引用本文： 穆傳勇, 陳延斌, 龐雪芹, 陳成, 朱曄涵, 黃建安. 慢性阻塞性肺疾病合并肺動脈高壓患者外周血CD4+CD25highCD127low調節性T細胞及相關因子檢測的臨床意義. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(2): 139-142. doi: 10.7507/1671-6205.2015036 復制
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)合并肺動脈高壓(chronic obstructive pulmonary disease combined pulmonary hypertension，CPH)發病機制較為復雜，自身免疫的過度激活及其產生的持續炎癥反應在CPH的發病機制中扮演重要角色，其中T細胞亞群的異常分化及其導致的細胞因子分泌異常成為細胞免疫失控的主要環節[1]。CD4+CD25highCD127low調節性T細胞(CD4+CD25highCD127low regulatoryTcell，Treg) 是近年來確定的一類具有免疫調節功能的T細胞亞群，在維持機體免疫自穩、調控免疫應答方面起重要作用[2-3]。近年來，有研究探討了Treg在肺動脈高壓發病機制中的作用[4-5]。但目前尚無CPH患者體內Treg的相關數據。因此，本研究通過檢測CPH患者外周血中Treg細胞及其相關細胞因子的表達，探討Treg細胞及其相關細胞因子的臨床意義。
對象與方法
一 對象
納入2011年6月至2013年3月本院確診CPH患者65例(CPH組)。其中，男43例，女22例；年齡55~81歲，平均(62.5±3.5)歲。其診斷和分級參照2007年中華醫學會呼吸病學會慢性阻塞性肺疾病和紐約心臟協會肺動脈壓分級診斷標準[6-7]。根據超聲心動圖的肺動脈收縮壓(PASP)檢測結果，將其分為輕度肺動脈高壓組[CPH1組，PASP 40~55 mm Hg (1 mm Hg=0.133kPa)]和中重度肺動脈高壓組(CPH2組，PASP≥55 mm Hg)，其中CPH1患者47例，CPH2患者18例。40例PASP<30 mm Hg的慢阻肺患者為對照組。其中，男28例，女12例；年齡62～75歲，平均(61.7±4.3)歲。所有受試者無慢阻肺急性加重表現；無明顯肝腎功能不全；無腫瘤化放療史；無嚴重高血壓及左心功能不全史；1個月內無激素和免疫抑制劑使用史。
二 方法
1．主要試劑和儀器：淋巴細胞分離液(Ficoll)購自上海生化試劑二廠；調節性T細胞檢測試劑盒購自eBioscience公司；白細胞介素(IL)-6、IL-10和腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國Invitrogen公司，FACS Calibur流式細胞儀為美國BD公司產品。
2．外周血淋巴細胞制備：參考文獻[8]的方法。肝素抗凝的外周靜脈血4 mL，加入等量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋后以2 000 r/min離心10 min，上清液置-80 ℃凍存備用，沉淀細胞用PBS調整濃度至1×107/mL，緩緩加入裝有底層100%(比重1.077)、中間層75%(比重1.055)的Ficoll液上，經1 800 r/min離心20 min，吸取100%液面上的薄層即為富含T細胞的群體。上述密度梯度離心法分離制備淋巴細胞懸液。所得細胞經緩沖液洗滌后備用。
3．流式細胞術檢測外周血中Treg細胞：參考文獻[9]的方法。調整已制備的單個細胞懸液為每管1×106/mL，加緩沖液后1 500 r/min洗滌2次，按照試劑盒說明分別加入三色熒光素標記抗體(藻紅蛋白標記的CD4、異硫氰酸熒光素標記的CD25、別藻青蛋白標記的CD127)及同型對照IgG，經孵育及緩沖液充分洗滌后進行流式細胞儀檢測，WinMDI 2.9軟件分析并作圖(圖 1)。計算Treg細胞占CD4+T細胞的比例。
圖1
流式細胞儀檢測Treg細胞右上角黑色小方框內為CD4+CD25highCD127low Treg細胞
4．ELISA法檢測外周血血清中IL-6、IL-10和TNF-α含量：抽取患者與正常對照組外周靜脈血各 2 mL，分離血清采用ELISA法進行檢測，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。
三 統計學處理
采用SPSS 11.5統計軟件進行數據統計分析。數據以
結果
一 對照組、CPH組患者外周血中Treg細胞的比例
對照組、CPH患者外周血中均可檢測到Treg細胞，其占CD4+T細胞比例分別為(9.04±2.11)%和(7.41±1.12)%，差異有統計學意義(t=5.224,P<0.05)。結果見圖 2。
二 對照組、CPH組患者外周血血清中IL-10、IL-6和TNF-α含量
1.外周血血清中IL-10含量：CPH患者、對照組患者外周血血清中IL-10含量分別為(4.47±0.88)、(5.18±0.26) pg/mL，差異有統計學意義(t=4.563,P<0.05)。結果見圖 3。
2.外周血血清中IL-6含量：CPH患者、對照組患者外周血血清中IL-6含量分別為(7.49±0.95)、(6.76±0.35) pg/mL，差異有統計學意義(t=4.992,P<0.05)。結果見圖 4。
3.外周血血清中TNF-α含量：CPH患者、對照組患者外周血血清中TNF-α含量分別為(28.61±9.16)、(19.64±4.85) pg/mL，差異有統計學意義(t=4.237,P<0.05)。結果見圖 5。
圖2
對照組、CPH組患者外周血中 Treg細胞占CD4+T細胞比例 ? ?圖 3 對照組、CPH組患者外周血血清中IL-10含量 ? ?圖 4 對照組、CPH組患者外周血血清中IL-6 含量 ? ?圖 5 對照組、CPH組患者外周血血清中TNF-α含量 ? ?圖 6 CPH患者外周血中Treg細胞比例與CPH分級的關系
三 CPH患者外周血中Treg細胞比例和血清中IL-10、IL-6、TNF-α含量的相關性
CPH患者外周血中Treg細胞比例和血清中IL-10 含量呈正相關(r=0.41，P<0.05)，和血清中TNF-α、IL-6含量呈負相關(r=0.45和0.37，P<0.05)。
四 CPH患者外周血中Treg細胞比例與CPH病情程度的關系
CPH1組患者外周血中Treg細胞比例為(10.47±2.55)%，CPH2組Treg細胞比例為(7.42±1.03)%。重度CPH患者外周血中Treg細胞比例減少，二者相比差異有統計學意義(t=8.103，P<0.05)。結果見圖 6。
討論
肺動脈高壓是一組常見的肺血管病變，以肺動脈壓力升高為特征，伴有肺血管收縮、血管重塑甚至血栓形成等現象。繼發于慢阻肺的肺動脈高壓發生發展機制復雜，存在一定的遺傳基因、離子通道、血管活性物質失衡、增殖或/和凋亡等相關機制。肺動脈高壓和炎癥機制相關，肺動脈高壓患者血液循環中可以檢測到多種炎癥因子，包括白細胞介素家族和腫瘤壞死因子家族成員等[10]。本研究以CPH患者為研究對象，采用不合并肺動脈高壓的慢阻肺患者作為對照組。結果發現，CPH外周血中Treg細胞數量、IL-10的含量減少，而IL-6和TNF-α的含量增多，顯示CPH患者體內存在特定的細胞及細胞因子調節紊亂。有研究發現，IL-6作為前炎癥因子能夠誘導急性炎癥反應，損傷血管內皮細胞，TNF-α可進一步誘導IL-6的合成，同時還會誘導血管內皮細胞凋亡，而IL-10含量的減少削弱了機體對炎癥反應的抑制能力[11-13]。CPH體內免疫紊亂是如何產生，又是通過何種機制導致肺動脈內皮受損目前尚無研究報道證實，但可以明確的是，Treg和上述細胞因子的變化起了一定的作用。
Treg細胞是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，其在維持機體免疫穩態的過程中起著相當重要的角色[14]。研究顯示，Treg細胞在維持血管內皮的正常功能，防止機體炎癥因子過度表達而導致的血管內皮損傷過程中發揮重要作用[15]。在某些慢性心功能不全患者體內可出現Treg細胞的比例失調，這種數量的變化可能和機體免疫代謝負荷有關，Treg細胞數量的降低使機體對T細胞及其細胞因子的活化的抑制效應減弱而誘發免疫損傷[16]。最近有體內研究顯示，IL-6的存在可以誘導初始細胞向Th17轉化同時減少Treg細胞的生成，這些變化減弱了Treg細胞的免疫抑制功能[17-18]。本研究結果提示，CPH患者外周血血清中IL-10、TNF-α和IL-6 含量和Treg細胞比例存在明顯的相關性，提示IL-6、IL-10、TNF-α和Treg細胞共同參與了CPH的疾病過程。由于本組患者1個月內均無糖皮質激素使用史，因此這些變化可能與慢阻肺患者免疫低下有關，相關機制尚有待進一步研究明確。
此外，本研究還發現，CPH患者外周血Treg細胞數量較對照組有所減少，而且隨肺動脈壓力的增加，外周血中Treg細胞比例降低。由此推測，CPH患者體內因Treg細胞減少，導致其免疫抑制效應不足，進一步促進炎性因子的釋放，加重血管內皮的免疫損傷，并最終引起CPH的發生發展。因此，Treg細胞數量減少而導致IL-6和TNF-α的增多可能是CPH的成因之一。致炎因子的增多促進了機體免疫應答，加劇體內原有的炎癥反應，最終導致動脈血管內膜的免疫損傷并進一步發展為肺動脈高壓。
綜上，本研究發現CPH患者體內存在Treg細胞及IL-10、IL-6和TNF-α等多種細胞因子的改變。可以設想，增強Treg細胞的活性，調節Treg細胞及其細胞因子的平衡，進而調節CPH患者的機體免疫狀態，控制炎癥反應，可能為CPH的免疫治療提供新的思路。然而，目前肺動脈漂浮導管測壓是肺動脈高壓診斷和分級的“金標準”，本研究由于醫療條件限制采用了心臟超聲檢查結果作為肺動脈高壓的分級標準，此為研究設計的不足處，需在今后的研究中進一步完善。
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)合并肺動脈高壓(chronic obstructive pulmonary disease combined pulmonary hypertension，CPH)發病機制較為復雜，自身免疫的過度激活及其產生的持續炎癥反應在CPH的發病機制中扮演重要角色，其中T細胞亞群的異常分化及其導致的細胞因子分泌異常成為細胞免疫失控的主要環節[1]。CD4+CD25highCD127low調節性T細胞(CD4+CD25highCD127low regulatoryTcell，Treg) 是近年來確定的一類具有免疫調節功能的T細胞亞群，在維持機體免疫自穩、調控免疫應答方面起重要作用[2-3]。近年來，有研究探討了Treg在肺動脈高壓發病機制中的作用[4-5]。但目前尚無CPH患者體內Treg的相關數據。因此，本研究通過檢測CPH患者外周血中Treg細胞及其相關細胞因子的表達，探討Treg細胞及其相關細胞因子的臨床意義。
對象與方法
一 對象
納入2011年6月至2013年3月本院確診CPH患者65例(CPH組)。其中，男43例，女22例；年齡55~81歲，平均(62.5±3.5)歲。其診斷和分級參照2007年中華醫學會呼吸病學會慢性阻塞性肺疾病和紐約心臟協會肺動脈壓分級診斷標準[6-7]。根據超聲心動圖的肺動脈收縮壓(PASP)檢測結果，將其分為輕度肺動脈高壓組[CPH1組，PASP 40~55 mm Hg (1 mm Hg=0.133kPa)]和中重度肺動脈高壓組(CPH2組，PASP≥55 mm Hg)，其中CPH1患者47例，CPH2患者18例。40例PASP<30 mm Hg的慢阻肺患者為對照組。其中，男28例，女12例；年齡62～75歲，平均(61.7±4.3)歲。所有受試者無慢阻肺急性加重表現；無明顯肝腎功能不全；無腫瘤化放療史；無嚴重高血壓及左心功能不全史；1個月內無激素和免疫抑制劑使用史。
二 方法
1．主要試劑和儀器：淋巴細胞分離液(Ficoll)購自上海生化試劑二廠；調節性T細胞檢測試劑盒購自eBioscience公司；白細胞介素(IL)-6、IL-10和腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國Invitrogen公司，FACS Calibur流式細胞儀為美國BD公司產品。
2．外周血淋巴細胞制備：參考文獻[8]的方法。肝素抗凝的外周靜脈血4 mL，加入等量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋后以2 000 r/min離心10 min，上清液置-80 ℃凍存備用，沉淀細胞用PBS調整濃度至1×107/mL，緩緩加入裝有底層100%(比重1.077)、中間層75%(比重1.055)的Ficoll液上，經1 800 r/min離心20 min，吸取100%液面上的薄層即為富含T細胞的群體。上述密度梯度離心法分離制備淋巴細胞懸液。所得細胞經緩沖液洗滌后備用。
3．流式細胞術檢測外周血中Treg細胞：參考文獻[9]的方法。調整已制備的單個細胞懸液為每管1×106/mL，加緩沖液后1 500 r/min洗滌2次，按照試劑盒說明分別加入三色熒光素標記抗體(藻紅蛋白標記的CD4、異硫氰酸熒光素標記的CD25、別藻青蛋白標記的CD127)及同型對照IgG，經孵育及緩沖液充分洗滌后進行流式細胞儀檢測，WinMDI 2.9軟件分析并作圖(圖 1)。計算Treg細胞占CD4+T細胞的比例。
圖1
流式細胞儀檢測Treg細胞右上角黑色小方框內為CD4+CD25highCD127low Treg細胞
4．ELISA法檢測外周血血清中IL-6、IL-10和TNF-α含量：抽取患者與正常對照組外周靜脈血各 2 mL，分離血清采用ELISA法進行檢測，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。
三 統計學處理
采用SPSS 11.5統計軟件進行數據統計分析。數據以
結果
一 對照組、CPH組患者外周血中Treg細胞的比例
對照組、CPH患者外周血中均可檢測到Treg細胞，其占CD4+T細胞比例分別為(9.04±2.11)%和(7.41±1.12)%，差異有統計學意義(t=5.224,P<0.05)。結果見圖 2。
二 對照組、CPH組患者外周血血清中IL-10、IL-6和TNF-α含量
1.外周血血清中IL-10含量：CPH患者、對照組患者外周血血清中IL-10含量分別為(4.47±0.88)、(5.18±0.26) pg/mL，差異有統計學意義(t=4.563,P<0.05)。結果見圖 3。
2.外周血血清中IL-6含量：CPH患者、對照組患者外周血血清中IL-6含量分別為(7.49±0.95)、(6.76±0.35) pg/mL，差異有統計學意義(t=4.992,P<0.05)。結果見圖 4。
3.外周血血清中TNF-α含量：CPH患者、對照組患者外周血血清中TNF-α含量分別為(28.61±9.16)、(19.64±4.85) pg/mL，差異有統計學意義(t=4.237,P<0.05)。結果見圖 5。
圖2
對照組、CPH組患者外周血中 Treg細胞占CD4+T細胞比例 ? ?圖 3 對照組、CPH組患者外周血血清中IL-10含量 ? ?圖 4 對照組、CPH組患者外周血血清中IL-6 含量 ? ?圖 5 對照組、CPH組患者外周血血清中TNF-α含量 ? ?圖 6 CPH患者外周血中Treg細胞比例與CPH分級的關系
三 CPH患者外周血中Treg細胞比例和血清中IL-10、IL-6、TNF-α含量的相關性
CPH患者外周血中Treg細胞比例和血清中IL-10 含量呈正相關(r=0.41，P<0.05)，和血清中TNF-α、IL-6含量呈負相關(r=0.45和0.37，P<0.05)。
四 CPH患者外周血中Treg細胞比例與CPH病情程度的關系
CPH1組患者外周血中Treg細胞比例為(10.47±2.55)%，CPH2組Treg細胞比例為(7.42±1.03)%。重度CPH患者外周血中Treg細胞比例減少，二者相比差異有統計學意義(t=8.103，P<0.05)。結果見圖 6。
討論
肺動脈高壓是一組常見的肺血管病變，以肺動脈壓力升高為特征，伴有肺血管收縮、血管重塑甚至血栓形成等現象。繼發于慢阻肺的肺動脈高壓發生發展機制復雜，存在一定的遺傳基因、離子通道、血管活性物質失衡、增殖或/和凋亡等相關機制。肺動脈高壓和炎癥機制相關，肺動脈高壓患者血液循環中可以檢測到多種炎癥因子，包括白細胞介素家族和腫瘤壞死因子家族成員等[10]。本研究以CPH患者為研究對象，采用不合并肺動脈高壓的慢阻肺患者作為對照組。結果發現，CPH外周血中Treg細胞數量、IL-10的含量減少，而IL-6和TNF-α的含量增多，顯示CPH患者體內存在特定的細胞及細胞因子調節紊亂。有研究發現，IL-6作為前炎癥因子能夠誘導急性炎癥反應，損傷血管內皮細胞，TNF-α可進一步誘導IL-6的合成，同時還會誘導血管內皮細胞凋亡，而IL-10含量的減少削弱了機體對炎癥反應的抑制能力[11-13]。CPH體內免疫紊亂是如何產生，又是通過何種機制導致肺動脈內皮受損目前尚無研究報道證實，但可以明確的是，Treg和上述細胞因子的變化起了一定的作用。
Treg細胞是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，其在維持機體免疫穩態的過程中起著相當重要的角色[14]。研究顯示，Treg細胞在維持血管內皮的正常功能，防止機體炎癥因子過度表達而導致的血管內皮損傷過程中發揮重要作用[15]。在某些慢性心功能不全患者體內可出現Treg細胞的比例失調，這種數量的變化可能和機體免疫代謝負荷有關，Treg細胞數量的降低使機體對T細胞及其細胞因子的活化的抑制效應減弱而誘發免疫損傷[16]。最近有體內研究顯示，IL-6的存在可以誘導初始細胞向Th17轉化同時減少Treg細胞的生成，這些變化減弱了Treg細胞的免疫抑制功能[17-18]。本研究結果提示，CPH患者外周血血清中IL-10、TNF-α和IL-6 含量和Treg細胞比例存在明顯的相關性，提示IL-6、IL-10、TNF-α和Treg細胞共同參與了CPH的疾病過程。由于本組患者1個月內均無糖皮質激素使用史，因此這些變化可能與慢阻肺患者免疫低下有關，相關機制尚有待進一步研究明確。
此外，本研究還發現，CPH患者外周血Treg細胞數量較對照組有所減少，而且隨肺動脈壓力的增加，外周血中Treg細胞比例降低。由此推測，CPH患者體內因Treg細胞減少，導致其免疫抑制效應不足，進一步促進炎性因子的釋放，加重血管內皮的免疫損傷，并最終引起CPH的發生發展。因此，Treg細胞數量減少而導致IL-6和TNF-α的增多可能是CPH的成因之一。致炎因子的增多促進了機體免疫應答，加劇體內原有的炎癥反應，最終導致動脈血管內膜的免疫損傷并進一步發展為肺動脈高壓。
綜上，本研究發現CPH患者體內存在Treg細胞及IL-10、IL-6和TNF-α等多種細胞因子的改變。可以設想，增強Treg細胞的活性，調節Treg細胞及其細胞因子的平衡，進而調節CPH患者的機體免疫狀態，控制炎癥反應，可能為CPH的免疫治療提供新的思路。然而，目前肺動脈漂浮導管測壓是肺動脈高壓診斷和分級的“金標準”，本研究由于醫療條件限制采用了心臟超聲檢查結果作為肺動脈高壓的分級標準，此為研究設計的不足處，需在今后的研究中進一步完善。
