引用本文： 史瑩, 譚焰, 谷偉. 肝X受體激動劑T0901317對人胚肺成纖維細胞增殖、遷移及形成膠原功能的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(2): 143-146. doi: 10.7507/1671-6205.2015037 復制
肝X受體(liver X receptors，LXRs)屬于Ⅱ型核受體，包括LXRα和LXRβ兩種亞型。LXRα在肝中表達量最高，其次是肺、小腸及腎臟等，LXRβ則在人體內廣泛表達。LXRs能被天然的或人工合成的配體活化，導致其靶基因轉錄，如ATP結合盒轉運體A1[1-3]，從而參與膽固醇代謝。此外，LXRs能反式抑制部分炎性基因的轉錄[4-5]，因此具有抗炎作用。目前對LXRs在肺部疾病中的研究甚少，對于慢性氣道炎癥性疾病如支氣管哮喘及慢性阻塞性肺疾病的研究更鮮有涉及。我們發現LXRs激動劑T0901317能抑制慢性哮喘小鼠氣道重塑的過程，減少氣道黏膜下膠原的沉積，并減少氣道內羥脯氨酸含量[6]。由于成纖維細胞是分泌膠原的主要細胞，因此T0901317可能通過抑制成纖維細胞功能而減輕氣道重塑。為進一步證實及研究T0901317對氣道重塑的作用及機制，我們以人胚肺成纖維細胞(human embryonic lung fibroblasts，HELF)為研究對象，從細胞水平探討T0901317能否抑制HELF細胞的增殖、遷移及分泌膠原的能力。現將結果報道如下。
材料與方法
一 材料
胎牛血清(美國Gibco公司)，Dulbecco改良Eagle培養液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM；美國Gibco公司)，HELF細胞(南京凱基生物公司)。重組人堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF；美國Peprotech公司)，重組人轉化生長因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1；美國Peprotech公司)，孔徑8.0 μm的Transwell趨化小室6孔板(美國Corning公司)，羥脯氨酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。細胞計數試劑盒8(cell counting kit-8，CKK-8；上海碧云天生物技術有限公司)，T0901317(加拿大Cayman公司)。
二 方法
1.細胞培養以及試劑準備：將HELF細胞接種于50 mL培養瓶，培養基為RPMI DMEM+10%胎牛血清。每隔3 d換液1次，當細胞80%~90%鋪滿瓶底時，先用磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，加入1.5 mL的0.25%胰酶細胞消化液。顯微鏡下觀察，當細胞收縮成圓形后，棄去消化液，加入培養液，無菌吸管吹打至貼壁細胞全部浮起，1∶3接種于培養瓶繼續培養。T0901317用二甲基亞砜溶解，濃度為100 mg/L。b-FGF及TGF-β1以DMEM溶解，濃度為2 ng/μL，-20 ℃保存。
2.細胞分組及干預：當細胞進入對數生長期，細胞融合達80%~90%時，撤血清12 h，分為對照組、T0901317組、生長因子組、生長因子+T0901317組。對照組僅以DMEM培養26 h。T0901317組的DMEM培養液中加入1.00 μmol/L的T0901317培養26 h。生長因子組中加入生長因子b-FGF及TGF-β1培養26 h，兩種生長因子培養液中終濃度均為50 ng/mL。生長因子+T0901317組于0.25、0.50、1.00 μmol/L的T0901317孵育2 h后[7]，加入生長因子，培養24 h。
3.細胞增殖實驗：參考文獻[8]的方法。取對數生長期細胞種入96孔板，每孔200 μL 2×104/mL單細胞懸液，培養24 h，每組設3個復孔，繼續培養24 h，加入20 μL的CKK-8溶液，孵育1 h，在酶聯免疫檢測儀上測定每孔吸光度值(A490)，測定波長490 nm[4]。
4.細胞遷移實驗：參考文獻[9]的方法。Transwell趨化小室的上、下室間隔以孔徑8.0 μm的聚碳酸微孔濾膜，先在下室中加入含終濃度為50 ng/mL的b-FGF及TGF-β1的培養液，然后在上室中加入0.2 mL細胞密度為2×105/mL的細胞懸液，培養18 h。檢測時擦去濾膜上室面未遷移細胞，將有遷移細胞的下室面朝上置于玻片上，甲醇固定，蘇木素染色，膜上層的細胞用棉簽拭去，然后在顯微鏡下隨機取4個高倍視野(HPF，×400)計數遷移到膜下層的細胞數。
5.羥脯氨酸測定實驗：參考文獻[10]的方法。細胞培養上清液0.5 mL，加入無水乙醇1 mL，混勻后離心取上清烘干，再加入0.5 mL雙蒸水，按試劑盒說明書操作，紫外分光光度計測吸光度值(A550)，測定波長550 nm。上清中羥脯氨酸(mg/L)=(測定管吸光度值-空白管吸光度值)/(標準管吸光度值-空白管吸光度值)×標準管濃度。
三 統計學處理
結果采用SPSS 11.5統計軟件進行統計學分析。數據以
結果
一 T0901317對HELF細胞增殖能力的影響
與對照組相比，終濃度1.00 μmol/L的T0901317對成纖維細胞的增殖無明顯影響，而生長因子能明顯促進HELF增殖。在生長因子+T0901317組中，與生長因子組相比，0.25 μmol/L的T0901317不能明顯抑制生長因子對HELF的增殖作用，而0.50 μmol/L的T0901317可使細胞增殖活性降低22.6%，1.00 μmol/L的T0901317可以使細胞增殖活性降低41.5%。結果見圖 1。
圖1
T0901317對HELF細胞增殖能力的影響
生長因子組與對照組比較，*
二 T0901317對HELF細胞遷移能力的影響
與對照組相比，T0901317對成纖維細胞的遷移能力無明顯影響，而生長因子組的遷移細胞數明顯增加。生長因子+T0901317組的遷移細胞數較生長因子組明顯減少，且隨著T0901317的濃度增加，HELF的遷移細胞數逐漸減少。結果見圖 2。
圖2
T0901317對HELF細胞遷移能力的影響
生長因子組與對照組比較，*
三 T0901317對HELF細胞合成羥脯氨酸能力的影響
與對照組相比，T0901317對成纖維細胞合成羥脯氨酸的能力無明顯影響，而生長因子能明顯促進HELF合成羥脯氨酸。生長因子+T0901317組中，0.25 μmol/L的T0901317對生長因子促進HELF合成羥脯氨酸的能力無明顯影響，而0.50 μmol/L及1.00 μmol/L的T0901317可以減弱生長因子誘導HELF合成羥脯氨酸的能力。結果見圖 3。
圖3
T0901317對HELF細胞合成羥脯氨酸能力的影響
生長因子組與對照組比較，*
討論
氣道重塑是支氣管哮喘的重要特征，是難治性哮喘及哮喘氣道不可逆性損傷的主要原因，在疾病的初期即可出現[11]，而生長因子和成纖維細胞在哮喘氣道重塑中發揮著重要的作用[8]，抑制生長因子誘導的成纖維細胞增殖，減少細胞外基質的產生已成為哮喘研究的重要方向。本實驗以HELF細胞為研究對象，以兩種生長因子干預HELF細胞，造成 HELF細胞增殖、遷移及合成膠原能力增加，模擬哮喘氣道內微環境及成纖維細胞參與氣道重塑的過程。
LXRs是新型的Ⅱ型核受體，在人工合成的配體作用下，LXRs被活化，與靶基因啟動子結合，促進靶基因轉錄，同時反式抑制炎性基因的表達[4-5]。T0901317是目前最常用的LXRs激動劑，我們用T0901317干預慢性哮喘小鼠，發現其能抑制慢性哮喘動物的氣道重塑過程[6]，但是作用機制尚待進一步研究及證實。本實驗以T0901317干預HELF細胞，對T0901317的功能進行深入探討。在預實驗的基礎上，我們最終確定T0901317對HELF的干預濃度為0.25~1.00 μmol/L，此濃度區間可有效觀察到HELF的生物學功能變化。
TGF-β1及b-FGF是十分重要的細胞因子，在調節細胞的增殖、分化、凋亡、遷移、黏附和細胞外基質的代謝中起重要作用[12-14]。本實驗中，在TGF-β1及b-FGF的作用下，HELF的增殖、遷移及合成膠原的能力都明顯增強，而T0901317能有效抑制生長因子誘導的HELF增殖、遷移，并減少羥脯氨酸的合成。由于成纖維細胞在產生膠原纖維導致管腔狹窄等過程中發揮了重要作用，我們推斷T0901317可通過抑制成纖維細胞對生長因子的反應性增生，抑制成纖維細胞遷移及合成膠原三方面而參與氣道疾病的病理生理過程。
目前，T0901317究竟是通過何種途徑抑制生長因子功能尚不清楚。TGF-β1最重要的胞內效應因子是Smad蛋白。TGF-β1／Smad通路在組織修復和氣道重塑中起了重要作用。我們前期的研究已證實，T0901317可抑制Smad2磷酸化，導致進入細胞核的磷酸化Smad2減少，由此影響Smad2的生物功能，進而抑制TGF-β1的生物功能[15]。因此我們推測T0901317可能通過抑制TGF-β1的胞內信號通路而影響成纖維細胞功能。由于生長因子的胞內信號通路存在非常復雜的調節機制，T0901317抑制生長因子功能的機制尚需更深入的研究。
綜上所述，T0901317可以抑制生長因子誘導的成纖維細胞增殖、遷移及合成羥脯氨酸。我們的研究結果為利用LXRs激動劑治療支氣管哮喘等慢性氣道疾病提供了理論依據和實驗基礎。
肝X受體(liver X receptors，LXRs)屬于Ⅱ型核受體，包括LXRα和LXRβ兩種亞型。LXRα在肝中表達量最高，其次是肺、小腸及腎臟等，LXRβ則在人體內廣泛表達。LXRs能被天然的或人工合成的配體活化，導致其靶基因轉錄，如ATP結合盒轉運體A1[1-3]，從而參與膽固醇代謝。此外，LXRs能反式抑制部分炎性基因的轉錄[4-5]，因此具有抗炎作用。目前對LXRs在肺部疾病中的研究甚少，對于慢性氣道炎癥性疾病如支氣管哮喘及慢性阻塞性肺疾病的研究更鮮有涉及。我們發現LXRs激動劑T0901317能抑制慢性哮喘小鼠氣道重塑的過程，減少氣道黏膜下膠原的沉積，并減少氣道內羥脯氨酸含量[6]。由于成纖維細胞是分泌膠原的主要細胞，因此T0901317可能通過抑制成纖維細胞功能而減輕氣道重塑。為進一步證實及研究T0901317對氣道重塑的作用及機制，我們以人胚肺成纖維細胞(human embryonic lung fibroblasts，HELF)為研究對象，從細胞水平探討T0901317能否抑制HELF細胞的增殖、遷移及分泌膠原的能力。現將結果報道如下。
材料與方法
一 材料
胎牛血清(美國Gibco公司)，Dulbecco改良Eagle培養液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM；美國Gibco公司)，HELF細胞(南京凱基生物公司)。重組人堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF；美國Peprotech公司)，重組人轉化生長因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1；美國Peprotech公司)，孔徑8.0 μm的Transwell趨化小室6孔板(美國Corning公司)，羥脯氨酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。細胞計數試劑盒8(cell counting kit-8，CKK-8；上海碧云天生物技術有限公司)，T0901317(加拿大Cayman公司)。
二 方法
1.細胞培養以及試劑準備：將HELF細胞接種于50 mL培養瓶，培養基為RPMI DMEM+10%胎牛血清。每隔3 d換液1次，當細胞80%~90%鋪滿瓶底時，先用磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，加入1.5 mL的0.25%胰酶細胞消化液。顯微鏡下觀察，當細胞收縮成圓形后，棄去消化液，加入培養液，無菌吸管吹打至貼壁細胞全部浮起，1∶3接種于培養瓶繼續培養。T0901317用二甲基亞砜溶解，濃度為100 mg/L。b-FGF及TGF-β1以DMEM溶解，濃度為2 ng/μL，-20 ℃保存。
2.細胞分組及干預：當細胞進入對數生長期，細胞融合達80%~90%時，撤血清12 h，分為對照組、T0901317組、生長因子組、生長因子+T0901317組。對照組僅以DMEM培養26 h。T0901317組的DMEM培養液中加入1.00 μmol/L的T0901317培養26 h。生長因子組中加入生長因子b-FGF及TGF-β1培養26 h，兩種生長因子培養液中終濃度均為50 ng/mL。生長因子+T0901317組于0.25、0.50、1.00 μmol/L的T0901317孵育2 h后[7]，加入生長因子，培養24 h。
3.細胞增殖實驗：參考文獻[8]的方法。取對數生長期細胞種入96孔板，每孔200 μL 2×104/mL單細胞懸液，培養24 h，每組設3個復孔，繼續培養24 h，加入20 μL的CKK-8溶液，孵育1 h，在酶聯免疫檢測儀上測定每孔吸光度值(A490)，測定波長490 nm[4]。
4.細胞遷移實驗：參考文獻[9]的方法。Transwell趨化小室的上、下室間隔以孔徑8.0 μm的聚碳酸微孔濾膜，先在下室中加入含終濃度為50 ng/mL的b-FGF及TGF-β1的培養液，然后在上室中加入0.2 mL細胞密度為2×105/mL的細胞懸液，培養18 h。檢測時擦去濾膜上室面未遷移細胞，將有遷移細胞的下室面朝上置于玻片上，甲醇固定，蘇木素染色，膜上層的細胞用棉簽拭去，然后在顯微鏡下隨機取4個高倍視野(HPF，×400)計數遷移到膜下層的細胞數。
5.羥脯氨酸測定實驗：參考文獻[10]的方法。細胞培養上清液0.5 mL，加入無水乙醇1 mL，混勻后離心取上清烘干，再加入0.5 mL雙蒸水，按試劑盒說明書操作，紫外分光光度計測吸光度值(A550)，測定波長550 nm。上清中羥脯氨酸(mg/L)=(測定管吸光度值-空白管吸光度值)/(標準管吸光度值-空白管吸光度值)×標準管濃度。
三 統計學處理
結果采用SPSS 11.5統計軟件進行統計學分析。數據以
結果
一 T0901317對HELF細胞增殖能力的影響
與對照組相比，終濃度1.00 μmol/L的T0901317對成纖維細胞的增殖無明顯影響，而生長因子能明顯促進HELF增殖。在生長因子+T0901317組中，與生長因子組相比，0.25 μmol/L的T0901317不能明顯抑制生長因子對HELF的增殖作用，而0.50 μmol/L的T0901317可使細胞增殖活性降低22.6%，1.00 μmol/L的T0901317可以使細胞增殖活性降低41.5%。結果見圖 1。
圖1
T0901317對HELF細胞增殖能力的影響
生長因子組與對照組比較，*
二 T0901317對HELF細胞遷移能力的影響
與對照組相比，T0901317對成纖維細胞的遷移能力無明顯影響，而生長因子組的遷移細胞數明顯增加。生長因子+T0901317組的遷移細胞數較生長因子組明顯減少，且隨著T0901317的濃度增加，HELF的遷移細胞數逐漸減少。結果見圖 2。
圖2
T0901317對HELF細胞遷移能力的影響
生長因子組與對照組比較，*
三 T0901317對HELF細胞合成羥脯氨酸能力的影響
與對照組相比，T0901317對成纖維細胞合成羥脯氨酸的能力無明顯影響，而生長因子能明顯促進HELF合成羥脯氨酸。生長因子+T0901317組中，0.25 μmol/L的T0901317對生長因子促進HELF合成羥脯氨酸的能力無明顯影響，而0.50 μmol/L及1.00 μmol/L的T0901317可以減弱生長因子誘導HELF合成羥脯氨酸的能力。結果見圖 3。
圖3
T0901317對HELF細胞合成羥脯氨酸能力的影響
生長因子組與對照組比較，*
討論
氣道重塑是支氣管哮喘的重要特征，是難治性哮喘及哮喘氣道不可逆性損傷的主要原因，在疾病的初期即可出現[11]，而生長因子和成纖維細胞在哮喘氣道重塑中發揮著重要的作用[8]，抑制生長因子誘導的成纖維細胞增殖，減少細胞外基質的產生已成為哮喘研究的重要方向。本實驗以HELF細胞為研究對象，以兩種生長因子干預HELF細胞，造成 HELF細胞增殖、遷移及合成膠原能力增加，模擬哮喘氣道內微環境及成纖維細胞參與氣道重塑的過程。
LXRs是新型的Ⅱ型核受體，在人工合成的配體作用下，LXRs被活化，與靶基因啟動子結合，促進靶基因轉錄，同時反式抑制炎性基因的表達[4-5]。T0901317是目前最常用的LXRs激動劑，我們用T0901317干預慢性哮喘小鼠，發現其能抑制慢性哮喘動物的氣道重塑過程[6]，但是作用機制尚待進一步研究及證實。本實驗以T0901317干預HELF細胞，對T0901317的功能進行深入探討。在預實驗的基礎上，我們最終確定T0901317對HELF的干預濃度為0.25~1.00 μmol/L，此濃度區間可有效觀察到HELF的生物學功能變化。
TGF-β1及b-FGF是十分重要的細胞因子，在調節細胞的增殖、分化、凋亡、遷移、黏附和細胞外基質的代謝中起重要作用[12-14]。本實驗中，在TGF-β1及b-FGF的作用下，HELF的增殖、遷移及合成膠原的能力都明顯增強，而T0901317能有效抑制生長因子誘導的HELF增殖、遷移，并減少羥脯氨酸的合成。由于成纖維細胞在產生膠原纖維導致管腔狹窄等過程中發揮了重要作用，我們推斷T0901317可通過抑制成纖維細胞對生長因子的反應性增生，抑制成纖維細胞遷移及合成膠原三方面而參與氣道疾病的病理生理過程。
目前，T0901317究竟是通過何種途徑抑制生長因子功能尚不清楚。TGF-β1最重要的胞內效應因子是Smad蛋白。TGF-β1／Smad通路在組織修復和氣道重塑中起了重要作用。我們前期的研究已證實，T0901317可抑制Smad2磷酸化，導致進入細胞核的磷酸化Smad2減少，由此影響Smad2的生物功能，進而抑制TGF-β1的生物功能[15]。因此我們推測T0901317可能通過抑制TGF-β1的胞內信號通路而影響成纖維細胞功能。由于生長因子的胞內信號通路存在非常復雜的調節機制，T0901317抑制生長因子功能的機制尚需更深入的研究。
綜上所述，T0901317可以抑制生長因子誘導的成纖維細胞增殖、遷移及合成羥脯氨酸。我們的研究結果為利用LXRs激動劑治療支氣管哮喘等慢性氣道疾病提供了理論依據和實驗基礎。
