引用本文： 王正彪, 武怡. 哮喘及呼吸道合胞病毒感染小鼠的神經生長因子、白血病抑制因子的表達及地塞米松的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(2): 147-151. doi: 10.7507/1671-6205.2015038 復制
支氣管哮喘(簡稱哮喘)是最常見的慢性呼吸道疾病，其發病機制較為復雜。接觸過敏原，理化刺激，劇烈運動,呼吸道感染等多種因素可以誘發并加重哮喘，其中病毒性呼吸道感染是哮喘急性發作的常見誘因。有報道稱，約30％～80％的哮喘急性發作病例中，病毒感染發揮了作用。在常見的病毒感染中呼吸道合胞病毒(RSV)感染占主導地位，RSV是嬰幼兒呼吸道感染最為常見的病原之一,研究證實RSV感染可引起毛細支氣管炎，向哮喘轉化[1-2]，是導致兒童哮喘發生的高危因素。目前有關RSV感染引起哮喘的發病機制尚不明確，有研究證實，豚鼠感染RSV后，其氣道高反應性明顯增加[3-4]。有研究表明，氣道的感覺神經及其營養因子可能與氣道炎癥的形成密切關聯，神經生長因子(nerve grow factor，NGF)及白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等神經營養因子在氣道炎癥模型肺組織內表達明顯升高，且能使神經激肽受體-1(neurokin receptor-1，NK-1R)等速激肽類物質表達增高，從而引發氣道炎癥性反應[5-6]，提示NGF、LIF是參與及調控氣道神經源性炎癥的重要炎癥因子。本研究主要探討Balb/c小鼠感染RSV后肺組織的NGF、LIF表達變化及與哮喘的關系，同時研究地塞米松對其表達是否存在影響，從而為哮喘的臨床預防與治療提供新思路。
材料與方法
一 材料
1．動物及主要試劑：清潔級健康雌性Balb/c純系小鼠，6~8周齡，體質量(22±2) g，由徐州醫學院實驗動物中心提供；293-T人胚腎細胞株及RSV A2 標準株均由山東醫學科學院微生物教研室孟紅老師惠贈；HyClone改良型RPMI-1640培養基及HyClone胎牛血清均購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司；雞卵白蛋白(OVA)由美國Sigma公司提供；佐劑氫氧化鋁 Al(OH)3干粉由上海生物工程有限公司提供；TRNzol總RNA提取試劑、TIANSscript cDNA第一鏈合成試劑盒及2×TaqRCR Master Mix均購自天根生物科技(北京)有限公司；NGF mRNA引物、LIF mRNA引物及GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設計及合成；免抗NGF beta(免疫組化)由武漢博士德生物工程有限公司提供；免抗LIF(免疫組化)由北京博奧森生物技術有限公司提供;濃縮型二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒及兔超敏二步法檢測試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
2．細胞和病毒：293-T人胚腎細胞株在含20 mL/L滅活胎牛血清的RPMI-1640培養基中37 ℃，50 mL/L CO2條件下培養，待生長成單層貼壁細胞后，將RSV病毒接種293-T細胞,繼續在含20 mL/L滅活胎牛血清的RPMI-1640培養基的維持液中培養，待細胞病變達100%時收集病毒，反復凍融、離心，收集RSV上清。
二 方法
1．實驗分組及動物模型：參照國內外模型制作方法[7-8]。健康雌性Balb/c小鼠100只，采用隨機數字表法分為5組,分別為正常對照組，RSV組，哮喘組，哮喘合并RSV組，地塞米松組，每組20只。正常對照組：于第1、14 d予以生理鹽水0.2 mL腹腔注射，第21~25 d用37 ℃生理鹽水20 mL霧化吸入30 min。哮喘組：于第1、14 d予以OVA/AL(OH)3 [含OVA100 μg，AL(OH)3 2 mg]腹腔注射，第21 d開始激發，以2%OVA生理鹽水20 mL霧化30 min，持續激發5 d。RSV組：于第19、20、21天，取TCID50 10-6.5/mL的RSV病毒懸液100 μL，緩慢滴入鼻腔[9-10]。哮喘合并RSV組：模型制備同哮喘組，第19、20、21 d，以TCID5010-6.5/ mL的RSV病毒懸液100 μL鼻腔滴入。地塞米松組：RSV感染同RSV組，于21~25 d予腹腔注入地塞米松0.2 mg·kg-1·d-1。
2．標本收集：末次激發后24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg)。麻醉后，無菌條件下，眼科鑷分離出兩側肺組織，取左肺下葉，-80 ℃冰箱凍存，用于肺組織病毒鑒定。將右肺下葉迅速凍存，留待勻漿后進行逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。4%甲醛固定液固定右肺中葉和左肺上葉肺組織分別置于標記好的4%甲醛中過夜固定，留待做石蠟切片、HE染色、免疫組化，觀察肺組織病理改變及NGF及LIF的變化。
3．肺組織病理學檢查：小鼠處死后，4%多聚甲醛固定24 h,脫水、透明、浸蠟及包埋，切片行HE染色，在400倍光鏡下觀察肺組織病變和炎性細胞浸潤等病理改變。
4．肺組織RSV mRNA、NGF mRNA及LIF mRNA 表達檢測：采用RT-PCR。各實驗組同時進行RT-PCR。TRNzol液提取細胞總RNA,具體操作按說明書進行，紫外分光光度計(A260/A280)檢測RNA純度及完整性，按說明書步驟逆轉錄mRNA為cDNA。RSV引物：上游序列(5′→3′)TGGAGCCTCAGA TCATCCCA，下游序列(5′→3′)TGATTTTGCCTGG CGTGTTG，片段長度為153 bp；NGF引物：上游序列(5′→3′)GTCAGTGTGTGGGTTGGAGA，下游序列(5′→3′)TTCTTGTAGCCTTCCTGCTG，片段長度304 bp；LIF引物：上游序列(5′→3′)TGCTTGCTGGGT GTATGAAC，下游序列(5′→3′)TTCTGTGGGAGCCT GAACA，片段長度356 bp；GAPDH引物：上游序列(5′→3′)CCTTCATTGACCTCAACTACA，下游序列(5′→3′)CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC，片段長度215 bp。反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性 45 s，58 ℃(RSV)/58.8 ℃(NGF)/57 ℃(LIF)/60 ℃(GAPDH)，退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環，最后72 ℃延伸5 min。擴增產物于瓊脂糖凝膠上電泳。凝膠成像分析系統測定目的基因產物與內參照基因產物的比值，半定量方法分析目的基因的表達。
5．免疫組化化學方法檢測各組肺組織NGF及LIF的表達：石蠟切片恒溫箱烤片后，經二甲苯脫蠟、梯度酒精復水，滴加3%H2O2室溫孵育15 min滅活內源性過氧化物酶，PBS緩沖液浸泡沖洗3次，浸入0.01 mol/L檸檬酸枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)，微波爐熱修復抗原，冷卻至室溫后，PBS緩沖液浸泡清洗2次，繼之兔超敏二步法(Polink-2 plus)進行免疫組織化學反應：(1)滴加兔抗小鼠NGF、LIF抗體稀釋液(工作濃度1∶100)，4 ℃過夜，(2)滴加試劑Polymer Helper,37 ℃孵育15 min，(3)滴加試劑poly-HRP anti-Rabbit IgG，37 ℃孵育15 min。以上每一步驟之后均用PBS浸泡沖洗3次，每次5 min。最后用DAB法顯色，顯微鏡下控制反應，適時終止。蘇木素輕度復染，1%鹽酸分化數秒，飽和碳酸鋰返藍1 min,常規脫水、透明及中性樹膠(DPX)封固，光鏡觀察。陰性對照用PBS代替上述一抗進行反應。以細胞漿棕黃色為陽性，采用圖像分析軟件對NGF及LIF陽性部位進行測定。
三 統計學處理
采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析。計量資料以
結果
一 一般情況
經致敏和激發后，哮喘組和哮喘合并RSV組小鼠出現煩躁不安，縮頭弓背，抓撓頭面部，前肢縮抬，呼吸急促，偶爾咳嗽等表現；RSV組小鼠滴鼻后第3 d 出現煩躁不安，第6 d表現明顯，出現呼吸急促，易激惹，食欲不佳；地塞米松組小鼠癥狀表現較輕，24 h內精神、食欲均可獲得不同程度上的恢復；正常對照組小鼠可見煩躁不安，但無上述其他表現。
二 肺組織病理學改變
正常對照組小鼠肺組織結構清晰，基本無炎癥細胞浸潤(圖 1a)。RSV組支氣管管腔狹窄甚至閉塞，肺泡上皮腫脹，肺泡間隔增寬，間質性水腫(圖 1b)。哮喘組支氣管、毛細支氣管及伴行血管壁周圍有大量嗜酸性細胞及單核細胞等炎癥細胞浸潤，支氣管粘膜增厚，血管擴張，血管平滑肌增生肥厚(圖 1c)。哮喘及RSV組兼具兩組的共同表現(圖 1d)。地塞米松組無明顯炎癥細胞浸潤及間質性改變(圖 1e)。
圖1
肺組織病理檢查像(HE染色 ×400) a.正常對照組；b.RSV組；c.哮喘組；d.RSV合并哮喘組；e.地塞米松組
三 各組肺組織NGF mRNA及LIF mRNA的表達
在各組肺組織NGF mRNA及LIF mRNA的表達中RSV組與正常對照組相比較升高(P<0.01)；RSV組與哮喘組相比較降低(P<0.01)；而哮喘合并RSV組與哮喘組相比顯著升高(P<0.01)；地塞米松組相比RSV組顯著降低(P<0.01)。結果見表 1、圖 2。
表1
各組肺組織NGFmRNA及LIFmRNA的表達(
圖2
RT-PCR檢測肺組織中NGF mRNA及LIF mRNA表達 M.Marker；1.正常對照組；2.RSV組；3.哮喘組；4.RSV合并哮喘組；5.地塞米松組
四 各組肺組織NGF蛋白及LIF蛋白的表達
正常對照組可見NGF蛋白及LIF蛋白少量表達，RSV組比正常對照組升高(P<0.01)；RSV組比哮喘組降低(P<0.01)；而哮喘合并RSV組比哮喘組顯著升高(P<0.01)；地塞米松組比RSV組顯著降低(P<0.01)。結果與RT-PCR檢測法一致。結果見表 2、圖 3、圖 4。
表2
各組肺組織NGF及LIF的相對含量(
圖3
肺組織NGF蛋白表達(免疫組化染色 ×400) a.正常對照組；b.RSV組；c.哮喘組；d.RSV合并哮喘組；e.地塞米松組
圖4
肺組織LIF蛋白表達(免疫組化染色 ×400) a.正常對照組；b.RSV組；b.哮喘組；d.RSV合并哮喘組；e.地塞米松組
討論
哮喘是由多種炎性細胞及細胞組分共同參與的氣道慢性炎癥，表現為反復發作性的喘息、氣促、胸悶等癥狀，具有可逆性氣流受限和氣道高反應等特征。有研究提示，支配氣道感覺神經及相關神經營養因子與氣道炎癥密切有關，其機制可能為氣管及支氣管上皮因炎癥反應受損脫落，暴露感覺神經末梢，刺激感覺神經元釋放活性物質，這些遞質反作用于外周靶細胞，循環作用，從而可引起神經營養因子的升高。NGF可由外周靶細胞合成，經軸突攝取后逆行轉運至背根神經節細胞，具有促進神經細胞生長、存活和分化的作用，能夠增強神經突觸的可塑性，從而刺激神經遞質分泌增加[11-12],除了神經營養因子的活性，NGF已被更廣泛的認為具有非神經元細胞的生物活性，如可以參與和整合刺激自適系統的成熟以及表達，被認為是免疫系統工作的關鍵[13]。有文獻報道[14-15]，NGF與LIF同屬NGF家族成員，有類似生物學活性，作為胞外刺激因子作用于效應細胞過程中，二者具有相同的信號轉導通路(Ras-Raf-MEK級聯途徑)，因此當一種因子受到抑制時，另一種因子的表達水平同樣受到抑制，故二者可能參與哮喘發病機制，在RSV感染后導致支氣管哮喘發生過程中起到相關作用。
本研究顯示，小鼠RSV感染后其肺組織病理改主要為毛細支氣管上皮壞死和周圍淋巴細胞浸潤，可有壞死組織和炎性滲出物充滿支氣管管腔，造成支氣管閉塞等表現。同時出現肺泡間隔增寬及單核細胞為主的間質滲出改變，但無典型哮喘樣病理改變。但哮喘合并RSV感染時可使病理組織改變較單純哮喘病變或RSV感染明顯加重。據此可推測RSV感染后并非直接導致哮喘發生，但哮喘感染RSV后在一定程度上加重哮喘病理組織的改變。
本研究應用RT-PCR法檢測小鼠肺組織發現，NGF mRNA、LIF mRNA在正常對照組肺組織、RSV組肺組織、哮喘組肺組織、哮喘合并RSV組肺組織中以及地塞米松組肺組織均見表達，模型組均較正常對照組表達增高，其中哮喘組NGF mRNA、LIF mRNA表達較RSV組表達增高，哮喘合并RSV組NGF mRNA、LIF mRNA的表達較單一RSV感染或哮喘組增高，但RSV組予地塞米松干預后，NGF mRNA、LIF mRNA的表達較RSV組降低。與此同時，應用免疫組化法檢測NGF、LIF含量，結果與RT-PCR法相一致。
有研究表明，哮喘大鼠氣道組織中NGF表達顯著增加氣道炎癥明顯相關，予抗NGF干預后可抑制氣道炎癥[16]。小鼠RSV感染后肺間質有炎性細胞浸潤，逐漸出現典型間質性肺炎表現，肺泡腔明顯狹窄，炎性細胞浸潤，毛細血管擴張充血，隨著病情進展，肺間質的炎性細胞浸潤逐漸減輕[17]。本研究結果與上述研究結果基本一致。
綜合上述研究結果，提示哮喘氣道神經源性炎癥的發生可能為多種神經營養因子共同作用的結果，這些因子的作用機制相似，但并非相同，神經營養因子在哮喘及呼吸道感染模型中引起的組織病理變化不同，病程長短不同，其具體不同機制需進一步研究；地塞米松可同時抑制這些因子，可引起其他相關致病因子的表達障礙，在臨床治療過程中，可尋找抑制神經生長因子的抑制劑，從而減少RSV感染后發生哮喘的幾率，為哮喘防治提供了新的思路。
支氣管哮喘(簡稱哮喘)是最常見的慢性呼吸道疾病，其發病機制較為復雜。接觸過敏原，理化刺激，劇烈運動,呼吸道感染等多種因素可以誘發并加重哮喘，其中病毒性呼吸道感染是哮喘急性發作的常見誘因。有報道稱，約30％～80％的哮喘急性發作病例中，病毒感染發揮了作用。在常見的病毒感染中呼吸道合胞病毒(RSV)感染占主導地位，RSV是嬰幼兒呼吸道感染最為常見的病原之一,研究證實RSV感染可引起毛細支氣管炎，向哮喘轉化[1-2]，是導致兒童哮喘發生的高危因素。目前有關RSV感染引起哮喘的發病機制尚不明確，有研究證實，豚鼠感染RSV后，其氣道高反應性明顯增加[3-4]。有研究表明，氣道的感覺神經及其營養因子可能與氣道炎癥的形成密切關聯，神經生長因子(nerve grow factor，NGF)及白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等神經營養因子在氣道炎癥模型肺組織內表達明顯升高，且能使神經激肽受體-1(neurokin receptor-1，NK-1R)等速激肽類物質表達增高，從而引發氣道炎癥性反應[5-6]，提示NGF、LIF是參與及調控氣道神經源性炎癥的重要炎癥因子。本研究主要探討Balb/c小鼠感染RSV后肺組織的NGF、LIF表達變化及與哮喘的關系，同時研究地塞米松對其表達是否存在影響，從而為哮喘的臨床預防與治療提供新思路。
材料與方法
一 材料
1．動物及主要試劑：清潔級健康雌性Balb/c純系小鼠，6~8周齡，體質量(22±2) g，由徐州醫學院實驗動物中心提供；293-T人胚腎細胞株及RSV A2 標準株均由山東醫學科學院微生物教研室孟紅老師惠贈；HyClone改良型RPMI-1640培養基及HyClone胎牛血清均購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司；雞卵白蛋白(OVA)由美國Sigma公司提供；佐劑氫氧化鋁 Al(OH)3干粉由上海生物工程有限公司提供；TRNzol總RNA提取試劑、TIANSscript cDNA第一鏈合成試劑盒及2×TaqRCR Master Mix均購自天根生物科技(北京)有限公司；NGF mRNA引物、LIF mRNA引物及GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設計及合成；免抗NGF beta(免疫組化)由武漢博士德生物工程有限公司提供；免抗LIF(免疫組化)由北京博奧森生物技術有限公司提供;濃縮型二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒及兔超敏二步法檢測試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
2．細胞和病毒：293-T人胚腎細胞株在含20 mL/L滅活胎牛血清的RPMI-1640培養基中37 ℃，50 mL/L CO2條件下培養，待生長成單層貼壁細胞后，將RSV病毒接種293-T細胞,繼續在含20 mL/L滅活胎牛血清的RPMI-1640培養基的維持液中培養，待細胞病變達100%時收集病毒，反復凍融、離心，收集RSV上清。
二 方法
1．實驗分組及動物模型：參照國內外模型制作方法[7-8]。健康雌性Balb/c小鼠100只，采用隨機數字表法分為5組,分別為正常對照組，RSV組，哮喘組，哮喘合并RSV組，地塞米松組，每組20只。正常對照組：于第1、14 d予以生理鹽水0.2 mL腹腔注射，第21~25 d用37 ℃生理鹽水20 mL霧化吸入30 min。哮喘組：于第1、14 d予以OVA/AL(OH)3 [含OVA100 μg，AL(OH)3 2 mg]腹腔注射，第21 d開始激發，以2%OVA生理鹽水20 mL霧化30 min，持續激發5 d。RSV組：于第19、20、21天，取TCID50 10-6.5/mL的RSV病毒懸液100 μL，緩慢滴入鼻腔[9-10]。哮喘合并RSV組：模型制備同哮喘組，第19、20、21 d，以TCID5010-6.5/ mL的RSV病毒懸液100 μL鼻腔滴入。地塞米松組：RSV感染同RSV組，于21~25 d予腹腔注入地塞米松0.2 mg·kg-1·d-1。
2．標本收集：末次激發后24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg)。麻醉后，無菌條件下，眼科鑷分離出兩側肺組織，取左肺下葉，-80 ℃冰箱凍存，用于肺組織病毒鑒定。將右肺下葉迅速凍存，留待勻漿后進行逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。4%甲醛固定液固定右肺中葉和左肺上葉肺組織分別置于標記好的4%甲醛中過夜固定，留待做石蠟切片、HE染色、免疫組化，觀察肺組織病理改變及NGF及LIF的變化。
3．肺組織病理學檢查：小鼠處死后，4%多聚甲醛固定24 h,脫水、透明、浸蠟及包埋，切片行HE染色，在400倍光鏡下觀察肺組織病變和炎性細胞浸潤等病理改變。
4．肺組織RSV mRNA、NGF mRNA及LIF mRNA 表達檢測：采用RT-PCR。各實驗組同時進行RT-PCR。TRNzol液提取細胞總RNA,具體操作按說明書進行，紫外分光光度計(A260/A280)檢測RNA純度及完整性，按說明書步驟逆轉錄mRNA為cDNA。RSV引物：上游序列(5′→3′)TGGAGCCTCAGA TCATCCCA，下游序列(5′→3′)TGATTTTGCCTGG CGTGTTG，片段長度為153 bp；NGF引物：上游序列(5′→3′)GTCAGTGTGTGGGTTGGAGA，下游序列(5′→3′)TTCTTGTAGCCTTCCTGCTG，片段長度304 bp；LIF引物：上游序列(5′→3′)TGCTTGCTGGGT GTATGAAC，下游序列(5′→3′)TTCTGTGGGAGCCT GAACA，片段長度356 bp；GAPDH引物：上游序列(5′→3′)CCTTCATTGACCTCAACTACA，下游序列(5′→3′)CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC，片段長度215 bp。反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性 45 s，58 ℃(RSV)/58.8 ℃(NGF)/57 ℃(LIF)/60 ℃(GAPDH)，退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環，最后72 ℃延伸5 min。擴增產物于瓊脂糖凝膠上電泳。凝膠成像分析系統測定目的基因產物與內參照基因產物的比值，半定量方法分析目的基因的表達。
5．免疫組化化學方法檢測各組肺組織NGF及LIF的表達：石蠟切片恒溫箱烤片后，經二甲苯脫蠟、梯度酒精復水，滴加3%H2O2室溫孵育15 min滅活內源性過氧化物酶，PBS緩沖液浸泡沖洗3次，浸入0.01 mol/L檸檬酸枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)，微波爐熱修復抗原，冷卻至室溫后，PBS緩沖液浸泡清洗2次，繼之兔超敏二步法(Polink-2 plus)進行免疫組織化學反應：(1)滴加兔抗小鼠NGF、LIF抗體稀釋液(工作濃度1∶100)，4 ℃過夜，(2)滴加試劑Polymer Helper,37 ℃孵育15 min，(3)滴加試劑poly-HRP anti-Rabbit IgG，37 ℃孵育15 min。以上每一步驟之后均用PBS浸泡沖洗3次，每次5 min。最后用DAB法顯色，顯微鏡下控制反應，適時終止。蘇木素輕度復染，1%鹽酸分化數秒，飽和碳酸鋰返藍1 min,常規脫水、透明及中性樹膠(DPX)封固，光鏡觀察。陰性對照用PBS代替上述一抗進行反應。以細胞漿棕黃色為陽性，采用圖像分析軟件對NGF及LIF陽性部位進行測定。
三 統計學處理
采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析。計量資料以
結果
一 一般情況
經致敏和激發后，哮喘組和哮喘合并RSV組小鼠出現煩躁不安，縮頭弓背，抓撓頭面部，前肢縮抬，呼吸急促，偶爾咳嗽等表現；RSV組小鼠滴鼻后第3 d 出現煩躁不安，第6 d表現明顯，出現呼吸急促，易激惹，食欲不佳；地塞米松組小鼠癥狀表現較輕，24 h內精神、食欲均可獲得不同程度上的恢復；正常對照組小鼠可見煩躁不安，但無上述其他表現。
二 肺組織病理學改變
正常對照組小鼠肺組織結構清晰，基本無炎癥細胞浸潤(圖 1a)。RSV組支氣管管腔狹窄甚至閉塞，肺泡上皮腫脹，肺泡間隔增寬，間質性水腫(圖 1b)。哮喘組支氣管、毛細支氣管及伴行血管壁周圍有大量嗜酸性細胞及單核細胞等炎癥細胞浸潤，支氣管粘膜增厚，血管擴張，血管平滑肌增生肥厚(圖 1c)。哮喘及RSV組兼具兩組的共同表現(圖 1d)。地塞米松組無明顯炎癥細胞浸潤及間質性改變(圖 1e)。
圖1
肺組織病理檢查像(HE染色 ×400) a.正常對照組；b.RSV組；c.哮喘組；d.RSV合并哮喘組；e.地塞米松組
三 各組肺組織NGF mRNA及LIF mRNA的表達
在各組肺組織NGF mRNA及LIF mRNA的表達中RSV組與正常對照組相比較升高(P<0.01)；RSV組與哮喘組相比較降低(P<0.01)；而哮喘合并RSV組與哮喘組相比顯著升高(P<0.01)；地塞米松組相比RSV組顯著降低(P<0.01)。結果見表 1、圖 2。
表1
各組肺組織NGFmRNA及LIFmRNA的表達(
圖2
RT-PCR檢測肺組織中NGF mRNA及LIF mRNA表達 M.Marker；1.正常對照組；2.RSV組；3.哮喘組；4.RSV合并哮喘組；5.地塞米松組
四 各組肺組織NGF蛋白及LIF蛋白的表達
正常對照組可見NGF蛋白及LIF蛋白少量表達，RSV組比正常對照組升高(P<0.01)；RSV組比哮喘組降低(P<0.01)；而哮喘合并RSV組比哮喘組顯著升高(P<0.01)；地塞米松組比RSV組顯著降低(P<0.01)。結果與RT-PCR檢測法一致。結果見表 2、圖 3、圖 4。
表2
各組肺組織NGF及LIF的相對含量(
圖3
肺組織NGF蛋白表達(免疫組化染色 ×400) a.正常對照組；b.RSV組；c.哮喘組；d.RSV合并哮喘組；e.地塞米松組
圖4
肺組織LIF蛋白表達(免疫組化染色 ×400) a.正常對照組；b.RSV組；b.哮喘組；d.RSV合并哮喘組；e.地塞米松組
討論
哮喘是由多種炎性細胞及細胞組分共同參與的氣道慢性炎癥，表現為反復發作性的喘息、氣促、胸悶等癥狀，具有可逆性氣流受限和氣道高反應等特征。有研究提示，支配氣道感覺神經及相關神經營養因子與氣道炎癥密切有關，其機制可能為氣管及支氣管上皮因炎癥反應受損脫落，暴露感覺神經末梢，刺激感覺神經元釋放活性物質，這些遞質反作用于外周靶細胞，循環作用，從而可引起神經營養因子的升高。NGF可由外周靶細胞合成，經軸突攝取后逆行轉運至背根神經節細胞，具有促進神經細胞生長、存活和分化的作用，能夠增強神經突觸的可塑性，從而刺激神經遞質分泌增加[11-12],除了神經營養因子的活性，NGF已被更廣泛的認為具有非神經元細胞的生物活性，如可以參與和整合刺激自適系統的成熟以及表達，被認為是免疫系統工作的關鍵[13]。有文獻報道[14-15]，NGF與LIF同屬NGF家族成員，有類似生物學活性，作為胞外刺激因子作用于效應細胞過程中，二者具有相同的信號轉導通路(Ras-Raf-MEK級聯途徑)，因此當一種因子受到抑制時，另一種因子的表達水平同樣受到抑制，故二者可能參與哮喘發病機制，在RSV感染后導致支氣管哮喘發生過程中起到相關作用。
本研究顯示，小鼠RSV感染后其肺組織病理改主要為毛細支氣管上皮壞死和周圍淋巴細胞浸潤，可有壞死組織和炎性滲出物充滿支氣管管腔，造成支氣管閉塞等表現。同時出現肺泡間隔增寬及單核細胞為主的間質滲出改變，但無典型哮喘樣病理改變。但哮喘合并RSV感染時可使病理組織改變較單純哮喘病變或RSV感染明顯加重。據此可推測RSV感染后并非直接導致哮喘發生，但哮喘感染RSV后在一定程度上加重哮喘病理組織的改變。
本研究應用RT-PCR法檢測小鼠肺組織發現，NGF mRNA、LIF mRNA在正常對照組肺組織、RSV組肺組織、哮喘組肺組織、哮喘合并RSV組肺組織中以及地塞米松組肺組織均見表達，模型組均較正常對照組表達增高，其中哮喘組NGF mRNA、LIF mRNA表達較RSV組表達增高，哮喘合并RSV組NGF mRNA、LIF mRNA的表達較單一RSV感染或哮喘組增高，但RSV組予地塞米松干預后，NGF mRNA、LIF mRNA的表達較RSV組降低。與此同時，應用免疫組化法檢測NGF、LIF含量，結果與RT-PCR法相一致。
有研究表明，哮喘大鼠氣道組織中NGF表達顯著增加氣道炎癥明顯相關，予抗NGF干預后可抑制氣道炎癥[16]。小鼠RSV感染后肺間質有炎性細胞浸潤，逐漸出現典型間質性肺炎表現，肺泡腔明顯狹窄，炎性細胞浸潤，毛細血管擴張充血，隨著病情進展，肺間質的炎性細胞浸潤逐漸減輕[17]。本研究結果與上述研究結果基本一致。
綜合上述研究結果，提示哮喘氣道神經源性炎癥的發生可能為多種神經營養因子共同作用的結果，這些因子的作用機制相似，但并非相同，神經營養因子在哮喘及呼吸道感染模型中引起的組織病理變化不同，病程長短不同，其具體不同機制需進一步研究；地塞米松可同時抑制這些因子，可引起其他相關致病因子的表達障礙，在臨床治療過程中，可尋找抑制神經生長因子的抑制劑，從而減少RSV感染后發生哮喘的幾率，為哮喘防治提供了新的思路。
