液充分裂解，裂解產物12 000 r/min離心20 min，收集上清。使用BCA法測定總蛋白量。每份樣品取50 μg蛋白，加入 SDS-Loading Buffer混勻，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直凝膠電泳后，300 mA電轉移至聚偏二氟乙烯膜。5%脫脂奶粉室溫封2 h，TBS洗膜后分別加抗p38 MAPK(1∶200)和p-p38 MAPK(1∶2 000)抗體(各50體)4 ℃孵育過夜，1∶2 500 辣根過氧化物酶-羊抗兔IgG單克隆抗體作為二抗孵育PVDF膜，室溫孵育2 h，ECL試劑曝光。用抗體剝脫液剝脫抗體后，按同樣的方法與抗β-actin抗體(1∶300)孵育。Quantity One軟件分析蛋白條帶。目的蛋白定量采用灰度比值(p38 MAPK/β-actin或p-p38 MAPK/β-actin)計算。p38 MAPK或p-p38 MAPK相對表達量=p38 MAPK 或p-p38 MAPK Ct值倒數/GADPH Ct值倒數。
3．p38 MAPK mRNA檢測：采用RT-PCR法檢測p38 MAPK mRNA的表達，p38 MAPK的基因引物序列由Primer5.0軟件自行設計，上游序列：5′-TCC AAGGGCTACACCAAATC-3′，下游序列：5′-TGTTCC AGGTAAGGGTGAGC-3′；擴增產物長度341 bp；內參GAPDH的上游引物序列為：5′-ACCACCATGGAGAA GGCTGG-3′，下游引物序列為：5′-GGTTTCTTACTC CTTGGAGG-3′，擴增產物長度為698 bp。收集細胞后用Trizol試劑提取細胞總RNA；按逆轉錄試劑盒(TaKaRa) 說明書逆轉錄合成cDNA，再利用引物對目的基因進行擴增，擴增后產物于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結束后在凝膠成像系統中進行分析，對各條帶的積分光密度進行測定，然后同內參GAPDH的光密度積分值進行對比，得出p38 MAPK mRNA表達的相對水平。
4．sTREM-1表達的影響：用ELISA法檢測細胞培養上清液中sTREM-1含量，操作遵照說明書進行。
三 統計學處理
采用SPSS 13.0統計學軟件分析處理，計量資料數據采用
結果
一 LPS對p38 MAPK蛋白表達的影響
100 mg/mL LPS作用1、6、12、24 h，p-p38 MAPK蛋白表達不斷增高；而從24~48 h，p-p38 MAPK蛋白表達降低。但LPS作用對p38 MAPK總蛋白表達水平無影響。結果見圖 1。
圖1
LPS對p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達的影響
二 LPS對p38 MAPK mRNA表達的影響
100 mg/mL LPS作用1、6、12、24 h，p38 MAPK mRNA表達不斷增高；而從24~48 h，p38 MAPK mRNA表達降低。結果見圖 2。
圖2
LPS對p38 MAPK mRNA表達的影響
三 SB203580對p-p38 MAPK表達的影響
SB203580可抑制p-p38 MAPK表達，而隨著SB203580濃度的增高，抑制作用更加明顯，呈明顯的濃度依賴性。結果見圖 3。
圖3
SB203580對p-38MAPK表達的影響
四 LPS對sTREM-1表達水平的影響
隨著LPS作用時間延長，sTREM-1表達水平呈時間依賴性上升。結果見圖 4。
圖4
LPS對sTREM-1表達水平的影響 ? ?圖 5 SB203580對sTREM-1表達的影響
五 SB203580對sTREM-1表達的影響
SB203580可抑制sTREM-1表達，而隨著SB203580濃度的增高，抑制作用更加明顯，呈明顯的濃度依賴性。結果見圖 5。
討論
膿毒癥的發病機制非常復雜。研究表明，感染致使機體炎癥細胞活化并產生多種促炎因子，這些因子又可引起更多炎癥細胞的激活，兩者互為因果，形成炎癥級聯反應，并且這種級聯反應逐級放大，最終導致膿毒癥的發生和發展[4]。因此，適時合理地干預炎癥反應的始動環節，是治療膿毒癥的重要目標。
sTREM-1可選擇性地表達在中性粒細胞和成熟單核、巨噬細胞上，能誘導這些細胞分泌TNF-β、IL-1β、干擾素γ等促炎細胞因子[3]；sTREM-1還可進一步作用于炎癥反應，促進炎癥因子的釋放及正反饋促進 TREM-1 表達的上調，從而引起炎性反應的增強、放大,導致過度的炎性反應[6-7]，因此，sTREM-1作為一種重要的促炎癥細胞因子，是導致膿毒癥發生發展的關鍵啟動因子，但是關于膿毒癥時調控TREM-1表達的機制尚未完全闡明。
MAPK通路是細胞應激和損傷反應的主要信號通路，它通過影響基因的轉錄和調控，調節細胞的生物學行為，其中 p38 MAPK是MAPK家族成員之一，為一高度保守的蘇氨酸酪氨酸蛋白激酶，它參與介導由細胞因子、細菌病原體及產物、應激等多種刺激引起的細胞反應，在炎癥反應中起著重要的作用[8-9]。
細胞在外界各種因素的刺激下，通過一系列細胞內信號傳導途徑使p38 MAPK的Thrl80和Tyrl82同時被磷酸化而激活，活化后的p38 MAPK(p-p38)進入細胞核內通過磷酸化作用激活包括ATF2在內的多種轉錄因子，從而導致相應炎性細胞因子基因表達的增加，最終導致各種炎性細胞因子的大量產生，引起炎癥產生。研究發現，在許多炎癥反應中，如LPS處理的巨噬細胞、TNF-噬刺激的內皮細胞、IL-18刺激的U1單核細胞株可觀察到p38 MAPK磷酸化及活化[10-12]。又有實驗觀察顯示，TNF-α、IL-1、IL-6的產生亦受p38 MAPK信號通路的調控，應用p38 MAPK抑制劑sB203580后可明顯減少炎性細胞因子的產生，減輕炎癥程度[13-15]。此外,p38 MAPK通路還參與了細胞內酶的誘導(如一氧化氮合酶和環氧酶2)，粘附因子的生成(如細胞間粘附分子1)以及促進轉錄因子磷酸化(如活性蛋白1、ATF-2、NF-κB)等過程[16]。因此，P38MAPK在細胞因子的產生過程中起著“分子開關”的作用，阻斷這條信號傳導通路可從上游減少多種炎性細胞因子的產生，從而減輕炎癥達到治療目的。
Prufer等[17]發現PI3K和p38 MAPK信號通路通過調控Ca2+從而參與TREM-1信號傳導，p38 MAPK通路的活化可增強sTREM-1的表達，而抑制p38 MAPK活化可抑制sTREM-1表達。而本研究亦發現，LPS誘導RAW264.7細胞后p-p38 MAPK及p38 MAPK mRNA表達增高，且呈時間依賴性，同時觀察到sTREM-1表達增高，表明p38 MAPK信號通路可能介導sTREM-1的表達。為明確p38 MAPK信號通路在膿毒癥中對sTREM-1的介導作用，本實驗用 p38 MAPK特異性抑制劑SB203580抑制p38 MAPK 的活化，結果顯示在抑制p38 MAPK mRNA及p-p38 MAPK表達的同時,對sTREM-1的表達具有拮抗作用，并且具有劑量依賴性。可見，p38 MAPK信號通路在LPS誘導RAW264.7細胞表達sTREM-1中可能起到關鍵作用，p38 MAPK抑制劑可能有助于減輕膿毒癥炎癥反應，這為治療膿毒癥提供了一個新的思路。
有研究表明，可溶性髓樣細胞觸發受體1(soluble triggering receptor expressed on myeloid cell-1，sTREM-1)可與下游細胞因子形成一個正反饋的自分泌調節回路，促使炎癥反應增強、放大，影響膿毒癥的發生發展[1-2]。sTREM-1是膿毒癥發病中早期關鍵炎癥介質，但其被誘導表達的信號轉導機制尚不十分清楚。p38 MAPK是控制炎癥反應的絲裂原活化蛋白激酶(mitiogen activated protein kinase，MAPK)家族的主要成員之一。ARDS、嚴重燒傷、急性胰腺炎等急危重癥發病過程中，p38 MAPK均可被激活；阻斷p38 MAPK級聯反應有助于減輕炎癥反應[3]。在膿毒癥發病過程中，p38 MAPK信號轉導通路可能影響sTREM-1的表達，本研究對此作出探討，報告如下。
材料與方法
一 材料
小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞(美國ATCC細胞庫)；脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)(Sigma公司，批號L20122880)；胰蛋白酶(Sigma公司，批號H20120116)；DMEM培養基(Gibcol BRL公司，批號FMX2012006)；p38 MAPK 特異性抑制劑SB203580(Promega公司，批號S20123400)；p38 MAPK的基因引物(上海生工生物科技有限公司合成，批號FMX2012006)；RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司，批號T20120501)；兔抗鼠p38 MAPK單克隆抗體、兔抗鼠磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)多克隆抗體、羊抗兔IgG單克隆抗體(SantaCruz公司，批號分別為SC201267166、SC2012591213、SC2012282178)；羊抗鼠IgG-HRP(華美生物工程有限公司，批號HA20121006)；小鼠sTREM-1 ELISA試劑盒(深圳晶美公司，批號JS201216521)。
二 方法
1．實驗分組：在37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中，常規培養小鼠巨噬細胞株RAW264.7，培養基選用DMEM培養液，每48 h更換1次。細胞鋪滿瓶底時傳代，調整細胞密度為106/mL，接種6孔板，無血清培養基培養，72 h后隨機分組培養：①LPS組(5 mL)： 加入終濃度為100 mg/mL的LPS培養，在加入LPS后1、6、12、24、48 h等不同時間點收集細胞；②SB+LPS組(5 mL)：加入不同終濃度為5.0、10.0、20.0 μmol/L的SB203580液預處理細胞1 h后，加入100 mg/mL LPS刺激1 h后收集細胞。
2．p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表達檢測：采用Western blott法，收集細胞經PBS洗滌2次，加入裂解液充分裂解，裂解產物12 000 r/min離心20 min，收集上清。使用BCA法測定總蛋白量。每份樣品取50 μg蛋白，加入 SDS-Loading Buffer混勻，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直凝膠電泳后，300 mA電轉移至聚偏二氟乙烯膜。5%脫脂奶粉室溫封2 h，TBS洗膜后分別加抗p38 MAPK(1∶200)和p-p38 MAPK(1∶2 000)抗體(各50體)4 ℃孵育過夜，1∶2 500 辣根過氧化物酶-羊抗兔IgG單克隆抗體作為二抗孵育PVDF膜，室溫孵育2 h，ECL試劑曝光。用抗體剝脫液剝脫抗體后，按同樣的方法與抗β-actin抗體(1∶300)孵育。Quantity One軟件分析蛋白條帶。目的蛋白定量采用灰度比值(p38 MAPK/β-actin或p-p38 MAPK/β-actin)計算。p38 MAPK或p-p38 MAPK相對表達量=p38 MAPK 或p-p38 MAPK Ct值倒數/GADPH Ct值倒數。
3．p38 MAPK mRNA檢測：采用RT-PCR法檢測p38 MAPK mRNA的表達，p38 MAPK的基因引物序列由Primer5.0軟件自行設計，上游序列：5′-TCC AAGGGCTACACCAAATC-3′，下游序列：5′-TGTTCC AGGTAAGGGTGAGC-3′；擴增產物長度341 bp；內參GAPDH的上游引物序列為：5′-ACCACCATGGAGAA GGCTGG-3′，下游引物序列為：5′-GGTTTCTTACTC CTTGGAGG-3′，擴增產物長度為698 bp。收集細胞后用Trizol試劑提取細胞總RNA；按逆轉錄試劑盒(TaKaRa) 說明書逆轉錄合成cDNA，再利用引物對目的基因進行擴增，擴增后產物于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結束后在凝膠成像系統中進行分析，對各條帶的積分光密度進行測定，然后同內參GAPDH的光密度積分值進行對比，得出p38 MAPK mRNA表達的相對水平。
4．sTREM-1表達的影響：用ELISA法檢測細胞培養上清液中sTREM-1含量，操作遵照說明書進行。
三 統計學處理
采用SPSS 13.0統計學軟件分析處理，計量資料數據采用
結果
一 LPS對p38 MAPK蛋白表達的影響
100 mg/mL LPS作用1、6、12、24 h，p-p38 MAPK蛋白表達不斷增高；而從24~48 h，p-p38 MAPK蛋白表達降低。但LPS作用對p38 MAPK總蛋白表達水平無影響。結果見圖 1。
圖1
LPS對p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達的影響
二 LPS對p38 MAPK mRNA表達的影響
100 mg/mL LPS作用1、6、12、24 h，p38 MAPK mRNA表達不斷增高；而從24~48 h，p38 MAPK mRNA表達降低。結果見圖 2。
圖2
LPS對p38 MAPK mRNA表達的影響
三 SB203580對p-p38 MAPK表達的影響
SB203580可抑制p-p38 MAPK表達，而隨著SB203580濃度的增高，抑制作用更加明顯，呈明顯的濃度依賴性。結果見圖 3。
圖3
SB203580對p-38MAPK表達的影響
四 LPS對sTREM-1表達水平的影響
隨著LPS作用時間延長，sTREM-1表達水平呈時間依賴性上升。結果見圖 4。
圖4
LPS對sTREM-1表達水平的影響 ? ?圖 5 SB203580對sTREM-1表達的影響
五 SB203580對sTREM-1表達的影響
SB203580可抑制sTREM-1表達，而隨著SB203580濃度的增高，抑制作用更加明顯，呈明顯的濃度依賴性。結果見圖 5。
討論
膿毒癥的發病機制非常復雜。研究表明，感染致使機體炎癥細胞活化并產生多種促炎因子，這些因子又可引起更多炎癥細胞的激活，兩者互為因果，形成炎癥級聯反應，并且這種級聯反應逐級放大，最終導致膿毒癥的發生和發展[4]。因此，適時合理地干預炎癥反應的始動環節，是治療膿毒癥的重要目標。
sTREM-1可選擇性地表達在中性粒細胞和成熟單核、巨噬細胞上，能誘導這些細胞分泌TNF-β、IL-1β、干擾素γ等促炎細胞因子[3]；sTREM-1還可進一步作用于炎癥反應，促進炎癥因子的釋放及正反饋促進 TREM-1 表達的上調，從而引起炎性反應的增強、放大,導致過度的炎性反應[6-7]，因此，sTREM-1作為一種重要的促炎癥細胞因子，是導致膿毒癥發生發展的關鍵啟動因子，但是關于膿毒癥時調控TREM-1表達的機制尚未完全闡明。
MAPK通路是細胞應激和損傷反應的主要信號通路，它通過影響基因的轉錄和調控，調節細胞的生物學行為，其中 p38 MAPK是MAPK家族成員之一，為一高度保守的蘇氨酸酪氨酸蛋白激酶，它參與介導由細胞因子、細菌病原體及產物、應激等多種刺激引起的細胞反應，在炎癥反應中起著重要的作用[8-9]。
細胞在外界各種因素的刺激下，通過一系列細胞內信號傳導途徑使p38 MAPK的Thrl80和Tyrl82同時被磷酸化而激活，活化后的p38 MAPK(p-p38)進入細胞核內通過磷酸化作用激活包括ATF2在內的多種轉錄因子，從而導致相應炎性細胞因子基因表達的增加，最終導致各種炎性細胞因子的大量產生，引起炎癥產生。研究發現，在許多炎癥反應中，如LPS處理的巨噬細胞、TNF-噬刺激的內皮細胞、IL-18刺激的U1單核細胞株可觀察到p38 MAPK磷酸化及活化[10-12]。又有實驗觀察顯示，TNF-α、IL-1、IL-6的產生亦受p38 MAPK信號通路的調控，應用p38 MAPK抑制劑sB203580后可明顯減少炎性細胞因子的產生，減輕炎癥程度[13-15]。此外,p38 MAPK通路還參與了細胞內酶的誘導(如一氧化氮合酶和環氧酶2)，粘附因子的生成(如細胞間粘附分子1)以及促進轉錄因子磷酸化(如活性蛋白1、ATF-2、NF-κB)等過程[16]。因此，P38MAPK在細胞因子的產生過程中起著“分子開關”的作用，阻斷這條信號傳導通路可從上游減少多種炎性細胞因子的產生，從而減輕炎癥達到治療目的。
Prufer等[17]發現PI3K和p38 MAPK信號通路通過調控Ca2+從而參與TREM-1信號傳導，p38 MAPK通路的活化可增強sTREM-1的表達，而抑制p38 MAPK活化可抑制sTREM-1表達。而本研究亦發現，LPS誘導RAW264.7細胞后p-p38 MAPK及p38 MAPK mRNA表達增高，且呈時間依賴性，同時觀察到sTREM-1表達增高，表明p38 MAPK信號通路可能介導sTREM-1的表達。為明確p38 MAPK信號通路在膿毒癥中對sTREM-1的介導作用，本實驗用 p38 MAPK特異性抑制劑SB203580抑制p38 MAPK 的活化，結果顯示在抑制p38 MAPK mRNA及p-p38 MAPK表達的同時,對sTREM-1的表達具有拮抗作用，并且具有劑量依賴性。可見，p38 MAPK信號通路在LPS誘導RAW264.7細胞表達sTREM-1中可能起到關鍵作用，p38 MAPK抑制劑可能有助于減輕膿毒癥炎癥反應，這為治療膿毒癥提供了一個新的思路。
