引用本文： 黃艷, 吳春婷, 郭紅娟, 朱光發. 人核因子κBp65核定位信號缺失突變對A549細胞惡性表型的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(1): 52-59. doi: 10.7507/1671-6205.2015013 復制
肺癌目前占全球癌癥死亡原因的首位。據統計，2013年肺癌占所有女性癌癥死亡率的26%，占所有男性癌癥死亡率的28%[1]；過去30年間我國肺癌死亡率增加了464.84%，2008年肺癌占我國男性粗死亡率的0.48‰，占女性粗死亡率的0.22‰[2]。核因子κB(NF-κB)是一組重要的轉錄調節因子，可以通過調節多種細胞因子的表達參與腫瘤的發生、增殖、侵襲、遷移及化療耐藥等過程。近年來，大量研究證據表明NF-κB在肺癌組織和細胞內呈組成性激活，并且其激活水平與肺癌患者TNM分期和預后相關；NF-κB的激活可以促進肺癌細胞的發生、增殖、血管形成和遷移等過程；通過siRNA、IKK抑制劑或IκB超級抑制劑抑制NF-κB的表達，可以抑制肺癌細胞的增殖和遷移等生物學行為，亦可增強癌細胞對化療藥物的敏感性[3]。NF-κB蛋白家族有p65(RelA)、RelB、c-Rel、p50/p105(NF-κB1)和p52/p100(NF-κB2)5個亞基，p65/p50異源二聚體是NF-κB復合物中最常見的形式。在靜息狀態下，p65/p50二聚體與IκBα結合而滯留于細胞漿中；在細胞外信號刺激后，IKK激活，IκBα水解，使p65/p50的核定位信號(nuclear localization signals，NLS)暴露介導進入細胞核，NF-κBp65與目的DNA結合，從而調控靶基因的表達[4-5]。NF-κBp65蛋白從細胞漿轉位進入細胞核的過程是由NLS介導的，NLS通常是由約3~20個富含賴氨酸和甘氨酸殘基序列組成。NF-κBp65的NLS位于Rel同源結構域內第301~304位氨基酸殘基即KRKR(賴氨酸-甘氨酸-賴氨酸-甘氨酸)序列組成[6]。本研究直接以NF-κBp65的NLS為靶點，利用基因突變技術構建NLS缺失突變質粒即pcDNA3.1(+)-NF-κBp65ΔNLS(簡稱NF-κBp65ΔNLS)轉染低表達NF-κBp65的A549細胞株即A549/NF-κBp65 shRNA細胞，檢測細胞內NLS缺失突變NF-κBp65的細胞定位和表達水平，并觀察對肺癌細胞的增殖、遷移和粘附能力的影響，研究NF-κB信號通路中關鍵蛋白NF-κBp65的NLS對其細胞核轉位功能以及對肺癌細胞生物學行為的影響，為今后研究以NF-κBp65為靶點進行肺癌的預防和治療提供理論依據。
材料與方法
一 材料
pcDNA3.1(+)質粒(由本實驗室保存)；A549/NF-κBp65 shRNA穩轉細胞株(本實驗室保存)；質粒大量抽提試劑盒、AMV反轉錄試劑盒(Promega公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、RPMI-1640培養基(Gibco公司)，0.25%胰酶、青鏈霉素混合液(Solarbio公司)，NheⅠ、XhoⅠ限制性內切酶(Promega公司)，Lipofectamine 2000TM試劑(Invitrogen公司)，細胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒(上海生工生物公司)；單克隆鼠NF-κBp65抗體、單克隆鼠GAPDH抗體(Cell Signal公司)，FITC-羊抗鼠抗體(中杉金橋公司)，Alexa Fluor?羊抗鼠IgG熒光抗體(Invitrogen公司)；24孔Transwell培養板(Corning Costar公司)。
二 方法
1．人NF-κBp65ΔNLS真核表達質粒的構建：從GenBank查找人NF-κBp65基因序列[
2．細胞培養及質粒轉染：將A549/NF-κBp65 shRNA細胞用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基于37℃、5%CO2培養箱內培養，3 d換1次液，當細胞80%~90%鋪滿時用0.25%Trypsin-EDTA消化傳代。將細胞分為對照組、轉染pcDNA3.1(+)組和轉染NF-κBp65ΔNLS組，其中每組各分為腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激組和無TNF-α刺激組。將A549/NF-κBp65 shRNA細胞按Lipofectamine 2000TM說明書接種于細胞培養孔板中，使其在24 h內細胞密度達到70%~80%，分別將pcDNA3.1(+)、NF-κBp65ΔNLS質粒用無血清OPTI-MEM稀釋，轉染試劑同樣用無血清OPTI-MEM稀釋，將兩種稀釋液混勻，室溫靜置20 min，均勻滴加到A549/NF-κBp65 shRNA細胞中，培養6 h后換為完全培養基繼續培養。
3．細胞間接免疫熒光：接種于24孔板爬片上的A549/NF-κBp65 shRNA細胞，在轉染48 h后更換為無血清培養基，3組細胞中TNF-α刺激組加入20 ng/mL TNF-α刺激30 min，棄培養基，預冷PBS輕洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS輕洗3次，0.5%Triton 100×通透20 min，PBS輕洗3次，5%BSA封閉60 min，單克隆鼠NF-κBp65抗體孵育，4℃過夜，PBS輕洗3次，FITC-羊抗鼠抗體避光孵育1 h，DAPI封片后經倒置熒光顯微鏡觀察拍照。
4．實時熒光定量-PCR(qRT-PCR)：將A549/NF-κBp65 shRNA細胞接種于6孔板上，在細胞轉染48 h后，提取各組細胞總RNA，反轉錄獲得cDNA。根據GenBank中人NF-κBp65基因的mRNA序列設計引物，以人GAPDH基因作為內參。NF-κBp65 cDNA引物序列：上游5′-CCCCACGAGCTTGTAGG AAAG-3′，下游5′-CCAGGTTCTGGAAACTGTGGAT-3′，擴增片段為128 bp；GAPDH cDNA引物序列：上游5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游5′-GCC CAATACGACCAAATCC-3′，擴增片段為66 bp。引物均由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。qRT-PCR反應體系為20μL體系，反應條件：95℃5 min，進入45次循環(95℃30 s，58℃45s采集熒光)，最后55℃5 min(繪制溶解曲線)。
5．Western blot：將A549/NF-κBp65 shRNA細胞接種于6孔板上，在細胞轉染48 h后，加0.25%胰蛋白酶200μL消化細胞，置于1.5 mL離心管中，離心棄上清后加入50μL RIPA組織裂解液置于冰上，反復震蕩、充分裂解，離心取上清，即為總蛋白；按細胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒說明書分離提取細胞漿蛋白和細胞核蛋白。BCA法測蛋白濃度，將各組織樣品濃度調至相同，保證每個電泳孔道加入50μg蛋白混合樣品，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后轉膜，5%脫脂奶粉封閉，室溫孵育60 min，單克隆鼠NF-κBp65抗體、單克隆鼠GAPDH抗體孵育，4℃過夜，1×TBST清洗3次，Alexa Fluor?羊抗鼠IgG熒光抗體，室溫孵育1 h，1×TBST清洗3次。使用LI-COR Odyssey Infrared Imaging System成像儀顯像拍照。以同一泳道中NF-κBp65和GAPDH條帶灰度比值反映NF-κBp65蛋白表達水平。
6．細胞增殖實驗-MTT法：將1×103個/孔的A549/NF-κBp65 shRNA細胞接種于96孔板，每組設置6個復孔，分別于轉染24、48和72 h后每孔加入20μL MTT溶液(終濃度5 mg/mL)，輕輕混勻，37℃、5%CO2培養箱繼續培養4 h，在酶聯免疫檢測儀490 nm處檢測各孔吸光值，計算各組細胞增殖率，細胞增殖率(%)=(實驗組吸光值/對照組吸光值－1)×100%。
7．細胞遷移實驗-Transwell法：細胞轉染24 h至對數生長期，饑餓培養過夜，0.25%胰酶消化細胞，調整細胞密度為2×105/mL，取200μL細胞懸液加至24孔Transwell小室的上室，下室預先加入600μL含有10% FBS的1640培養基，37℃、5%CO2培養箱培養24 h；取出小室，擦除小室內壁細胞，PBS輕洗2遍，遷移至小室外面的細胞經DAPI染核，在倒置熒光顯微鏡下觀察計數，計數各組遷移細胞數。
8.細胞粘附實驗：取10 mg/mL BSA和10 mg/L纖維粘連蛋白按50μL/孔加入96孔板中，4℃過夜，BSA為對照基底；次日吸出多余液體，每孔加入50μL含10 mg/mL牛血清白蛋白的無血清培養基，37℃靜置30 min；0.25%胰酶消化轉染后48 h的細胞，調整細胞數為1×103/孔接種于96孔板中，每組設置3個復孔，37℃、5%CO2培養箱培養4 h后棄上清，PBS清洗2~3次，4%多聚甲醛固定20 min，蘇木素染色10 min，倒置顯微鏡200倍下觀察并計數5個視野平均粘附細胞數。
三 統計學處理
采用SPSS 18.0統計軟件對實驗結果進行統計分析。數據采用
結果
一 人NF-κBp65ΔNLS真核表達質粒構建結果
將具有氨芐抗性的陽性穿刺菌株克隆提取質粒，用NheⅠ、XhoⅠ限制性內切酶進行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳可見分別為5 344 bp和1 644 bp的兩條條帶。結果見圖 1。將所提質粒命名為NF-κBp65ΔNLS質粒，挑取酶切鑒定正確的菌液測序，測序引物為T7：5′-TAATACGACTCACTATAGG G-3′；BGH：5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3′。由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成測序，其結果顯示：NF-κBp65ΔNLS質粒測序結果與設計序列一致，成功將NF-κBp65 cDNA質粒中編碼NF-κBp65NLS的12個堿基缺失突變，證實NF-κBp65ΔNLS真核表達質粒構建成功。結果見圖 2。
圖1
NF-κBp65ΔNLS質粒和NF-κBp65cDNA質粒經NheⅠ、XhoⅠ限制性內切酶雙酶切鑒定結果
圖2
人NF-κBp65ΔNLS質粒部分測序結果?a．NF-κBp65 cDNA質粒部分測序結果，黑色背景內為編碼NF-κBp65 NLS的12個堿基；b．NF-κBp65ΔNLS質粒部分測序結果，顯示編碼NF-κBp65 NLS的12個堿基缺失突變
二 NF-κBp65ΔNLS質粒對A549/NF-κBp65 shRNA細胞NF-κBp65表達的影響
1．qRT-PCR結果：對照組與pcDNA3.1(+)組A549/NF-κBp65 shRNA細胞比較，NF-κBp65 mRNA的表達水平差異無統計學意義(1.04±0.21比1.23±0.22，P=0.556 3)，NF-κBp65ΔNLS組A549/NF-κBp65 shRNA細胞的NF-κBp65 mRNA表達水平(10.63±0.84)明顯高于對照組和pcDNA3.1(+)組(P < 0.01)。結果見圖 3。
圖3
各組細胞NF-κBp65 mRNA表達水平的比較
NS：
2．細胞間接免疫熒光結果：NF-κBp65ΔNLS組與對照組、pcDNA3.1(+)組A549/NF-κBp65 shRNA細胞比較，NF-κBp65蛋白表達明顯增多，且主要位于細胞漿內；經TNF-α刺激后，NF-κBp65ΔNLS組細胞漿內NF-κBp65蛋白并未轉移至細胞核內。而pcDNA3.1(+)組與對照組NF-κBp65蛋白在細胞漿和細胞核內均有少量表達；經TNF-α刺激后，NF-κBp65可轉移至細胞核內。結果見圖 4。
圖4
TNF-α(－)：未經TNF-α刺激；TNF-α(+)：經TNF-α刺激
各組細胞NF-κBp65免疫熒光染色結果(×200)
3．Western blot結果：提取NF-κBp65總蛋白結果顯示，對照組與pcDNA3.1(+)組A549/NF-κBp65 shRNA細胞比較，NF-κBp65總蛋白表達水平(0.53±0.02比0.59±0.04，P=0.276 8)無明顯差異，NF-κBp65ΔNLS組A549/NF-κBp65 shRNA細胞的NF-κBp65總蛋白表達水平(1.07±0.06)明顯高于對照組和pcDNA3.1(+)組(P < 0.01)。細胞核蛋白/漿蛋白分離提取NF-κBp65蛋白結果顯示，未經TNF-α刺激時，對照組與pcDNA3.1(+)組比較，細胞漿NF-κBp65蛋白表達水平(0.74±0.10比0.84±0.08，P=0.503 8)、細胞核NF-κBp65蛋白表達水平(0.67±0.08比0.73±0.10，P=0.665 0)均無明顯差異，NF-κBp65ΔNLS組細胞漿NF-κBp65蛋白表達水平(1.18±0.05)明顯高于對照組及pcDNA3.1(+)組(P < 0.05)，而細胞核NF-κBp65蛋白表達水平(0.79±0.09)與對照組及pcDNA3.1(+)組無明顯差異(P值分別為0.359 5，0.665 4)。經TNF-α刺激(20 ng/μL，30 min)后，對照組、pcDNA3.1(+)組和NF-κBp65ΔNLS組A549/NF-κBp65 shRNA細胞與未刺激組比較，細胞漿內的NF-κBp65蛋白均未明顯進入細胞核內(P > 0.05)。結果見圖 5。
圖5
細胞NF-κBp65蛋白表達水平的比較?a．細胞內總NF-κBp65蛋白電泳結果；b．TNF-α刺激前后細胞漿及細胞核內NF-κBp65蛋白電泳結果；c．細胞內總NF-κBp65蛋白與GAPDH灰度比值結果；d．TNF-α刺激前后細胞漿內NF-κBp65蛋白與GAPDH灰度比值結果；e．TNF-α刺激前后細胞核內NF-κBp65蛋白與GAPDH灰度比值結果
NS：
三 NF-κBp65ΔNLS質粒對A549/NF-κBp65 shRNA細胞惡性表型的影響
1．細胞增殖能力鑒定結果：對照組與pcDNA3.1(+)組A549/NF-κBp65 shRNA細胞比較，細胞增殖率在轉染后第24、48和72 h均無顯著差異[(15.15±8.62)%比(16.48±5.99)%，P=0.910 6；(61.75±5.63)%比(52.98±4.05)%，P=0.333 6；(88.56±5.99)%比(79.02±0.66)%，P=0.254 2]；NF-κBp65ΔNLS組A549/NF-κBp65 shRNA細胞在轉染后第24 h的細胞增殖率(24.20±5.95)%與對照組和pcDNA3.1(+)組相比均無顯著差異(P=0.478 6，P=0.457 3)，在轉染后第48 h和72 h的細胞增殖率[(106.50±7.04)%，(176.60±12.88)%]明顯高于對照組和pcDNA3.1(+)組(P < 0.05)。結果見圖 6。
圖6
各組細胞增殖率的比較
*
2．細胞遷移能力鑒定結果：對照組與pcDNA3.1(+)組A549/NF-κBp65 shRNA細胞比較，細胞遷移數無明顯差異(92.3±5.8比90.3±8.5，P=0.855 6)，NF-κBp65ΔNLS組細胞的遷移數(137.7±13.9)明顯多于對照組與pcDNA3.1(+)組A549/NF-κBp65 shRNA細胞(P < 0.05)。結果見圖 7。
圖7
各組細胞遷移細胞計數的比較?a．遷移細胞DAPI染色鏡檢結果(×100)；b．遷移細胞計數比較結果
NS：
3．細胞粘附能力鑒定結果：對照組、pcDNA3.1(+)組和NF-κBp65ΔNLS組A549/NF-κBp65 shRNA細胞粘附細胞數的均值分別為200.3、184.6、320.0個。對照組與pcDNA3.1(+)組粘附細胞數無明顯差異[(200.3±17.8)個比(184.6±10.4)個，P=0.488 3]；NF-κBp65ΔNLS組的粘附細胞數[(320.0±11.1)個]明顯高于對照組與pcDNA3.1(+)組(P < 0.05)。結果見圖 8。
圖8
各組細胞粘附細胞計數的比較?a．粘附細胞蘇木素染色鏡檢結果(×50)；b．粘附細胞計數比較結果
NS：
討論
NF-κB信號通路參與了肺癌的發生、發展、轉移等多個生物學過程，并與肺癌細胞對放療及化療的抵抗相關[8]。以NF-κB信號通路為靶點抑制NF-κB的活化可能為肺癌的治療提供一條新的途徑。目前研究的NF-κB信號通路抑制劑主要通過直接和間接途徑抑制NF-κB的活化。直接抑制劑以NF-κB信號通路的多個蛋白為靶點，如IKK激活抑制劑、IκBα降解抑制劑、NF-κB核轉位及DNA結合抑制劑等為靶點的抑制劑。間接抑制劑是以可間接激活NF-κB信號通路的蛋白為靶點的抑制劑。NF-κB激活后由細胞漿內轉位進入細胞核是其發揮調控目的基因表達的重要過程，抑制NF-κB的核轉位使其滯留于細胞漿中是抑制NF-κB信號通路的一種途徑。研究顯示脫氫環氧甲基醌霉素[9]、潘多汀A等[10]可以特異性抑制TNF-α刺激后肺腺癌A549細胞內NF-κBp65向核內轉位過程，進而抑制A549細胞的增殖，并誘導其凋亡過程，但其機制并不明確。
NF-κBp65蛋白從細胞漿轉位進入細胞核的過程是由NLS介導的，因此干擾NF-κBp65的核轉位過程可能成為抑制NF-κB信號通路的重要靶點之一。本研究將編碼NF-κBp65蛋白NLS序列的基因進行缺失突變，構建真核表達質粒并轉染A549/NF-κBp65 shRNA細胞，發現A549/NF-κBp65 shRNA細胞內NF-κBp65 mRNA及蛋白表達水平均明顯升高，說明將NF-κBp65的NLS缺失突變不影響NF-κBp65ΔNLS質粒在細胞內的轉錄及翻譯水平，仍可實現NF-κBp65的過表達。同時，過表達的NF-κBp65蛋白滯留于細胞漿內，經過TNF-α刺激后并未明顯向細胞核內轉運，說明可以通過干擾NF-κBp65 NLS序列表達這一方法阻止NF-κBp65對目的基因的調控作用。
本研究還發現，將NF-κBp65ΔNLS轉染A549/NF-κBp65 shRNA細胞后，A549/NF-κBp65 shRNA細胞的增殖、遷移和粘附能力不但沒有減弱反而均有不同程度增強，說明細胞漿內NF-κBp65蛋白表達量增多，雖然無法進入細胞核內發揮轉錄調節作用，但在細胞漿內仍對肺癌細胞的惡性生物學行為有一定的調控作用，但其機制并不明確。
在細胞質中NF-κB的組合形式有很多種，不同的二聚體有不同的轉錄激活特性[6]，其中以p50/p65組成的異源二聚體最普遍，主要通過經典激活途徑發揮生物學功能，而CD40、淋巴毒素-β等因子可以激活非經典途徑使p52/RelB二聚體活化并轉移至核內激活目標基因[11]。Dimitrakopoulos等[12]在對109例非小細胞肺癌組織樣本研究中發現p52、RelB的表達水平與肺癌分期相關；另有研究發現p52表達增多可減弱紫杉醇誘導下肺癌細胞的凋亡，抑制p52的表達可使細胞增殖減弱[13]；其他NF-κB二聚體如p50/RelB、p50/cRel等也具有調節轉錄功能。因此，我們猜想可能由于抑制了p65的核轉位功能，使其滯留于細胞漿內，NF-κB經典激活途徑作用減弱，p50與RelB、cRel形成二聚體增多，同時非經典激活途徑p52/RelB二聚體入核過程增強，通過調節目標基因，促進了A549/NF-κBp65 shRNA細胞的惡性生物學行為。
另有研究發現IκB基因啟動子的多態性與腫瘤的發生密切相關，IκB的表達與腫瘤的惡性程度及分化程度高度相關，并可作為判斷患者預后的一項重要指標[14-15]；神經膠質細胞瘤中，過表達IκB可以顯著抑制基質金屬蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達，進而抑制腫瘤的侵襲轉移能力[16]。IκB發揮生物學功能的可能分子機制可能主要集中在兩個方面：(1)由于IκB存在多種生長因子受體的結合位點(如PDGF-R、IGF-R、EGF-R等)，游離態的IκB可與這些生長因子受體相互作用，通過競爭性抑制作用阻斷外界生長因子對腫瘤的增殖信號；(2)IκB可以促進腫瘤細胞凋亡，如在肝癌細胞內，過表達IκB可以增強腫瘤細胞對TNF-α介導凋亡的敏感性，促進腫瘤細胞凋亡[17]。由于NF-κBp65/p50二聚體主要與IκBα形成三聚體形式存在于細胞漿內，我們考慮可能是由于細胞漿內NF-κBp65表達量增多，結合IκBα增多，游離態IκBα減少，進而對肺癌細胞的增殖、遷移及粘附能力產生促進作用，其機制有待進一步研究驗證。
綜上所述，通過基因突變技術抑制NF-κBp65的NLS，雖然可以抑制NF-κBp65激活后向細胞核內轉位過程，但胞漿內過表達的NF-κBp65對A549細胞的增殖、遷移及粘附能力仍具有促進作用，可能與p52/RelB等二聚體入核增強以及游離態IκBα減少有關，其機制仍有待進一步研究明確。同時，NF-κB的核轉位過程仍是值得研究的干擾NF-κB信號通路的靶點之一，對完善NF-κB信號通路的結構及功能有非常重要的作用，為今后以NF-κB核轉位過程為靶點抑制肺癌的發生、發展以及對放、化療的抗性研究奠定了理論基礎。
肺癌目前占全球癌癥死亡原因的首位。據統計，2013年肺癌占所有女性癌癥死亡率的26%，占所有男性癌癥死亡率的28%[1]；過去30年間我國肺癌死亡率增加了464.84%，2008年肺癌占我國男性粗死亡率的0.48‰，占女性粗死亡率的0.22‰[2]。核因子κB(NF-κB)是一組重要的轉錄調節因子，可以通過調節多種細胞因子的表達參與腫瘤的發生、增殖、侵襲、遷移及化療耐藥等過程。近年來，大量研究證據表明NF-κB在肺癌組織和細胞內呈組成性激活，并且其激活水平與肺癌患者TNM分期和預后相關；NF-κB的激活可以促進肺癌細胞的發生、增殖、血管形成和遷移等過程；通過siRNA、IKK抑制劑或IκB超級抑制劑抑制NF-κB的表達，可以抑制肺癌細胞的增殖和遷移等生物學行為，亦可增強癌細胞對化療藥物的敏感性[3]。NF-κB蛋白家族有p65(RelA)、RelB、c-Rel、p50/p105(NF-κB1)和p52/p100(NF-κB2)5個亞基，p65/p50異源二聚體是NF-κB復合物中最常見的形式。在靜息狀態下，p65/p50二聚體與IκBα結合而滯留于細胞漿中；在細胞外信號刺激后，IKK激活，IκBα水解，使p65/p50的核定位信號(nuclear localization signals，NLS)暴露介導進入細胞核，NF-κBp65與目的DNA結合，從而調控靶基因的表達[4-5]。NF-κBp65蛋白從細胞漿轉位進入細胞核的過程是由NLS介導的，NLS通常是由約3~20個富含賴氨酸和甘氨酸殘基序列組成。NF-κBp65的NLS位于Rel同源結構域內第301~304位氨基酸殘基即KRKR(賴氨酸-甘氨酸-賴氨酸-甘氨酸)序列組成[6]。本研究直接以NF-κBp65的NLS為靶點，利用基因突變技術構建NLS缺失突變質粒即pcDNA3.1(+)-NF-κBp65ΔNLS(簡稱NF-κBp65ΔNLS)轉染低表達NF-κBp65的A549細胞株即A549/NF-κBp65 shRNA細胞，檢測細胞內NLS缺失突變NF-κBp65的細胞定位和表達水平，并觀察對肺癌細胞的增殖、遷移和粘附能力的影響，研究NF-κB信號通路中關鍵蛋白NF-κBp65的NLS對其細胞核轉位功能以及對肺癌細胞生物學行為的影響，為今后研究以NF-κBp65為靶點進行肺癌的預防和治療提供理論依據。
材料與方法
一 材料
pcDNA3.1(+)質粒(由本實驗室保存)；A549/NF-κBp65 shRNA穩轉細胞株(本實驗室保存)；質粒大量抽提試劑盒、AMV反轉錄試劑盒(Promega公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、RPMI-1640培養基(Gibco公司)，0.25%胰酶、青鏈霉素混合液(Solarbio公司)，NheⅠ、XhoⅠ限制性內切酶(Promega公司)，Lipofectamine 2000TM試劑(Invitrogen公司)，細胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒(上海生工生物公司)；單克隆鼠NF-κBp65抗體、單克隆鼠GAPDH抗體(Cell Signal公司)，FITC-羊抗鼠抗體(中杉金橋公司)，Alexa Fluor?羊抗鼠IgG熒光抗體(Invitrogen公司)；24孔Transwell培養板(Corning Costar公司)。
二 方法
1．人NF-κBp65ΔNLS真核表達質粒的構建：從GenBank查找人NF-κBp65基因序列[
2．細胞培養及質粒轉染：將A549/NF-κBp65 shRNA細胞用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基于37℃、5%CO2培養箱內培養，3 d換1次液，當細胞80%~90%鋪滿時用0.25%Trypsin-EDTA消化傳代。將細胞分為對照組、轉染pcDNA3.1(+)組和轉染NF-κBp65ΔNLS組，其中每組各分為腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激組和無TNF-α刺激組。將A549/NF-κBp65 shRNA細胞按Lipofectamine 2000TM說明書接種于細胞培養孔板中，使其在24 h內細胞密度達到70%~80%，分別將pcDNA3.1(+)、NF-κBp65ΔNLS質粒用無血清OPTI-MEM稀釋，轉染試劑同樣用無血清OPTI-MEM稀釋，將兩種稀釋液混勻，室溫靜置20 min，均勻滴加到A549/NF-κBp65 shRNA細胞中，培養6 h后換為完全培養基繼續培養。
3．細胞間接免疫熒光：接種于24孔板爬片上的A549/NF-κBp65 shRNA細胞，在轉染48 h后更換為無血清培養基，3組細胞中TNF-α刺激組加入20 ng/mL TNF-α刺激30 min，棄培養基，預冷PBS輕洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS輕洗3次，0.5%Triton 100×通透20 min，PBS輕洗3次，5%BSA封閉60 min，單克隆鼠NF-κBp65抗體孵育，4℃過夜，PBS輕洗3次，FITC-羊抗鼠抗體避光孵育1 h，DAPI封片后經倒置熒光顯微鏡觀察拍照。
4．實時熒光定量-PCR(qRT-PCR)：將A549/NF-κBp65 shRNA細胞接種于6孔板上，在細胞轉染48 h后，提取各組細胞總RNA，反轉錄獲得cDNA。根據GenBank中人NF-κBp65基因的mRNA序列設計引物，以人GAPDH基因作為內參。NF-κBp65 cDNA引物序列：上游5′-CCCCACGAGCTTGTAGG AAAG-3′，下游5′-CCAGGTTCTGGAAACTGTGGAT-3′，擴增片段為128 bp；GAPDH cDNA引物序列：上游5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游5′-GCC CAATACGACCAAATCC-3′，擴增片段為66 bp。引物均由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。qRT-PCR反應體系為20μL體系，反應條件：95℃5 min，進入45次循環(95℃30 s，58℃45s采集熒光)，最后55℃5 min(繪制溶解曲線)。
5．Western blot：將A549/NF-κBp65 shRNA細胞接種于6孔板上，在細胞轉染48 h后，加0.25%胰蛋白酶200μL消化細胞，置于1.5 mL離心管中，離心棄上清后加入50μL RIPA組織裂解液置于冰上，反復震蕩、充分裂解，離心取上清，即為總蛋白；按細胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒說明書分離提取細胞漿蛋白和細胞核蛋白。BCA法測蛋白濃度，將各組織樣品濃度調至相同，保證每個電泳孔道加入50μg蛋白混合樣品，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后轉膜，5%脫脂奶粉封閉，室溫孵育60 min，單克隆鼠NF-κBp65抗體、單克隆鼠GAPDH抗體孵育，4℃過夜，1×TBST清洗3次，Alexa Fluor?羊抗鼠IgG熒光抗體，室溫孵育1 h，1×TBST清洗3次。使用LI-COR Odyssey Infrared Imaging System成像儀顯像拍照。以同一泳道中NF-κBp65和GAPDH條帶灰度比值反映NF-κBp65蛋白表達水平。
6．細胞增殖實驗-MTT法：將1×103個/孔的A549/NF-κBp65 shRNA細胞接種于96孔板，每組設置6個復孔，分別于轉染24、48和72 h后每孔加入20μL MTT溶液(終濃度5 mg/mL)，輕輕混勻，37℃、5%CO2培養箱繼續培養4 h，在酶聯免疫檢測儀490 nm處檢測各孔吸光值，計算各組細胞增殖率，細胞增殖率(%)=(實驗組吸光值/對照組吸光值－1)×100%。
7．細胞遷移實驗-Transwell法：細胞轉染24 h至對數生長期，饑餓培養過夜，0.25%胰酶消化細胞，調整細胞密度為2×105/mL，取200μL細胞懸液加至24孔Transwell小室的上室，下室預先加入600μL含有10% FBS的1640培養基，37℃、5%CO2培養箱培養24 h；取出小室，擦除小室內壁細胞，PBS輕洗2遍，遷移至小室外面的細胞經DAPI染核，在倒置熒光顯微鏡下觀察計數，計數各組遷移細胞數。
8.細胞粘附實驗：取10 mg/mL BSA和10 mg/L纖維粘連蛋白按50μL/孔加入96孔板中，4℃過夜，BSA為對照基底；次日吸出多余液體，每孔加入50μL含10 mg/mL牛血清白蛋白的無血清培養基，37℃靜置30 min；0.25%胰酶消化轉染后48 h的細胞，調整細胞數為1×103/孔接種于96孔板中，每組設置3個復孔，37℃、5%CO2培養箱培養4 h后棄上清，PBS清洗2~3次，4%多聚甲醛固定20 min，蘇木素染色10 min，倒置顯微鏡200倍下觀察并計數5個視野平均粘附細胞數。
三 統計學處理
采用SPSS 18.0統計軟件對實驗結果進行統計分析。數據采用
結果
一 人NF-κBp65ΔNLS真核表達質粒構建結果
將具有氨芐抗性的陽性穿刺菌株克隆提取質粒，用NheⅠ、XhoⅠ限制性內切酶進行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳可見分別為5 344 bp和1 644 bp的兩條條帶。結果見圖 1。將所提質粒命名為NF-κBp65ΔNLS質粒，挑取酶切鑒定正確的菌液測序，測序引物為T7：5′-TAATACGACTCACTATAGG G-3′；BGH：5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3′。由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成測序，其結果顯示：NF-κBp65ΔNLS質粒測序結果與設計序列一致，成功將NF-κBp65 cDNA質粒中編碼NF-κBp65NLS的12個堿基缺失突變，證實NF-κBp65ΔNLS真核表達質粒構建成功。結果見圖 2。
圖1
NF-κBp65ΔNLS質粒和NF-κBp65cDNA質粒經NheⅠ、XhoⅠ限制性內切酶雙酶切鑒定結果
圖2
人NF-κBp65ΔNLS質粒部分測序結果?a．NF-κBp65 cDNA質粒部分測序結果，黑色背景內為編碼NF-κBp65 NLS的12個堿基；b．NF-κBp65ΔNLS質粒部分測序結果，顯示編碼NF-κBp65 NLS的12個堿基缺失突變
二 NF-κBp65ΔNLS質粒對A549/NF-κBp65 shRNA細胞NF-κBp65表達的影響
1．qRT-PCR結果：對照組與pcDNA3.1(+)組A549/NF-κBp65 shRNA細胞比較，NF-κBp65 mRNA的表達水平差異無統計學意義(1.04±0.21比1.23±0.22，P=0.556 3)，NF-κBp65ΔNLS組A549/NF-κBp65 shRNA細胞的NF-κBp65 mRNA表達水平(10.63±0.84)明顯高于對照組和pcDNA3.1(+)組(P < 0.01)。結果見圖 3。
圖3
各組細胞NF-κBp65 mRNA表達水平的比較
NS：
2．細胞間接免疫熒光結果：NF-κBp65ΔNLS組與對照組、pcDNA3.1(+)組A549/NF-κBp65 shRNA細胞比較，NF-κBp65蛋白表達明顯增多，且主要位于細胞漿內；經TNF-α刺激后，NF-κBp65ΔNLS組細胞漿內NF-κBp65蛋白并未轉移至細胞核內。而pcDNA3.1(+)組與對照組NF-κBp65蛋白在細胞漿和細胞核內均有少量表達；經TNF-α刺激后，NF-κBp65可轉移至細胞核內。結果見圖 4。
圖4
TNF-α(－)：未經TNF-α刺激；TNF-α(+)：經TNF-α刺激
各組細胞NF-κBp65免疫熒光染色結果(×200)
3．Western blot結果：提取NF-κBp65總蛋白結果顯示，對照組與pcDNA3.1(+)組A549/NF-κBp65 shRNA細胞比較，NF-κBp65總蛋白表達水平(0.53±0.02比0.59±0.04，P=0.276 8)無明顯差異，NF-κBp65ΔNLS組A549/NF-κBp65 shRNA細胞的NF-κBp65總蛋白表達水平(1.07±0.06)明顯高于對照組和pcDNA3.1(+)組(P < 0.01)。細胞核蛋白/漿蛋白分離提取NF-κBp65蛋白結果顯示，未經TNF-α刺激時，對照組與pcDNA3.1(+)組比較，細胞漿NF-κBp65蛋白表達水平(0.74±0.10比0.84±0.08，P=0.503 8)、細胞核NF-κBp65蛋白表達水平(0.67±0.08比0.73±0.10，P=0.665 0)均無明顯差異，NF-κBp65ΔNLS組細胞漿NF-κBp65蛋白表達水平(1.18±0.05)明顯高于對照組及pcDNA3.1(+)組(P < 0.05)，而細胞核NF-κBp65蛋白表達水平(0.79±0.09)與對照組及pcDNA3.1(+)組無明顯差異(P值分別為0.359 5，0.665 4)。經TNF-α刺激(20 ng/μL，30 min)后，對照組、pcDNA3.1(+)組和NF-κBp65ΔNLS組A549/NF-κBp65 shRNA細胞與未刺激組比較，細胞漿內的NF-κBp65蛋白均未明顯進入細胞核內(P > 0.05)。結果見圖 5。
圖5
細胞NF-κBp65蛋白表達水平的比較?a．細胞內總NF-κBp65蛋白電泳結果；b．TNF-α刺激前后細胞漿及細胞核內NF-κBp65蛋白電泳結果；c．細胞內總NF-κBp65蛋白與GAPDH灰度比值結果；d．TNF-α刺激前后細胞漿內NF-κBp65蛋白與GAPDH灰度比值結果；e．TNF-α刺激前后細胞核內NF-κBp65蛋白與GAPDH灰度比值結果
NS：
三 NF-κBp65ΔNLS質粒對A549/NF-κBp65 shRNA細胞惡性表型的影響
1．細胞增殖能力鑒定結果：對照組與pcDNA3.1(+)組A549/NF-κBp65 shRNA細胞比較，細胞增殖率在轉染后第24、48和72 h均無顯著差異[(15.15±8.62)%比(16.48±5.99)%，P=0.910 6；(61.75±5.63)%比(52.98±4.05)%，P=0.333 6；(88.56±5.99)%比(79.02±0.66)%，P=0.254 2]；NF-κBp65ΔNLS組A549/NF-κBp65 shRNA細胞在轉染后第24 h的細胞增殖率(24.20±5.95)%與對照組和pcDNA3.1(+)組相比均無顯著差異(P=0.478 6，P=0.457 3)，在轉染后第48 h和72 h的細胞增殖率[(106.50±7.04)%，(176.60±12.88)%]明顯高于對照組和pcDNA3.1(+)組(P < 0.05)。結果見圖 6。
圖6
各組細胞增殖率的比較
*
2．細胞遷移能力鑒定結果：對照組與pcDNA3.1(+)組A549/NF-κBp65 shRNA細胞比較，細胞遷移數無明顯差異(92.3±5.8比90.3±8.5，P=0.855 6)，NF-κBp65ΔNLS組細胞的遷移數(137.7±13.9)明顯多于對照組與pcDNA3.1(+)組A549/NF-κBp65 shRNA細胞(P < 0.05)。結果見圖 7。
圖7
各組細胞遷移細胞計數的比較?a．遷移細胞DAPI染色鏡檢結果(×100)；b．遷移細胞計數比較結果
NS：
3．細胞粘附能力鑒定結果：對照組、pcDNA3.1(+)組和NF-κBp65ΔNLS組A549/NF-κBp65 shRNA細胞粘附細胞數的均值分別為200.3、184.6、320.0個。對照組與pcDNA3.1(+)組粘附細胞數無明顯差異[(200.3±17.8)個比(184.6±10.4)個，P=0.488 3]；NF-κBp65ΔNLS組的粘附細胞數[(320.0±11.1)個]明顯高于對照組與pcDNA3.1(+)組(P < 0.05)。結果見圖 8。
圖8
各組細胞粘附細胞計數的比較?a．粘附細胞蘇木素染色鏡檢結果(×50)；b．粘附細胞計數比較結果
NS：
討論
NF-κB信號通路參與了肺癌的發生、發展、轉移等多個生物學過程，并與肺癌細胞對放療及化療的抵抗相關[8]。以NF-κB信號通路為靶點抑制NF-κB的活化可能為肺癌的治療提供一條新的途徑。目前研究的NF-κB信號通路抑制劑主要通過直接和間接途徑抑制NF-κB的活化。直接抑制劑以NF-κB信號通路的多個蛋白為靶點，如IKK激活抑制劑、IκBα降解抑制劑、NF-κB核轉位及DNA結合抑制劑等為靶點的抑制劑。間接抑制劑是以可間接激活NF-κB信號通路的蛋白為靶點的抑制劑。NF-κB激活后由細胞漿內轉位進入細胞核是其發揮調控目的基因表達的重要過程，抑制NF-κB的核轉位使其滯留于細胞漿中是抑制NF-κB信號通路的一種途徑。研究顯示脫氫環氧甲基醌霉素[9]、潘多汀A等[10]可以特異性抑制TNF-α刺激后肺腺癌A549細胞內NF-κBp65向核內轉位過程，進而抑制A549細胞的增殖，并誘導其凋亡過程，但其機制并不明確。
NF-κBp65蛋白從細胞漿轉位進入細胞核的過程是由NLS介導的，因此干擾NF-κBp65的核轉位過程可能成為抑制NF-κB信號通路的重要靶點之一。本研究將編碼NF-κBp65蛋白NLS序列的基因進行缺失突變，構建真核表達質粒并轉染A549/NF-κBp65 shRNA細胞，發現A549/NF-κBp65 shRNA細胞內NF-κBp65 mRNA及蛋白表達水平均明顯升高，說明將NF-κBp65的NLS缺失突變不影響NF-κBp65ΔNLS質粒在細胞內的轉錄及翻譯水平，仍可實現NF-κBp65的過表達。同時，過表達的NF-κBp65蛋白滯留于細胞漿內，經過TNF-α刺激后并未明顯向細胞核內轉運，說明可以通過干擾NF-κBp65 NLS序列表達這一方法阻止NF-κBp65對目的基因的調控作用。
本研究還發現，將NF-κBp65ΔNLS轉染A549/NF-κBp65 shRNA細胞后，A549/NF-κBp65 shRNA細胞的增殖、遷移和粘附能力不但沒有減弱反而均有不同程度增強，說明細胞漿內NF-κBp65蛋白表達量增多，雖然無法進入細胞核內發揮轉錄調節作用，但在細胞漿內仍對肺癌細胞的惡性生物學行為有一定的調控作用，但其機制并不明確。
在細胞質中NF-κB的組合形式有很多種，不同的二聚體有不同的轉錄激活特性[6]，其中以p50/p65組成的異源二聚體最普遍，主要通過經典激活途徑發揮生物學功能，而CD40、淋巴毒素-β等因子可以激活非經典途徑使p52/RelB二聚體活化并轉移至核內激活目標基因[11]。Dimitrakopoulos等[12]在對109例非小細胞肺癌組織樣本研究中發現p52、RelB的表達水平與肺癌分期相關；另有研究發現p52表達增多可減弱紫杉醇誘導下肺癌細胞的凋亡，抑制p52的表達可使細胞增殖減弱[13]；其他NF-κB二聚體如p50/RelB、p50/cRel等也具有調節轉錄功能。因此，我們猜想可能由于抑制了p65的核轉位功能，使其滯留于細胞漿內，NF-κB經典激活途徑作用減弱，p50與RelB、cRel形成二聚體增多，同時非經典激活途徑p52/RelB二聚體入核過程增強，通過調節目標基因，促進了A549/NF-κBp65 shRNA細胞的惡性生物學行為。
另有研究發現IκB基因啟動子的多態性與腫瘤的發生密切相關，IκB的表達與腫瘤的惡性程度及分化程度高度相關，并可作為判斷患者預后的一項重要指標[14-15]；神經膠質細胞瘤中，過表達IκB可以顯著抑制基質金屬蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達，進而抑制腫瘤的侵襲轉移能力[16]。IκB發揮生物學功能的可能分子機制可能主要集中在兩個方面：(1)由于IκB存在多種生長因子受體的結合位點(如PDGF-R、IGF-R、EGF-R等)，游離態的IκB可與這些生長因子受體相互作用，通過競爭性抑制作用阻斷外界生長因子對腫瘤的增殖信號；(2)IκB可以促進腫瘤細胞凋亡，如在肝癌細胞內，過表達IκB可以增強腫瘤細胞對TNF-α介導凋亡的敏感性，促進腫瘤細胞凋亡[17]。由于NF-κBp65/p50二聚體主要與IκBα形成三聚體形式存在于細胞漿內，我們考慮可能是由于細胞漿內NF-κBp65表達量增多，結合IκBα增多，游離態IκBα減少，進而對肺癌細胞的增殖、遷移及粘附能力產生促進作用，其機制有待進一步研究驗證。
綜上所述，通過基因突變技術抑制NF-κBp65的NLS，雖然可以抑制NF-κBp65激活后向細胞核內轉位過程，但胞漿內過表達的NF-κBp65對A549細胞的增殖、遷移及粘附能力仍具有促進作用，可能與p52/RelB等二聚體入核增強以及游離態IκBα減少有關，其機制仍有待進一步研究明確。同時，NF-κB的核轉位過程仍是值得研究的干擾NF-κB信號通路的靶點之一，對完善NF-κB信號通路的結構及功能有非常重要的作用，為今后以NF-κB核轉位過程為靶點抑制肺癌的發生、發展以及對放、化療的抗性研究奠定了理論基礎。
