引用本文： 趙巍, 王小平, 周勇安, 閆小龍, 倪云峰, 田豐. 單免疫球蛋白白細胞介素1受體相關蛋白對香煙煙霧提取物刺激A549細胞后產生效應的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(1): 60-63. doi: 10.7507/1671-6205.2015014 復制
吸煙是多種呼吸道疾病的重要致病因素之一。長期大量吸煙可導致氣道、肺實質和肺血管的慢性炎癥。長期吸煙/炎癥刺激還可使肺部病變向肺癌轉化，嚴重危害生命健康[1]。因此，針對炎癥反應的機制進行有效的抑制是預防/治療吸煙導致的相關疾病并防止其向肺癌進一步轉化的關鍵。然而，目前臨床治療中尚缺乏針對此類炎癥反應特異性的阻斷靶點。研究表明香煙煙霧接觸可加速活性氧(ROS)的生成，導致氣道炎癥反應[1]。香煙煙霧導致的ROS升高是通過TLR4/MyD88/TRAF6/c-Src/NADPH氧化酶通路介導的，接著引起絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)及核因子κB(NF-κB)的激活，活化的NF-κB聚集于環氧化酶2(COX-2)的啟動子區引起COX-2表達的增加，COX-2表達增加又進一步導致前列腺素E2(PGE2)與白細胞介素6(IL-6)釋放增加，最終導致COX-2/PGE2/IL-6依賴的呼吸道炎癥反應[2]。單一免疫球蛋白白細胞介素1受體相關蛋白(SIGIRR或TIR8)是Toll-IL-1受體(TIR)超家族的成員之一，可以負性調節諸多Toll樣受體(TLRs)介導的固有免疫應答。研究發現SIGIRR對于脂多糖(LPS，香煙煙霧的主要成分)誘導的TLR4信號通路有抑制作用，因此推測SIGIRR對香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)誘導的炎癥反應有抑制作用[3-5]。本課題以小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞來源的A549細胞為研究對象，應用基因轉染的方法使SIGIRR在A549細胞中過表達，并利用報告基因系統、ELISA等方法，研究SIGIRR對CSE誘導的肺泡上皮細胞炎癥反應的影響和可能的機制。
材料與方法
一 材料
A549細胞為本實驗室保存細胞株，SIGIRR質粒[pcDNA3.1(+)-SIGIRR]由本室成功構建[6]，全蛋白提取試劑盒及蛋白定量試劑盒(BCA法)購自西安沃爾森生物技術公司。山羊抗人SIGIRR抗體購自安迪生物科技(上海)有限公司，總RNA提取試劑TRIzol、Lipofectamine2000購自英杰生命科技有限公司，反轉錄試劑盒購自上海根生生物科技有限公司，Taq酶、PCR buffer、dNTP購自康為世紀生物科技公司，雙熒光素酶報告系統試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司，人IL-6 ELISA試劑盒購自北京科盈美科技公司。
二 方法
1．CSE的制備：參照Lin等[1]的方法制備CSE。將10支去過濾嘴香煙與一個注射器驅動裝置連接抽吸而燃著，10 min燃完，吸入的煙霧經另一個出口通入50 mL無血清培養液中制成懸液。懸液用1 mol/L NaOH調至pH 7.4，經0.22μm微孔濾膜過濾備用。制備的CSE在30 min之內用于實驗。
2．細胞培養與轉染：A549細胞維持在含10%胎牛血清、10 000 U/mL青霉素和鏈霉素(Sigma)的高糖DMEM培養基(GIBCO)，37℃、5%CO2孵育箱中。將pcDNA3.1(+)-SIGIRR質粒轉染A549細胞。轉染前4 h將培養液更換為無雙抗培養液，轉染前再更換為無血清培養液。6孔板每孔加入4μg質粒與10μL Lipofectamine 2000，24孔板每孔加入800 ng質粒與2μL Lipofectamine 2000。操作按照Lipofectamine 2000說明書步驟進行。轉染后6 h移去無血清培養液，更換為無雙抗培養液。轉染24 h后收集細胞，以未轉染的細胞為對照，通過Real-time PCR及Western blot檢測細胞中SIGIRR表達。
3．A549細胞中SIGIRR的mRNA和蛋白表達水平的檢測：具體檢測方法按文獻[5]進行。收集細胞，使用TRIzol試劑提取A549細胞中總RNA，以其為模板，按照上海根生生物科技有限公司的反轉錄試劑盒說明書進行操作，得到A549細胞cDNA。設計SIGIRR、β-actin引物并由北京奧科生物公司合成。以反轉錄所得cDNA為模板進行PCR反應。使用RIPA裂解液冰上裂解細胞后，離心后收取上清液。使用蛋白定量試劑盒(BCA法)測定蛋白濃度。上樣前將蛋白放入沸水中煮5 min，使之變性。采用SDS-PAGE法(電壓100 V)蛋白電泳后，恒流200 mA，濕轉，將蛋白從凝膠轉移到硝酸纖維素膜上。轉移時間為2 h。封閉液為TBST加4%脫脂牛奶配制，室溫封閉2 h。用TSB稀釋的1:1 000山羊抗人SIGIRR抗體4℃孵育過夜，TSBT清洗后熒光二抗室溫孵育1 h。Odyssey紅外掃描儀分析結果。
4．A549培養液上清中IL-6、COX-2和ROS水平檢測：ELISA法檢測IL-6的濃度，雙熒光素酶報告系統檢測COX-2活性，化學發光法檢測ROS的水平。將A549細胞分為過表達SIGIRR組(通過基因轉染技術使A549細胞中SIGIRR過表達)和對照組(正常A549細胞)，使用制備的CSE加入細胞培養液中(總濃度50μg/mL)，培養24 h后，檢測各組中IL-6水平、COX-2活性和ROS水平。每個樣本設置3個復孔，檢測結果取平均值。
三 統計學處理
應用SPSS 16.0軟件對數據進行處理。計量數據均以
結果
一 SIGIRR在A549細胞及轉染SIGIRR表達質粒后A549細胞中的表達
RT-PCR檢測可見在A549細胞中SIGIRR mRNA的表達較弱，轉染SIGIRR表達質粒后SIGIRR mRNA表達量明顯上升(圖 1)。Western blot檢測結果與RT-PCR結果一致，A549細胞中有SIGIRR蛋白的表達，轉染SIGIRR表達質粒后SIGIRR蛋白水平也明顯上升(圖 2)。
圖1
A549細胞中SIGIRR mRNA表達
圖2
A549細胞中SIGIRR蛋白表達
1：A549；2：轉染SIGIRR表達質粒的A549
二 SIGIRR對CSE誘導A549細胞釋放ROS的抑制作用
化學發光法檢測結果發現，PBS處理過表達SIGIRR組A549細胞培養液上清中ROS的釋放水平低于對照組，但差異無統計學意義(P > 0.05)。經CSE刺激24 h后，過表達SIGIRR組A549細胞培養液上清中ROS的釋放水平明顯升高，但顯著低于對照組(P < 0.05)。提示CSE可以刺激肺泡上皮細胞釋放ROS，而轉染SIGIRR質粒可以降低肺泡上皮細胞ROS的釋放。結果見圖 3和表 1。
圖3
轉染SIGIRR表達質粒對A549細胞經CSE刺激后ROS釋放的影響
與對照組比較，*
表1
轉染SIGIRR表達質粒對A549細胞經CSE刺激后ROS、COX-2、IL-6表達的影響(n=3，三 SIGIRR對CSE誘導A549細胞COX-2表達的抑制作用
雙熒光素酶報告系統檢測結果發現，PBS處理過表達SIGIRR組A549細胞培養液上清中COX-2表達水平明顯低于對照組(P < 0.05)。經CSE刺激24 h后，過表達SIGIRR組A549細培養液上清中COX-2表達水平升高，但顯著低于對照組(P < 0.05)。說明CSE可以刺激肺泡上皮細胞COX-2表達，而轉染SIGIRR質粒可以抑制肺泡上皮細胞COX-2表達。結果見圖 4和表 1。
圖4
轉染SIGIRR表達質粒對A549細胞經CSE刺激后COX-2表達的影響
與對照組比較，*
四 SIGIRR對CSE誘導A549細胞產生IL-6的抑制作用
ELISA實驗結果顯示，PBS處理過表達SIGIRR組A549細胞培養液上清中IL-6釋放水平低于對照組(P < 0.05)。經CSE刺激24 h后，過表達SIGIRR組A549細胞培養液上清IL-6釋放水平明顯升高，但顯著低于對照組(P < 0.05)。說明CSE可以刺激肺泡上皮細胞產生炎癥反應，促進IL-6釋放，而轉染SIGIRR質粒可以抑制肺泡上皮細胞IL-6表達，從而使肺泡上皮細胞在炎癥環境下得到保護。結果見表 1。
討論
香煙煙霧是呼吸道慢性炎癥發生的重要誘導因素之一[5]，長期大量吸煙可導致呼吸道ROS釋放增加、COX-2高表達，從而導致氧化應激、介導炎性反應[4-6]。香煙煙霧已被證實在多種炎癥過程相關基因的表達調節中起重要作用[7]，其中在肺內炎癥反應的調節是通過TLR4/MyD88以及IL-1R1/MyD88依賴的信號通路來完成的[8]，這一過程表現為TLR4依賴性[9]，并需要兩種轉接蛋白MyD88和TRAF6的參與[10]。另外，香煙煙霧可以上調呼吸道上皮細胞中TLR4的表達[11]，而呼吸道COX-2的高表達是通過TLR4依賴的MyD88/TRAF6/c-Src/NADPH oxidase/MAPK/NF-κB通路介導的，香煙煙霧活化TLR4通路引起炎癥反應，同時伴有ROS、PGE2以及IL-6的生成[2]，當大量的ROS或自由基生成超過機體抗氧化能力的時候，氧化應激發生[12]。由于TLR4依賴的MyD88/TRAF6/c-Src/NADPH oxidase/MAPK/NF-κB通路是香煙煙霧誘發氣道炎癥的關鍵因素，那么有效地抑制這一通路也許就可以有效阻止或緩解這一炎癥反應。SIGIRR歸屬于TIR超家族(也被稱為TIR8)[13]，廣泛表達于各種上皮來源的細胞，包括肺泡上皮來源的A549細胞[14]。而SIGIRR與其他TIR家族的大多數成員不同，其細胞外Ig結構域含有單一的Ig，SIGIRR的細胞內結構域為高度保守的TIR域，但與IL-1R1相比缺乏兩個信號傳導必需的氨基酸Ser447和Tyr536。正因為這些結構上的差別，SIGIRR不能與IL-1結合并使其信號向下傳遞，反而會抑制包括IL-1、LPS等多種致炎因子觸發的信號轉導，其TIR結構域正是與TLR4相互作用以及抑制LPS信號所必須的。因此，SIGIRR可能在炎性反應疾病中發揮抑制作用[15]。
本研究通過RT-PCR、Western blot驗證了SIGIRR在A549細胞中的表達，提示SIGIRR在A549細胞中起作用。而過表達SIGIRR的A549細胞經CSE刺激后的ROS釋放水平、COX-2表達水平及IL-6釋放水平均顯著降低，證明SIGIRR能夠抑制CSE誘導的炎癥反應，這可能與SIGIRR可與TLR4、MyD88、IRAK及TRAF6分子形成復合物，從而抑制TLR4/MyD88/TRAF6/NF-κB通路信號轉導，來調節肺內炎癥反應有關[16]。
綜上所述，我們的研究在細胞水平初步說明在CSE導致的炎癥環境下，SIGIRR表達上調可以抑制CSE誘導的A549細胞ROS、COX-2及IL-6釋放和表達水平增加。這提示SIGIRR表達上調可以對吸煙所致呼吸道炎癥起到延緩、抑制的作用，為今后研究對CSE持續刺激引起的呼吸道慢性炎癥，在活體水平SIGIRR是否能起到減緩的作用提供新思路。
吸煙是多種呼吸道疾病的重要致病因素之一。長期大量吸煙可導致氣道、肺實質和肺血管的慢性炎癥。長期吸煙/炎癥刺激還可使肺部病變向肺癌轉化，嚴重危害生命健康[1]。因此，針對炎癥反應的機制進行有效的抑制是預防/治療吸煙導致的相關疾病并防止其向肺癌進一步轉化的關鍵。然而，目前臨床治療中尚缺乏針對此類炎癥反應特異性的阻斷靶點。研究表明香煙煙霧接觸可加速活性氧(ROS)的生成，導致氣道炎癥反應[1]。香煙煙霧導致的ROS升高是通過TLR4/MyD88/TRAF6/c-Src/NADPH氧化酶通路介導的，接著引起絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)及核因子κB(NF-κB)的激活，活化的NF-κB聚集于環氧化酶2(COX-2)的啟動子區引起COX-2表達的增加，COX-2表達增加又進一步導致前列腺素E2(PGE2)與白細胞介素6(IL-6)釋放增加，最終導致COX-2/PGE2/IL-6依賴的呼吸道炎癥反應[2]。單一免疫球蛋白白細胞介素1受體相關蛋白(SIGIRR或TIR8)是Toll-IL-1受體(TIR)超家族的成員之一，可以負性調節諸多Toll樣受體(TLRs)介導的固有免疫應答。研究發現SIGIRR對于脂多糖(LPS，香煙煙霧的主要成分)誘導的TLR4信號通路有抑制作用，因此推測SIGIRR對香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)誘導的炎癥反應有抑制作用[3-5]。本課題以小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞來源的A549細胞為研究對象，應用基因轉染的方法使SIGIRR在A549細胞中過表達，并利用報告基因系統、ELISA等方法，研究SIGIRR對CSE誘導的肺泡上皮細胞炎癥反應的影響和可能的機制。
材料與方法
一 材料
A549細胞為本實驗室保存細胞株，SIGIRR質粒[pcDNA3.1(+)-SIGIRR]由本室成功構建[6]，全蛋白提取試劑盒及蛋白定量試劑盒(BCA法)購自西安沃爾森生物技術公司。山羊抗人SIGIRR抗體購自安迪生物科技(上海)有限公司，總RNA提取試劑TRIzol、Lipofectamine2000購自英杰生命科技有限公司，反轉錄試劑盒購自上海根生生物科技有限公司，Taq酶、PCR buffer、dNTP購自康為世紀生物科技公司，雙熒光素酶報告系統試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司，人IL-6 ELISA試劑盒購自北京科盈美科技公司。
二 方法
1．CSE的制備：參照Lin等[1]的方法制備CSE。將10支去過濾嘴香煙與一個注射器驅動裝置連接抽吸而燃著，10 min燃完，吸入的煙霧經另一個出口通入50 mL無血清培養液中制成懸液。懸液用1 mol/L NaOH調至pH 7.4，經0.22μm微孔濾膜過濾備用。制備的CSE在30 min之內用于實驗。
2．細胞培養與轉染：A549細胞維持在含10%胎牛血清、10 000 U/mL青霉素和鏈霉素(Sigma)的高糖DMEM培養基(GIBCO)，37℃、5%CO2孵育箱中。將pcDNA3.1(+)-SIGIRR質粒轉染A549細胞。轉染前4 h將培養液更換為無雙抗培養液，轉染前再更換為無血清培養液。6孔板每孔加入4μg質粒與10μL Lipofectamine 2000，24孔板每孔加入800 ng質粒與2μL Lipofectamine 2000。操作按照Lipofectamine 2000說明書步驟進行。轉染后6 h移去無血清培養液，更換為無雙抗培養液。轉染24 h后收集細胞，以未轉染的細胞為對照，通過Real-time PCR及Western blot檢測細胞中SIGIRR表達。
3．A549細胞中SIGIRR的mRNA和蛋白表達水平的檢測：具體檢測方法按文獻[5]進行。收集細胞，使用TRIzol試劑提取A549細胞中總RNA，以其為模板，按照上海根生生物科技有限公司的反轉錄試劑盒說明書進行操作，得到A549細胞cDNA。設計SIGIRR、β-actin引物并由北京奧科生物公司合成。以反轉錄所得cDNA為模板進行PCR反應。使用RIPA裂解液冰上裂解細胞后，離心后收取上清液。使用蛋白定量試劑盒(BCA法)測定蛋白濃度。上樣前將蛋白放入沸水中煮5 min，使之變性。采用SDS-PAGE法(電壓100 V)蛋白電泳后，恒流200 mA，濕轉，將蛋白從凝膠轉移到硝酸纖維素膜上。轉移時間為2 h。封閉液為TBST加4%脫脂牛奶配制，室溫封閉2 h。用TSB稀釋的1:1 000山羊抗人SIGIRR抗體4℃孵育過夜，TSBT清洗后熒光二抗室溫孵育1 h。Odyssey紅外掃描儀分析結果。
4．A549培養液上清中IL-6、COX-2和ROS水平檢測：ELISA法檢測IL-6的濃度，雙熒光素酶報告系統檢測COX-2活性，化學發光法檢測ROS的水平。將A549細胞分為過表達SIGIRR組(通過基因轉染技術使A549細胞中SIGIRR過表達)和對照組(正常A549細胞)，使用制備的CSE加入細胞培養液中(總濃度50μg/mL)，培養24 h后，檢測各組中IL-6水平、COX-2活性和ROS水平。每個樣本設置3個復孔，檢測結果取平均值。
三 統計學處理
應用SPSS 16.0軟件對數據進行處理。計量數據均以
結果
一 SIGIRR在A549細胞及轉染SIGIRR表達質粒后A549細胞中的表達
RT-PCR檢測可見在A549細胞中SIGIRR mRNA的表達較弱，轉染SIGIRR表達質粒后SIGIRR mRNA表達量明顯上升(圖 1)。Western blot檢測結果與RT-PCR結果一致，A549細胞中有SIGIRR蛋白的表達，轉染SIGIRR表達質粒后SIGIRR蛋白水平也明顯上升(圖 2)。
圖1
A549細胞中SIGIRR mRNA表達
圖2
A549細胞中SIGIRR蛋白表達
1：A549；2：轉染SIGIRR表達質粒的A549
二 SIGIRR對CSE誘導A549細胞釋放ROS的抑制作用
化學發光法檢測結果發現，PBS處理過表達SIGIRR組A549細胞培養液上清中ROS的釋放水平低于對照組，但差異無統計學意義(P > 0.05)。經CSE刺激24 h后，過表達SIGIRR組A549細胞培養液上清中ROS的釋放水平明顯升高，但顯著低于對照組(P < 0.05)。提示CSE可以刺激肺泡上皮細胞釋放ROS，而轉染SIGIRR質粒可以降低肺泡上皮細胞ROS的釋放。結果見圖 3和表 1。
圖3
轉染SIGIRR表達質粒對A549細胞經CSE刺激后ROS釋放的影響
與對照組比較，*
表1
轉染SIGIRR表達質粒對A549細胞經CSE刺激后ROS、COX-2、IL-6表達的影響(n=3，三 SIGIRR對CSE誘導A549細胞COX-2表達的抑制作用
雙熒光素酶報告系統檢測結果發現，PBS處理過表達SIGIRR組A549細胞培養液上清中COX-2表達水平明顯低于對照組(P < 0.05)。經CSE刺激24 h后，過表達SIGIRR組A549細培養液上清中COX-2表達水平升高，但顯著低于對照組(P < 0.05)。說明CSE可以刺激肺泡上皮細胞COX-2表達，而轉染SIGIRR質粒可以抑制肺泡上皮細胞COX-2表達。結果見圖 4和表 1。
圖4
轉染SIGIRR表達質粒對A549細胞經CSE刺激后COX-2表達的影響
與對照組比較，*
四 SIGIRR對CSE誘導A549細胞產生IL-6的抑制作用
ELISA實驗結果顯示，PBS處理過表達SIGIRR組A549細胞培養液上清中IL-6釋放水平低于對照組(P < 0.05)。經CSE刺激24 h后，過表達SIGIRR組A549細胞培養液上清IL-6釋放水平明顯升高，但顯著低于對照組(P < 0.05)。說明CSE可以刺激肺泡上皮細胞產生炎癥反應，促進IL-6釋放，而轉染SIGIRR質粒可以抑制肺泡上皮細胞IL-6表達，從而使肺泡上皮細胞在炎癥環境下得到保護。結果見表 1。
討論
香煙煙霧是呼吸道慢性炎癥發生的重要誘導因素之一[5]，長期大量吸煙可導致呼吸道ROS釋放增加、COX-2高表達，從而導致氧化應激、介導炎性反應[4-6]。香煙煙霧已被證實在多種炎癥過程相關基因的表達調節中起重要作用[7]，其中在肺內炎癥反應的調節是通過TLR4/MyD88以及IL-1R1/MyD88依賴的信號通路來完成的[8]，這一過程表現為TLR4依賴性[9]，并需要兩種轉接蛋白MyD88和TRAF6的參與[10]。另外，香煙煙霧可以上調呼吸道上皮細胞中TLR4的表達[11]，而呼吸道COX-2的高表達是通過TLR4依賴的MyD88/TRAF6/c-Src/NADPH oxidase/MAPK/NF-κB通路介導的，香煙煙霧活化TLR4通路引起炎癥反應，同時伴有ROS、PGE2以及IL-6的生成[2]，當大量的ROS或自由基生成超過機體抗氧化能力的時候，氧化應激發生[12]。由于TLR4依賴的MyD88/TRAF6/c-Src/NADPH oxidase/MAPK/NF-κB通路是香煙煙霧誘發氣道炎癥的關鍵因素，那么有效地抑制這一通路也許就可以有效阻止或緩解這一炎癥反應。SIGIRR歸屬于TIR超家族(也被稱為TIR8)[13]，廣泛表達于各種上皮來源的細胞，包括肺泡上皮來源的A549細胞[14]。而SIGIRR與其他TIR家族的大多數成員不同，其細胞外Ig結構域含有單一的Ig，SIGIRR的細胞內結構域為高度保守的TIR域，但與IL-1R1相比缺乏兩個信號傳導必需的氨基酸Ser447和Tyr536。正因為這些結構上的差別，SIGIRR不能與IL-1結合并使其信號向下傳遞，反而會抑制包括IL-1、LPS等多種致炎因子觸發的信號轉導，其TIR結構域正是與TLR4相互作用以及抑制LPS信號所必須的。因此，SIGIRR可能在炎性反應疾病中發揮抑制作用[15]。
本研究通過RT-PCR、Western blot驗證了SIGIRR在A549細胞中的表達，提示SIGIRR在A549細胞中起作用。而過表達SIGIRR的A549細胞經CSE刺激后的ROS釋放水平、COX-2表達水平及IL-6釋放水平均顯著降低，證明SIGIRR能夠抑制CSE誘導的炎癥反應，這可能與SIGIRR可與TLR4、MyD88、IRAK及TRAF6分子形成復合物，從而抑制TLR4/MyD88/TRAF6/NF-κB通路信號轉導，來調節肺內炎癥反應有關[16]。
綜上所述，我們的研究在細胞水平初步說明在CSE導致的炎癥環境下，SIGIRR表達上調可以抑制CSE誘導的A549細胞ROS、COX-2及IL-6釋放和表達水平增加。這提示SIGIRR表達上調可以對吸煙所致呼吸道炎癥起到延緩、抑制的作用，為今后研究對CSE持續刺激引起的呼吸道慢性炎癥，在活體水平SIGIRR是否能起到減緩的作用提供新思路。
