引用本文： 毛山, 史瑩, 谷偉. 柚皮素對人支氣管上皮細胞趨化因子生成的影響及機制研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(1): 32-35. doi: 10.7507/1671-6205.2015009 復制
支氣管哮喘嚴重影響人類健康，目前臨床上最常用的治療哮喘的藥物是糖皮質激素，但是長期使用糖皮質激素將引起免疫力低下、骨質疏松、代謝紊亂等不可避免的不良反應[1]，因此研究天然、高效及不良反應輕微的哮喘藥物對哮喘的防治具有重要意義。柚皮素是柑橘類水果提取物，廣泛存在于自然界中，屬于二氫黃酮類化合物，具有抗炎、免疫調節等作用[2-5]。研究發現柚皮素能抑制哮喘小鼠的氣道炎癥及氣道高反應性[6]。但是在支氣管哮喘復雜的病理生理過程中，柚皮素的作用機制仍需深入的探討。趨化因子在過敏反應及自身免疫性疾病中起重要作用。在支氣管哮喘病理生理過程中，大量以嗜酸粒細胞為主的炎性細胞在多種趨化因子的作用下向肺部募集，引起上皮損傷、血管通透性增加、氣道反應性增高以及氣道重塑等效應，因此理想的治療哮喘藥物需具備有效抑制趨化因子的特點。目前發現趨化因子的生成依賴于核轉錄因子κB(NF-κB)通路[7]。本實驗以人支氣管上皮(HBE)細胞為研究對象，以RANTES及Eotaxin為代表，研究柚皮素對趨化因子的影響，并研究其可能的機制。
材料與方法
一 材料
胎牛血清(杭州四季青公司)，柚皮素(Sigma公司)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)干粉(PeproTech公司)，anti-rabbit IgG HRP-conjugated secondary Ab(Santa Cruz Biotechnology公司)，chemiluminescence reagents(Cell Signaling Technology公司)，IκBα抗體及抗β-actin抗體(Cell Signaling Technology公司)，RANTES及Eotaxin的ELISA試劑盒(BD公司)，CeilyticTM NuclearTM Extraction kit(Sigma公司)，EMSA試劑盒(PIERCE公司)，Heraeus CO2培養箱，BIO-RAD power pac300電泳儀，KH-UVI紫外透射分析儀，Nikon diaphot倒置顯微鏡，Eppendorf Centrifuge 5810R低溫高速離心機，UVP Epi Chemi II Darkroom凝膠成像系統。
二 方法
1.細胞培養、柚皮素及TNF-α的準備：HBE細胞由本院中心實驗室提供。HBE細胞初始接種密度為3×105/mL，培養液為1640+10%胎牛血清，每隔2 d換液1次，當細胞融合后，用PBS液洗滌2次，加入胰酶消化，顯微鏡下觀察，當細胞收縮成圓形后，棄去消化液，加入培養液，無菌吸管吹打至貼壁細胞浮起，接種于6孔培養板或培養皿中內繼續培養。柚皮素用DMSO溶解，終濃度0.1 mg/μL(400 mmol/L)，TNF-α干粉加1640培養液溶解，－20℃保存。
2.細胞因子刺激及藥物干預：當細胞進入對數生長期、細胞融合達80%時，將細胞分組為對照組、TNF-α組、柚皮素低劑量組、柚皮素中劑量組和柚皮素高劑量組。柚皮素干預組分別與2.5、5和10μmol/L的柚皮素共孵育2 h后，與TNF-α組一起加入TNF-α(終濃度50 ng/mL)進行刺激。
3.ELISA法檢測RANTES及Eotaxin：各組加TNF-α刺激24 h后，取上清液用于檢測RANTES及Eotaxin。ELISA檢測步驟按照試劑盒說明書進行。
4.Western blot檢測IκBα含量：貼壁的細胞用PBS液洗2次，加入蛋白裂解液。用細胞刮子刮下細胞，離心后取上清即為全蛋白提取物。用Bradford法檢測蛋白濃度。在玻璃板夾槽中依次加入分離膠(凝固后)和濃縮膠，待其凝固；根據濃度取適量待測蛋白加入上樣孔中；浸于1×電泳緩沖液，4℃冷房冰浴中恒流(10~20 mA)電泳1~3 h；準備PVDF膜和濾紙，制作三明治夾心，浸于1×轉膜緩沖液，4℃冷房冰浴中恒壓(100 V)轉膜1 h；PVDF膜浸入1×封閉液，加入一抗，4℃過夜；用1×洗膜液洗膜3次，加入二抗室溫孵育1 h；洗膜同前，加入ECL發光液，顯色10 min。
5.提取核蛋白及EMSA檢測：各組加TNF-α刺激30 min后提取核蛋白，并用EMSA方法檢測各組細胞核內NF-κB與DNA的結合活性。具體步驟如下：吸去6孔板中培養液后，貼壁的細胞用PBS液洗2次，細胞中加入1 lysis buffer混勻，刮下細胞，直到在顯微鏡下超過90%的細胞破裂僅見細胞核。然后4℃10 000 g離心20 min，下層的核蛋白再用extraction buffer重懸，輕輕地搖動30 min，20 000 g離心5 min，收集上清液即為核蛋白。EMSA檢測按照試劑盒說明書進行。Binding buffer、poly(dI.dC)、核提取物和包含的p65結合位點的生物素標記的DNA，在室溫下孵育20 min。制作聚丙烯酰胺凝膠，浸于0.5 TBE中，結合反應在聚丙烯酰胺凝膠電泳中進行，然后轉移到尼龍膜上。生物素標記的DNA用化學發光法檢測。
三 統計學處理
采用SPSS 11.5統計學軟件。同一刺激和干預時間的樣本重復3次，結果以
結果
一 柚皮素抑制TNF-α引起的HBE細胞產生Eotaxin及RANTES
用TNF-α刺激HBE細胞24 h后，TNF-α組細胞上清液中Eotaxin及RANTES的表達較對照組明顯升高(P < 0.05)。經TNF-α刺激后，柚皮素干預組Eotaxin及RANTES的含量表達較TNF-α組明顯降低(P < 0.05)，柚皮素劑量越大，降低越明顯。結果見圖 1。
圖1
柚皮素干預對HBE細胞經TNF-α刺激后產生趨化因子的影響
TNF-α組與對照組比較，*
二 柚皮素抑制TNF-α誘導的HBE細胞內IκBα降解
用TNF-α刺激HBE細胞24 h后，TNF-α組細胞內IκBα表達較對照組明顯降低(P<0.05)。經TNF-α刺激后，柚皮素干預組IκBα表達較TNF-α刺激組明顯降低(P<0.05)，柚皮素劑量越大，降低越明顯。結果見圖 2。
圖2
柚皮素干預對HBE細胞經TNF-α刺激后IκBα降解的影響
1:對照組；2: TNF-α組；3:柚皮素中劑量組
三 柚皮素抑制HBE細胞核內NF-κB的DNA結合活性
用TNF-α刺激HBE細胞30 min后，細胞核內NF-κB的DNA結合活性較對照組明顯增加(P<0.05)。經TNF-α刺激后，柚皮素干預組細胞核內NF-κB的DNA結合活性較TNF-α組明顯降低(P<0.05)。結果見圖 3。
圖3
柚皮素干預對HBE細胞經TNF-α刺激后細胞核內NF-κB DNA結合活性的影響
1:對照組；2: TNF-α組；3:柚皮素中劑量組
討論
趨化因子在哮喘發病過程中起重要的生物調節作用，在氣道炎癥早期，趨化因子引發炎性細胞粘附、滾動、趨化、游走、浸潤，以及釋放多種活性介質造成氣道損傷，同時引起氣道高反應性。另外，在疾病慢性過程中，趨化因子也參與了氣道重塑。RANTES和Eotaxin已被證實為NF-κB的靶基因，兩種趨化因子的啟動子區域均包含NF-κB的結合序列。NF-κB活化后可激活RANTES和Eotaxin的轉錄[8-9]。本實驗以TNF-α激活NF-κB，結果發現HBE細胞中RANTES和Eotaxin的表達上調。用柚皮素干預后，HBE細胞產生RANTES和Eotaxin的能力下降，提示柚皮素能抑制TNF-α引起的趨化因子生成。
那么柚皮素是通過何種途徑來影響TNF-α的生物活性呢？我們假設柚皮素能影響NF-κB通路，根據目前已知的NF-κB的生物功能進行設計和研究。NF-κB屬于轉錄激活物Rel家族，由1個p50和1個RelA(p65)亞單位組成。在未受刺激的細胞中，NF-κB存在于細胞質，與它的抑制物IκBα形成復合物；NF-κB激活后，IκBα磷酸化并降解，隨后NF-κB進入細胞核并與DNA結合激活基因轉錄[10-11]。因此，我們觀察了IκBα的降解以及p65與DNA的結合活性。值得注意的是，柚皮素干預后，IκBα的降解明顯受抑制，而p65與DNA的結合活性亦明顯受抑制。從而證實了柚皮素可通過抑制NF-κB信號通路而影響TNF-α的生物功能。
綜上所述，柚皮素作為新型的抗炎及免疫調節藥物，能通過抑制NF-κB信號通路減少趨化因子的生成。我們的研究為明確柚皮素的功能及作用機制提供了實驗依據，為其應用于臨床提供了理論依據。
支氣管哮喘嚴重影響人類健康，目前臨床上最常用的治療哮喘的藥物是糖皮質激素，但是長期使用糖皮質激素將引起免疫力低下、骨質疏松、代謝紊亂等不可避免的不良反應[1]，因此研究天然、高效及不良反應輕微的哮喘藥物對哮喘的防治具有重要意義。柚皮素是柑橘類水果提取物，廣泛存在于自然界中，屬于二氫黃酮類化合物，具有抗炎、免疫調節等作用[2-5]。研究發現柚皮素能抑制哮喘小鼠的氣道炎癥及氣道高反應性[6]。但是在支氣管哮喘復雜的病理生理過程中，柚皮素的作用機制仍需深入的探討。趨化因子在過敏反應及自身免疫性疾病中起重要作用。在支氣管哮喘病理生理過程中，大量以嗜酸粒細胞為主的炎性細胞在多種趨化因子的作用下向肺部募集，引起上皮損傷、血管通透性增加、氣道反應性增高以及氣道重塑等效應，因此理想的治療哮喘藥物需具備有效抑制趨化因子的特點。目前發現趨化因子的生成依賴于核轉錄因子κB(NF-κB)通路[7]。本實驗以人支氣管上皮(HBE)細胞為研究對象，以RANTES及Eotaxin為代表，研究柚皮素對趨化因子的影響，并研究其可能的機制。
材料與方法
一 材料
胎牛血清(杭州四季青公司)，柚皮素(Sigma公司)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)干粉(PeproTech公司)，anti-rabbit IgG HRP-conjugated secondary Ab(Santa Cruz Biotechnology公司)，chemiluminescence reagents(Cell Signaling Technology公司)，IκBα抗體及抗β-actin抗體(Cell Signaling Technology公司)，RANTES及Eotaxin的ELISA試劑盒(BD公司)，CeilyticTM NuclearTM Extraction kit(Sigma公司)，EMSA試劑盒(PIERCE公司)，Heraeus CO2培養箱，BIO-RAD power pac300電泳儀，KH-UVI紫外透射分析儀，Nikon diaphot倒置顯微鏡，Eppendorf Centrifuge 5810R低溫高速離心機，UVP Epi Chemi II Darkroom凝膠成像系統。
二 方法
1.細胞培養、柚皮素及TNF-α的準備：HBE細胞由本院中心實驗室提供。HBE細胞初始接種密度為3×105/mL，培養液為1640+10%胎牛血清，每隔2 d換液1次，當細胞融合后，用PBS液洗滌2次，加入胰酶消化，顯微鏡下觀察，當細胞收縮成圓形后，棄去消化液，加入培養液，無菌吸管吹打至貼壁細胞浮起，接種于6孔培養板或培養皿中內繼續培養。柚皮素用DMSO溶解，終濃度0.1 mg/μL(400 mmol/L)，TNF-α干粉加1640培養液溶解，－20℃保存。
2.細胞因子刺激及藥物干預：當細胞進入對數生長期、細胞融合達80%時，將細胞分組為對照組、TNF-α組、柚皮素低劑量組、柚皮素中劑量組和柚皮素高劑量組。柚皮素干預組分別與2.5、5和10μmol/L的柚皮素共孵育2 h后，與TNF-α組一起加入TNF-α(終濃度50 ng/mL)進行刺激。
3.ELISA法檢測RANTES及Eotaxin：各組加TNF-α刺激24 h后，取上清液用于檢測RANTES及Eotaxin。ELISA檢測步驟按照試劑盒說明書進行。
4.Western blot檢測IκBα含量：貼壁的細胞用PBS液洗2次，加入蛋白裂解液。用細胞刮子刮下細胞，離心后取上清即為全蛋白提取物。用Bradford法檢測蛋白濃度。在玻璃板夾槽中依次加入分離膠(凝固后)和濃縮膠，待其凝固；根據濃度取適量待測蛋白加入上樣孔中；浸于1×電泳緩沖液，4℃冷房冰浴中恒流(10~20 mA)電泳1~3 h；準備PVDF膜和濾紙，制作三明治夾心，浸于1×轉膜緩沖液，4℃冷房冰浴中恒壓(100 V)轉膜1 h；PVDF膜浸入1×封閉液，加入一抗，4℃過夜；用1×洗膜液洗膜3次，加入二抗室溫孵育1 h；洗膜同前，加入ECL發光液，顯色10 min。
5.提取核蛋白及EMSA檢測：各組加TNF-α刺激30 min后提取核蛋白，并用EMSA方法檢測各組細胞核內NF-κB與DNA的結合活性。具體步驟如下：吸去6孔板中培養液后，貼壁的細胞用PBS液洗2次，細胞中加入1 lysis buffer混勻，刮下細胞，直到在顯微鏡下超過90%的細胞破裂僅見細胞核。然后4℃10 000 g離心20 min，下層的核蛋白再用extraction buffer重懸，輕輕地搖動30 min，20 000 g離心5 min，收集上清液即為核蛋白。EMSA檢測按照試劑盒說明書進行。Binding buffer、poly(dI.dC)、核提取物和包含的p65結合位點的生物素標記的DNA，在室溫下孵育20 min。制作聚丙烯酰胺凝膠，浸于0.5 TBE中，結合反應在聚丙烯酰胺凝膠電泳中進行，然后轉移到尼龍膜上。生物素標記的DNA用化學發光法檢測。
三 統計學處理
采用SPSS 11.5統計學軟件。同一刺激和干預時間的樣本重復3次，結果以
結果
一 柚皮素抑制TNF-α引起的HBE細胞產生Eotaxin及RANTES
用TNF-α刺激HBE細胞24 h后，TNF-α組細胞上清液中Eotaxin及RANTES的表達較對照組明顯升高(P < 0.05)。經TNF-α刺激后，柚皮素干預組Eotaxin及RANTES的含量表達較TNF-α組明顯降低(P < 0.05)，柚皮素劑量越大，降低越明顯。結果見圖 1。
圖1
柚皮素干預對HBE細胞經TNF-α刺激后產生趨化因子的影響
TNF-α組與對照組比較，*
二 柚皮素抑制TNF-α誘導的HBE細胞內IκBα降解
用TNF-α刺激HBE細胞24 h后，TNF-α組細胞內IκBα表達較對照組明顯降低(P<0.05)。經TNF-α刺激后，柚皮素干預組IκBα表達較TNF-α刺激組明顯降低(P<0.05)，柚皮素劑量越大，降低越明顯。結果見圖 2。
圖2
柚皮素干預對HBE細胞經TNF-α刺激后IκBα降解的影響
1:對照組；2: TNF-α組；3:柚皮素中劑量組
三 柚皮素抑制HBE細胞核內NF-κB的DNA結合活性
用TNF-α刺激HBE細胞30 min后，細胞核內NF-κB的DNA結合活性較對照組明顯增加(P<0.05)。經TNF-α刺激后，柚皮素干預組細胞核內NF-κB的DNA結合活性較TNF-α組明顯降低(P<0.05)。結果見圖 3。
圖3
柚皮素干預對HBE細胞經TNF-α刺激后細胞核內NF-κB DNA結合活性的影響
1:對照組；2: TNF-α組；3:柚皮素中劑量組
討論
趨化因子在哮喘發病過程中起重要的生物調節作用，在氣道炎癥早期，趨化因子引發炎性細胞粘附、滾動、趨化、游走、浸潤，以及釋放多種活性介質造成氣道損傷，同時引起氣道高反應性。另外，在疾病慢性過程中，趨化因子也參與了氣道重塑。RANTES和Eotaxin已被證實為NF-κB的靶基因，兩種趨化因子的啟動子區域均包含NF-κB的結合序列。NF-κB活化后可激活RANTES和Eotaxin的轉錄[8-9]。本實驗以TNF-α激活NF-κB，結果發現HBE細胞中RANTES和Eotaxin的表達上調。用柚皮素干預后，HBE細胞產生RANTES和Eotaxin的能力下降，提示柚皮素能抑制TNF-α引起的趨化因子生成。
那么柚皮素是通過何種途徑來影響TNF-α的生物活性呢？我們假設柚皮素能影響NF-κB通路，根據目前已知的NF-κB的生物功能進行設計和研究。NF-κB屬于轉錄激活物Rel家族，由1個p50和1個RelA(p65)亞單位組成。在未受刺激的細胞中，NF-κB存在于細胞質，與它的抑制物IκBα形成復合物；NF-κB激活后，IκBα磷酸化并降解，隨后NF-κB進入細胞核并與DNA結合激活基因轉錄[10-11]。因此，我們觀察了IκBα的降解以及p65與DNA的結合活性。值得注意的是，柚皮素干預后，IκBα的降解明顯受抑制，而p65與DNA的結合活性亦明顯受抑制。從而證實了柚皮素可通過抑制NF-κB信號通路而影響TNF-α的生物功能。
綜上所述，柚皮素作為新型的抗炎及免疫調節藥物，能通過抑制NF-κB信號通路減少趨化因子的生成。我們的研究為明確柚皮素的功能及作用機制提供了實驗依據，為其應用于臨床提供了理論依據。
