引用本文： 趙振宇, 王德明, 肖繼. miR-33s通過靶向p38 MAPK負性調節LPS誘導的炎癥反應. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(2): 157-160. doi: 10.7507/1671-6205.2015040 復制
microRNA(miRNA,miR)是一類進化上高度保守的內源性非編碼RNA分子，由21～25個核苷酸組成[1]。miRNA通過特異的堿基配對方式結合到靶基因mRNA的3′末端非編碼區，從而誘導靶基因mRNA的降解或抑制其翻譯，在轉錄后水平調節靶基因的表達[2]。miRNA在調節固有免疫和適應性免疫細胞的成熟、增殖、分化和活化發揮著重要作用[3]。先前的研究表明，miR-33a可以通過靶向結合ABCA1，沉默其表達，抑制載脂蛋白A1介導的膽固醇流出[4-5]。在調控炎癥反應這方面，miR-33s也可能起著關鍵的作用[5-6]。通過生物信息學分析，我們發現p38 MAPK 是miR-33s的一個潛在靶點。本實驗將miR-33s擬似物(mimic)和miR-33s抑制劑(inhibitor)分別導入THP-1細胞內，人為上調或下調細胞內miR-33的表達水平，進而觀察細胞p38 MAPK蛋白表達及細胞炎癥因子分泌的變化來探討其調控機制，以闡明miR-33s這種抑制作用主要是通過它的“seed suquence”作用于p38 MAPK 的 3′-URT來阻斷p38 MAPK級聯從而減輕炎癥反應。目前相關miR-33的研究主要以調控脂質代謝為主[5]，而在調控炎癥方面的研究較少，本實驗為負性調控巨噬細胞提供新靶點,以及治療膿毒癥提供新思路。
材料與方法
一 材料
細胞系人單核細胞系細胞株THP-1購自中科院上海細胞生物所細胞中心。實驗試劑脂多糖[LPS(from Escherichia coli 055:B5)]購自美國Sigma公司，RPMI-1640培養基DMEM培養基Opti-MEM培養基胎牛血清-巰基乙醇購自美國Gibco公司。miR-33s擬似物mimic和miR-33s inhibitor購自上海吉瑪制藥技術有限公司。TransIT-X2? Dynamic Delivery System轉染試劑購自Miru公司。磷酸化的p38 MAPK 抗體、β-actin抗體購自Cell Signaling Technology,Inc。辣根過氧化物酶標記的二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6) ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。
二 方法
1．THP-1-單核細胞培養及傳代方法：將THP-1-單核細胞置于含10%胎血清的RPMI-1640培養基中，于37 ℃ 5% CO2培養箱靜置培養。在培養液中加入10 mmol/L 的羥乙基哌秦乙硫磺酸(HEPES)和青霉素、鏈霉素各1.0×105 U/L。將THP-1單核細胞復蘇后，按照懸浮細胞培養的方法傳至3~6代后用于實驗。
2．LPS誘導：THP-1-單核細胞分別以工作濃度為10.0 ng/mL的LPS誘導THP-1-單核細胞，用溶解LPS的磷酸鹽緩沖液 (0 ng/mL LPS) 誘導THP-1細胞作空白對照，LPS誘導作用的時間為24 h。
3．過表達miR-33s實驗分組及處理：①空白組: 采用等量磷酸鹽緩沖液處理THP-1-單核細胞;②NC組: 轉染mimic雙鏈RNA至THP-1-單核細胞24 h;③miR-33s mimic組: 轉染miR-33s mimic至THP-1-單核細胞24 h。
4．抑制miR-33s表達的實驗分組及處理：①INC組: 轉染inhibitor單鏈RNA至THP-1-單核細胞24 h; ②miR-33s inhibitor 組: 轉染miR-33s至THP-1-單核細胞24 h。再以濃度為10.0 ng/mL的LPS誘導以上兩組細胞24 h。
5．寡核苷酸序列設計與合成：miR-33s成熟體雙鏈mimic是根據has-miR-33s家族成員的成熟體序列合成。miR-33s inhibitor則采用miR-33s家族成員成熟體的反向互補序列，并對所有堿基都進行了2′甲氧修飾。負對照雙鏈RNA序列由上海吉瑪生物公司合成，與所有哺乳動物的基因組沒有同源性; 負對照單鏈RNA序列來自線蟲，不與任何已知哺乳動物miRNA序列相匹配。
6．細胞轉染取對數生長期細胞進行細胞轉染：使用miRNA轉染試劑TransIT-X2? Dynamic Delivery System轉染細胞。將細胞密度為(8~10)×105 個/孔的THP-1-單核細胞細胞接種于含有2 mLRPMI-1640完全培養基的6板中，并置于37 ℃ 5% CO2培養箱過夜。將6.8 μL濃度為10 μmol/L的miRNA稀釋于250 μL Opti-MEMI無血清培養基中，并加入7.5 μL TransIT-X2? Dynamic Delivery System轉染試劑，輕柔混勻，室溫孵育20 min。將miRNA TransIT-X2? Dynamic Delivery System混合液加入含有細胞以及培養液的6孔板各孔中，并將培養板置于37 ℃的CO2培養箱中培養24 h。各板孔培養基中的miRNA終濃度為25 nmol/L。
7．RFQ-PCR 檢測細胞中 miR-33s的表達：收集未轉染的THP-1-單核細胞以及轉染miR-33s mimic和miR-33s inhibitor 24 h 后的THP-1-單核細胞，按TRIzol試劑盒說明書提取細胞總RNA，并按Invitrogen逆轉錄反應試劑盒說明書合成cDNA，反應產物置于－20 ℃保存備用或立即進行PCR擴增; cDNA 合成過程中采用miR-33s RT特異性物構建反轉錄體系,miR-33s RT引物序列為: 5′-GTC GTA TCC AGT GCG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TGC ACT GGA TAC GAC UUC ACG-3′; 內參照U6 RT=引物序列為: 5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。PCR過程按Invitrogen的M-MLVPlatinum 定量PCRSuperMix-UDG 試劑盒說明書在ABI7500熒光定量PCR儀上進行，使用U6作為內參照同時進行PCR。miR-33s正向引物序列5′-GGT TAG ATC TTG CTC CAG CGG TTT G-3′，反引物序列5′-GTA AAG CTT GCC CTC CTG TTT CCT G-3′，內參照U 6 正向引物序列為: 5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAAT-3′,反向引物序列為: 5′-CGC TTC ACG AAT TT GCG TGT CAT-3′。獲得Ct 值后，應用比較Ct 法進行相對定量，目標基因的相對定量用2－ΔΔCt計算。
8．Western blot法檢測轉染后細胞p38MAPK 蛋白表達的改變：收集轉染后 72 h 后的細胞,PBS洗滌 2次; 加 150 μL細胞裂解液于4 ℃裂解30 min 后,12 000 g 離心10 min,取上清液,采用 Bradford 法測定蛋白質的濃度。以β-actin的水平作為等量蛋白質上樣對照(空白對照組),每個樣本至少重復3遍。取60 μg蛋白質樣品進行 SDS-PAGE 電泳,轉至硝酸纖維膜上;室溫封閉 2 h 后,用含0.05 %Tween-20的 TBS 緩沖液漂洗3次,每次10 min; 加入相應的p38 MAPK 單克隆抗體(1∶800),4 ℃孵育過夜,TBST 漂洗 3次后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗 (1∶5 000),37 ℃搖床溫育 2 h,ECL 顯色系統顯色。最后經 ECL 系統曝光顯影,通過凝膠分析系統分析蛋白的表達。
9．ELISA法檢測細胞培養液中IL-1β釋放量：收集經前述處理后的細胞懸液，1 500 r/min離心20 min，收集細胞培養液上清液，按照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測細胞培養液中IL-1β、TNF-α、IL-6的釋放量。
三 統計學處理
應用 SPSS 16.0 統計軟件進行統計分析,計量數據以
結果
一 miR-33s在細胞中的表達變化
RFQ-PCR檢測結果顯示,空白組miR-33s的相對表達量是352.00±85.56，miR-33s mimic轉染組miR-33s的相對表達量是215 896.64±16 785.36,NC組miR-33s的相對表達量是420.68±78.43,miR-33s inhibitor組miR-33s的相對表達量是10.38±1.58,INC組miR-33s的相對表達量是287.97±16.05。各組的差異有統計學意義(P<0.05)，提示轉染成功。
二 Western blot檢測細胞 p38 MAPK 的蛋白表達
以空白對照組的灰度值為1,miR-33s mimic組、NC組、miR-33s inhibitor組、INC組的灰度值分別是0.330±0.021、0.890±0.017、3.128±0.069、0.920±0.026。與對照組和miR-33s inhibitor轉染組組相比,miR-33s mimic轉染組能明顯降低p38 MAPK 蛋白表達水平 (P<0.005)。
圖1
各組細胞的 Western blot分析
A:miR-33s mimic組; B:NC組; C:miR-33s inhibitor組;D: INC組;E:空白組
三 miR-33s對THP-1細胞釋放炎癥因子的影響
miR-33 mimic轉染組細胞培養液中TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放量降低，與NC組比較差異有統計學意義(P<0.05)。miR-33s inhibitor組轉染組細胞培養液中TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放量明顯升高，與INC組相比有顯著性差異(P<0.05)。NC組，INC組中TNF-α、IL-6、IL-1β釋放量較空白組相比差異無統計學意義(P>0.05)。
表2
各組THP-1細胞炎癥因子釋放量比較(pg/mL)
討論
膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應，與全身炎癥反應綜合征(SIRS)密切相關[7]。正常的機體炎癥反應是一種對損傷因子的防御性反應，它可以防止組織損傷擴大，促進組織修復，是機體修復和生存所必需的。而過度的炎癥反應會形成炎癥瀑布效應，甚至使炎癥反應失去控制，最終導致以細胞自身性破壞為特征的全身性炎癥反應[8]。在各種炎癥反應中，單核細胞的作用顯著，在炎癥早期，革蘭陰性細菌胞壁成分之一LPS能刺激單核-巨噬細胞產生大量的炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)，促進膿毒癥的發展[9]。
P-p38 MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族中的成員之一，在炎癥反應中具有重要作用[10]。p38信號通路與炎癥關系密切，它通過非磷酸化轉化為磷酸化狀態促進下游底物的磷酸化，從而活化下游底物轉錄因子ATF2、MEF2C,后兩者的激活引起前炎癥因子TNF-α、IL-1β釋放增加[11]。LPS 是促進p38 MAPK 激活、產生炎癥介質的強激活物，它通過與結合蛋白 (LP SBP) 相結合,形成 LPS-LPS BP 復合體,再與單核巨噬細面的 CD14 分子結合,激活p38信號通路，從而促發炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-1β) 的大量產生。
近年來研究發現miRNA可以在免疫細胞分化、免疫細胞信號轉導、固有免疫應答和適應性免疫應答等多個層面對免疫反應進行調控[12-13]。Ho等[14]研究發現，miR-33可以靶向沉默RIP140抑制IL-1β和TNF-α等炎癥因子的釋放。RIP140作為一種轉錄輔抑制因子，可激活核因子κB (NF-κB)信號通路，調控炎癥因子的表達[15]。一個miRNA可能有多個靶基因，因此我們推測miR-33在調節炎癥因子的表達存在多個多個靶基因。通過生物信息學分析，我們發現p38 MAPK也是其中一個潛在的靶基因，這提示miR-33也可以通過靶向沉默p38 MAPK來調控炎癥因子的釋放。
本實驗通過轉染miR-33s的擬似物mimic 24 h后，使THP-1細胞過表達miR-33s，然后檢測細胞p38MAPK濃度及炎癥因子釋放量，結果顯示，其p38MAPK蛋白表達以及TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放量均較NC組明顯降低(P<0.05)，提示過表達miR-33s可以通過抑制單核巨噬細胞p38信號通路，從而抑制炎癥因子的釋放。本實驗還通過轉染miR-33s inhibitor抑制miR-33s的表達，模擬miR-33s功能缺失實驗，來觀察抑制miR-33s的表達對炎癥的作用。結果顯示，抑制miR-33s的表達，其細胞的p38 MAPK蛋白表達以及TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放量均較INC組明顯升高(P<0.05)。抑制miR-33s的表達對LPS誘導的炎癥因子釋放存在促進作用。我們從正反兩方面論證了miR-33可能是通過靶向沉默P38MAPK，抑制炎癥因子信號通路，負性調控THP-1細胞炎癥因子的分泌。
本實驗結果表明，過表達單核細胞內miR-33抑制炎癥因子表達，抑制miR-33的表達則會促進炎癥因子的表達，其可能的作用機制是通過調控p38MAPK信號轉導通路來實現的。盡管脂質代謝中miR-33的調控功能已經得到證實[5, 16]，但是在調控炎癥方面的研究很少。miR-33在調控單核細胞炎癥反應中是否還存在其它的調控通路，還有待進一步研究。隨著人們對miR-33與炎癥調控關系的進一步研究，這將為膿毒血癥的預防和治療提供一個新的途徑。
microRNA(miRNA,miR)是一類進化上高度保守的內源性非編碼RNA分子，由21～25個核苷酸組成[1]。miRNA通過特異的堿基配對方式結合到靶基因mRNA的3′末端非編碼區，從而誘導靶基因mRNA的降解或抑制其翻譯，在轉錄后水平調節靶基因的表達[2]。miRNA在調節固有免疫和適應性免疫細胞的成熟、增殖、分化和活化發揮著重要作用[3]。先前的研究表明，miR-33a可以通過靶向結合ABCA1，沉默其表達，抑制載脂蛋白A1介導的膽固醇流出[4-5]。在調控炎癥反應這方面，miR-33s也可能起著關鍵的作用[5-6]。通過生物信息學分析，我們發現p38 MAPK 是miR-33s的一個潛在靶點。本實驗將miR-33s擬似物(mimic)和miR-33s抑制劑(inhibitor)分別導入THP-1細胞內，人為上調或下調細胞內miR-33的表達水平，進而觀察細胞p38 MAPK蛋白表達及細胞炎癥因子分泌的變化來探討其調控機制，以闡明miR-33s這種抑制作用主要是通過它的“seed suquence”作用于p38 MAPK 的 3′-URT來阻斷p38 MAPK級聯從而減輕炎癥反應。目前相關miR-33的研究主要以調控脂質代謝為主[5]，而在調控炎癥方面的研究較少，本實驗為負性調控巨噬細胞提供新靶點,以及治療膿毒癥提供新思路。
材料與方法
一 材料
細胞系人單核細胞系細胞株THP-1購自中科院上海細胞生物所細胞中心。實驗試劑脂多糖[LPS(from Escherichia coli 055:B5)]購自美國Sigma公司，RPMI-1640培養基DMEM培養基Opti-MEM培養基胎牛血清-巰基乙醇購自美國Gibco公司。miR-33s擬似物mimic和miR-33s inhibitor購自上海吉瑪制藥技術有限公司。TransIT-X2? Dynamic Delivery System轉染試劑購自Miru公司。磷酸化的p38 MAPK 抗體、β-actin抗體購自Cell Signaling Technology,Inc。辣根過氧化物酶標記的二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6) ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。
二 方法
1．THP-1-單核細胞培養及傳代方法：將THP-1-單核細胞置于含10%胎血清的RPMI-1640培養基中，于37 ℃ 5% CO2培養箱靜置培養。在培養液中加入10 mmol/L 的羥乙基哌秦乙硫磺酸(HEPES)和青霉素、鏈霉素各1.0×105 U/L。將THP-1單核細胞復蘇后，按照懸浮細胞培養的方法傳至3~6代后用于實驗。
2．LPS誘導：THP-1-單核細胞分別以工作濃度為10.0 ng/mL的LPS誘導THP-1-單核細胞，用溶解LPS的磷酸鹽緩沖液 (0 ng/mL LPS) 誘導THP-1細胞作空白對照，LPS誘導作用的時間為24 h。
3．過表達miR-33s實驗分組及處理：①空白組: 采用等量磷酸鹽緩沖液處理THP-1-單核細胞;②NC組: 轉染mimic雙鏈RNA至THP-1-單核細胞24 h;③miR-33s mimic組: 轉染miR-33s mimic至THP-1-單核細胞24 h。
4．抑制miR-33s表達的實驗分組及處理：①INC組: 轉染inhibitor單鏈RNA至THP-1-單核細胞24 h; ②miR-33s inhibitor 組: 轉染miR-33s至THP-1-單核細胞24 h。再以濃度為10.0 ng/mL的LPS誘導以上兩組細胞24 h。
5．寡核苷酸序列設計與合成：miR-33s成熟體雙鏈mimic是根據has-miR-33s家族成員的成熟體序列合成。miR-33s inhibitor則采用miR-33s家族成員成熟體的反向互補序列，并對所有堿基都進行了2′甲氧修飾。負對照雙鏈RNA序列由上海吉瑪生物公司合成，與所有哺乳動物的基因組沒有同源性; 負對照單鏈RNA序列來自線蟲，不與任何已知哺乳動物miRNA序列相匹配。
6．細胞轉染取對數生長期細胞進行細胞轉染：使用miRNA轉染試劑TransIT-X2? Dynamic Delivery System轉染細胞。將細胞密度為(8~10)×105 個/孔的THP-1-單核細胞細胞接種于含有2 mLRPMI-1640完全培養基的6板中，并置于37 ℃ 5% CO2培養箱過夜。將6.8 μL濃度為10 μmol/L的miRNA稀釋于250 μL Opti-MEMI無血清培養基中，并加入7.5 μL TransIT-X2? Dynamic Delivery System轉染試劑，輕柔混勻，室溫孵育20 min。將miRNA TransIT-X2? Dynamic Delivery System混合液加入含有細胞以及培養液的6孔板各孔中，并將培養板置于37 ℃的CO2培養箱中培養24 h。各板孔培養基中的miRNA終濃度為25 nmol/L。
7．RFQ-PCR 檢測細胞中 miR-33s的表達：收集未轉染的THP-1-單核細胞以及轉染miR-33s mimic和miR-33s inhibitor 24 h 后的THP-1-單核細胞，按TRIzol試劑盒說明書提取細胞總RNA，并按Invitrogen逆轉錄反應試劑盒說明書合成cDNA，反應產物置于－20 ℃保存備用或立即進行PCR擴增; cDNA 合成過程中采用miR-33s RT特異性物構建反轉錄體系,miR-33s RT引物序列為: 5′-GTC GTA TCC AGT GCG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TGC ACT GGA TAC GAC UUC ACG-3′; 內參照U6 RT=引物序列為: 5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。PCR過程按Invitrogen的M-MLVPlatinum 定量PCRSuperMix-UDG 試劑盒說明書在ABI7500熒光定量PCR儀上進行，使用U6作為內參照同時進行PCR。miR-33s正向引物序列5′-GGT TAG ATC TTG CTC CAG CGG TTT G-3′，反引物序列5′-GTA AAG CTT GCC CTC CTG TTT CCT G-3′，內參照U 6 正向引物序列為: 5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAAT-3′,反向引物序列為: 5′-CGC TTC ACG AAT TT GCG TGT CAT-3′。獲得Ct 值后，應用比較Ct 法進行相對定量，目標基因的相對定量用2－ΔΔCt計算。
8．Western blot法檢測轉染后細胞p38MAPK 蛋白表達的改變：收集轉染后 72 h 后的細胞,PBS洗滌 2次; 加 150 μL細胞裂解液于4 ℃裂解30 min 后,12 000 g 離心10 min,取上清液,采用 Bradford 法測定蛋白質的濃度。以β-actin的水平作為等量蛋白質上樣對照(空白對照組),每個樣本至少重復3遍。取60 μg蛋白質樣品進行 SDS-PAGE 電泳,轉至硝酸纖維膜上;室溫封閉 2 h 后,用含0.05 %Tween-20的 TBS 緩沖液漂洗3次,每次10 min; 加入相應的p38 MAPK 單克隆抗體(1∶800),4 ℃孵育過夜,TBST 漂洗 3次后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗 (1∶5 000),37 ℃搖床溫育 2 h,ECL 顯色系統顯色。最后經 ECL 系統曝光顯影,通過凝膠分析系統分析蛋白的表達。
9．ELISA法檢測細胞培養液中IL-1β釋放量：收集經前述處理后的細胞懸液，1 500 r/min離心20 min，收集細胞培養液上清液，按照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測細胞培養液中IL-1β、TNF-α、IL-6的釋放量。
三 統計學處理
應用 SPSS 16.0 統計軟件進行統計分析,計量數據以
結果
一 miR-33s在細胞中的表達變化
RFQ-PCR檢測結果顯示,空白組miR-33s的相對表達量是352.00±85.56，miR-33s mimic轉染組miR-33s的相對表達量是215 896.64±16 785.36,NC組miR-33s的相對表達量是420.68±78.43,miR-33s inhibitor組miR-33s的相對表達量是10.38±1.58,INC組miR-33s的相對表達量是287.97±16.05。各組的差異有統計學意義(P<0.05)，提示轉染成功。
二 Western blot檢測細胞 p38 MAPK 的蛋白表達
以空白對照組的灰度值為1,miR-33s mimic組、NC組、miR-33s inhibitor組、INC組的灰度值分別是0.330±0.021、0.890±0.017、3.128±0.069、0.920±0.026。與對照組和miR-33s inhibitor轉染組組相比,miR-33s mimic轉染組能明顯降低p38 MAPK 蛋白表達水平 (P<0.005)。
圖1
各組細胞的 Western blot分析
A:miR-33s mimic組; B:NC組; C:miR-33s inhibitor組;D: INC組;E:空白組
三 miR-33s對THP-1細胞釋放炎癥因子的影響
miR-33 mimic轉染組細胞培養液中TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放量降低，與NC組比較差異有統計學意義(P<0.05)。miR-33s inhibitor組轉染組細胞培養液中TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放量明顯升高，與INC組相比有顯著性差異(P<0.05)。NC組，INC組中TNF-α、IL-6、IL-1β釋放量較空白組相比差異無統計學意義(P>0.05)。
表2
各組THP-1細胞炎癥因子釋放量比較(pg/mL)
討論
膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應，與全身炎癥反應綜合征(SIRS)密切相關[7]。正常的機體炎癥反應是一種對損傷因子的防御性反應，它可以防止組織損傷擴大，促進組織修復，是機體修復和生存所必需的。而過度的炎癥反應會形成炎癥瀑布效應，甚至使炎癥反應失去控制，最終導致以細胞自身性破壞為特征的全身性炎癥反應[8]。在各種炎癥反應中，單核細胞的作用顯著，在炎癥早期，革蘭陰性細菌胞壁成分之一LPS能刺激單核-巨噬細胞產生大量的炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)，促進膿毒癥的發展[9]。
P-p38 MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族中的成員之一，在炎癥反應中具有重要作用[10]。p38信號通路與炎癥關系密切，它通過非磷酸化轉化為磷酸化狀態促進下游底物的磷酸化，從而活化下游底物轉錄因子ATF2、MEF2C,后兩者的激活引起前炎癥因子TNF-α、IL-1β釋放增加[11]。LPS 是促進p38 MAPK 激活、產生炎癥介質的強激活物，它通過與結合蛋白 (LP SBP) 相結合,形成 LPS-LPS BP 復合體,再與單核巨噬細面的 CD14 分子結合,激活p38信號通路，從而促發炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-1β) 的大量產生。
近年來研究發現miRNA可以在免疫細胞分化、免疫細胞信號轉導、固有免疫應答和適應性免疫應答等多個層面對免疫反應進行調控[12-13]。Ho等[14]研究發現，miR-33可以靶向沉默RIP140抑制IL-1β和TNF-α等炎癥因子的釋放。RIP140作為一種轉錄輔抑制因子，可激活核因子κB (NF-κB)信號通路，調控炎癥因子的表達[15]。一個miRNA可能有多個靶基因，因此我們推測miR-33在調節炎癥因子的表達存在多個多個靶基因。通過生物信息學分析，我們發現p38 MAPK也是其中一個潛在的靶基因，這提示miR-33也可以通過靶向沉默p38 MAPK來調控炎癥因子的釋放。
本實驗通過轉染miR-33s的擬似物mimic 24 h后，使THP-1細胞過表達miR-33s，然后檢測細胞p38MAPK濃度及炎癥因子釋放量，結果顯示，其p38MAPK蛋白表達以及TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放量均較NC組明顯降低(P<0.05)，提示過表達miR-33s可以通過抑制單核巨噬細胞p38信號通路，從而抑制炎癥因子的釋放。本實驗還通過轉染miR-33s inhibitor抑制miR-33s的表達，模擬miR-33s功能缺失實驗，來觀察抑制miR-33s的表達對炎癥的作用。結果顯示，抑制miR-33s的表達，其細胞的p38 MAPK蛋白表達以及TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放量均較INC組明顯升高(P<0.05)。抑制miR-33s的表達對LPS誘導的炎癥因子釋放存在促進作用。我們從正反兩方面論證了miR-33可能是通過靶向沉默P38MAPK，抑制炎癥因子信號通路，負性調控THP-1細胞炎癥因子的分泌。
本實驗結果表明，過表達單核細胞內miR-33抑制炎癥因子表達，抑制miR-33的表達則會促進炎癥因子的表達，其可能的作用機制是通過調控p38MAPK信號轉導通路來實現的。盡管脂質代謝中miR-33的調控功能已經得到證實[5, 16]，但是在調控炎癥方面的研究很少。miR-33在調控單核細胞炎癥反應中是否還存在其它的調控通路，還有待進一步研究。隨著人們對miR-33與炎癥調控關系的進一步研究，這將為膿毒血癥的預防和治療提供一個新的途徑。
