引用本文： 郟琴, 皮衛峰, 王妍敏, 蔡蓉, 劉乾, 管文斌, 郭雪君. 肺泡灌洗液在診斷真菌性肺炎中的價值. 中國呼吸與危重監護雜志, 2014, 13(6): 569-573. doi: 10.7507/1671-6205.2014139 復制
肺部真菌感染在臨床上是引起死亡的重要原因之一，尤其是免疫功能低下和癌癥患者[1-2]。及時和準確的診斷非常重要，但由于臨床表現不典型造成診斷困難[3-4]。可通過肺組織活檢和培養作出正確的診斷[5]，但組織活檢的主要缺點是侵入性檢查，而培養往往需要較長時間且陽性率較低[6]，肺孢子菌感染不能通過培養獲得。在免疫抑制患者中真菌血清抗體效價過低造成假陰性結果；而真菌抗原檢測和分子生物學技術是新近出現的能快速診斷肺部真菌感染的方法，但只能用于少數真菌檢測，且前者的敏感性較低，后者的費用較高、有假陰性結果，故在臨床上使用受到限制[7-9]，可彎曲氣管鏡肺泡灌洗液(BALF)病原菌檢查成為診斷肺部真菌感染重要方法[10-11]。由于支氣管鏡下的BALF檢查并非無菌性操作，檢查的結果難以區別定植還是感染[12-13]。區分是肺部定植菌還是真正的真菌感染臨床上至關重要，幾乎所有肺部腫瘤患者氣道內均可同時伴有真菌定植[14-15]。本研究通過5年回顧分析肺泡灌洗液真菌種類，結合患者臨床表現、影像學改變和組織活檢結果，探討BALF細胞學檢查在診斷肺部真菌感染中價值。
對象與方法
一 對象
收集2009年1月1日至2013年12月31日我院呼吸科通過BALF找到真菌的60例住院患者的臨床資料，男46例，女14例；年齡38~78歲，平均(47.8±20.0)歲。最常見的臨床癥狀為咳嗽(32例)、 咳痰(26例)、咯血(10例)和氣促(7例)。16例患者有吸煙病史。其中6例患者有反復肺炎經抗生素治療效果欠佳且血氣分析有呼吸衰竭。2例患者因血清胞漿型抗中性粒細胞胞漿抗體(C-ANCA)陽性且兩肺多發空洞樣小結節診斷韋格納肉芽腫。3例患者曾有惡性腫瘤病史接受過放射治療或化學治療。18例患者入院后經實驗室檢查發現細胞免疫、體液免疫低下考慮存在免疫功能不全，使用免疫抑制劑；嚴重糖尿病伴有臟器功能損害；惡性腫瘤；人類免疫缺陷病毒(HIV)感染和呼吸系統及其他臟器嚴重疾病。結果見表 1。其中27例診斷為肺部真菌感染，33例為肺部定植菌，診斷標準參照肺部真菌感染和專家共識的標準。確診患者均經組織病理學確診，標本包括經皮肺穿刺、支氣管鏡下肺活檢和手術肺組織病理等。
表1
18例免疫功能不全的真菌肺炎患者的臨床特征[例(%)]
二 方法
BALF標本采集：所有需行支氣管鏡檢查的患者均在治療前(排除抗生素及抗真菌藥物等干擾因素)簽署知情同意書后行支氣管檢查，在活檢、刷檢前行支氣管肺泡灌洗，常規行左舌葉或右中葉灌洗，影像學有改變行病變肺段灌洗，每次灌洗20 mL，總灌洗量為60~100 mL，回收率達40%~60%，每一份灌洗液通過離心沉淀作PAS和吉姆薩染色確認真菌病原體，通過六胺銀染色進一步辨認真菌和肺孢子菌形態[16-24]。進行誘導痰細胞學檢查，同時記錄患者的臨床表現、免疫狀況、影像學表現和有關肺組織活檢病理結果。通過臨床、影像、氣管鏡檢查和組織病理結果分析判斷是定植菌還是真正的肺部真菌感染。
結果
一 BALF細胞學檢查
最常見的病原體為曲霉35例(58.33%)，念珠菌13例(21.67%)，隱球菌10例(16.67%)和肺孢子菌2例(3.33%)。曲霉顯示有分隔菌絲分支約成45°角，念珠菌為2~5 μm大小帶有假菌絲的酵母菌(圖 1)，隱球菌直徑為4~10 μm有莢膜的酵母菌(圖 2)，肺孢子菌在肺泡灌洗液中呈串或簇分布，大小4~7 μm，有較厚囊壁(圖 3)。
圖1
糖尿病患者肺泡灌洗液離心沉淀六胺銀染色(×200) a.念珠菌纖細、假菌絲；b.念珠菌孢子
圖2
肺泡灌洗液多核巨細胞內可見圓形含有折射體的隱球菌(×400) 圖 3 肺泡灌洗液離心沉淀后可見成簇的肺孢子菌(×400)
二 影像學和病理學結果
60例中有33例為定植菌(表 2和表 3)。BALF中找到曲霉(23例)和念珠菌(10例)的患者胸部CT影像檢查發現肺實質腫塊，或纖維支氣管鏡(簡稱纖支鏡)發現支氣管管腔內有新生物。曲霉中20例(86.96%)和念珠菌中9例(90.00%)最終通過肺組織活檢確診為非小細胞肺癌。1例患者診斷為支氣管平滑肌瘤同時伴有曲霉定植。33例患者中有3例同時在BALF中找到惡性腫瘤細胞。另有3例診斷為定植菌的患者，既未發現支氣管內有新生物，也未通過實變的肺組織活檢找到惡性腫瘤細胞(表 2)，所有診斷為定植菌的患者，反復痰找真菌陰性，免疫功能檢查正常，且GM及乳膠凝集試驗均為陰性，33例患者中30例(90.91%)纖支鏡檢查發現氣管內新生物，最終經病理確診非小細胞肺癌29例，平滑肌瘤1例。27例經病理確診為肺部真菌感染的患者(表 4)影像學有多發結節和實變表現(圖 4a，b)而纖支鏡檢查正常，4例隱球菌肺炎影像學表現為肺實質團塊樣改變(圖 4c)，3例患者通過經皮肺組織活檢確診為隱球菌肺炎，1例患者經氣管鏡下肺活檢確診為隱球菌肺炎。2例肺孢子菌感染影像學表現為多發磨玻璃樣滲出影，1例侵襲性曲霉菌肺炎纖支鏡檢查發現氣管內有新生物，18例免疫功能低下，12例診斷為曲霉菌肺炎和10例診斷為隱球菌肺炎患者血檢查(GM、乳膠凝集試驗)均提示陽性。通過BALF診斷肺部真菌感染和組織病理學吻合率為45%。
表2
BALF中找到真菌
表3
肺部真菌定植患者的纖支鏡、影像學和免疫狀況(例)
表4
27例肺部真菌感染患者的纖支鏡、影像學和免疫狀況(例)
圖4
肺部真菌感染影像學改變 a.肺窗示兩肺多發散在小結節；b.左上肺小結節及右下肺外后基底段實變影；c.右下肺團塊，邊緣有長毛刺
討論
由于臨床癥狀和影像表現不典型，同時存在其他感染和非感染(腫瘤)情況，真菌培養相對較困難且時間較長，肺部真菌感染的診斷及區分定植菌對臨床醫生是一個挑戰[6, 20]。侵襲性肺部真菌有時類似惡性腫瘤生長，也有報道肺部腫瘤被誤診為肺部真菌感染[6, 25]。組織活檢診斷特異性較高，但屬于侵入性檢查，不適于病情較重患者[6, 26]。BALF細胞學檢查有助于侵襲性肺部真菌早期診斷，區分是肺部惡性腫瘤的定植菌還是真正的肺部感染臨床上至關重要。影像學檢查發現肺部腫塊或纖支鏡檢查發現支氣管內有新生物時，診斷肺部真菌感染時需考慮定植菌。回顧5年我院呼吸科纖支鏡肺泡灌洗液找到真菌60例，其中30例患者通過組織活檢確診為肺部惡性腫瘤。當患者臨床癥狀不典型或在肺泡灌洗液中同時找到腫瘤細胞時，診斷定植菌相對較容易，如前文敘述，有3例患者同時在肺泡灌洗液中找到腫瘤[27]。
另一方面，有免疫功能低下的患者，侵襲性肺部真菌感染可能造成致命威脅，需要早期、準確作出診斷，盡早使用抗真菌藥。肺部真菌感染影像學可表現為肺部實變、肺內單發或多發結節，肺門和縱隔淋巴結腫大，有時可表現肺部磨玻璃樣滲出影[28-29]。27例肺部真菌感染患者中有6例臨床癥狀和影像上類似肺部惡性腫瘤，最后有4例確診為隱球菌肺炎、1例確診為侵襲性肺曲霉菌感染和1例為念珠菌肺炎。在通過肺泡灌洗液細胞學檢查診斷肺部真菌感染時，需同時全面評估患者免疫狀況(包括細胞免疫和體液免疫)，患者的免疫情況在診斷是肺部真菌感染而非定植菌時有參考價值，據報道，有較多的肺部真菌感染患者伴有免疫功能低下[30-31]。回顧27例肺部真菌感染患者，4例隱球菌肺炎和2例肺孢子菌患者有顯著的免疫功能缺陷，實驗顯示肺孢子菌可以在免疫低下的宿主肺泡中反復復制和引起持續感染[32]，在免疫低下患者中隱球菌肺炎可引起較高發病率和死亡率[33-34]。盡管有報道肺部惡性腫瘤患者同時伴有隱球菌為定植菌，我院卻未發現類似病例[35-36]。有別于組織活檢可發現局部肺組織缺血壞死、血管侵犯和栓塞很容易確認為肺部真菌感染，灌洗液中找到隱球菌無法從形態上區分是定植菌還是肺部真菌感染[37]。但兩者在臨床上有細微區別，肺部真菌感染往往有咯血和肺泡出血，同時在其他部位體液和組織活檢標本中找到病原菌[38]。有3例隱球菌肺炎和1例侵襲性肺曲霉菌感染通過組織活檢得到確認。在灌洗液中找到肺孢子菌可以確認為致病菌。
臨床上區分是定植菌還是肺部真菌感染具有重要意義。通常在隆突以上有少數真菌定植，曲霉和念珠菌是最常見的定植菌。通過詳細詢問病史、特別是患者的免疫情況，相關的影像學和纖支鏡檢查，經綜合考慮可區分是定植菌還是肺部真菌感染，如果臨床高度疑似惡性腫瘤而灌洗液細胞學檢查陰性需考慮進一步組織活檢明確診斷。
綜上所述，肺部有惡性腫瘤的患者中曲霉和念珠菌是最常見定植菌，而侵襲性肺曲霉菌和念珠菌肺炎臨床和影像有時類似肺部惡性腫瘤。患者的免疫狀況在鑒別是定植菌還是肺部真菌感染有重要參考價值，在免疫低下的患者中肺部真菌感染發病率顯著高于免疫正常的患者。 在免疫正常的患者肺泡灌洗液中找到真菌首先考慮定植菌，且需警惕可能存在肺部惡性腫瘤。通過肺泡灌洗液診斷肺部真菌感染與組織病理學吻合率為45%。目前，BALF病原菌檢查已成為肺部真菌感染的重要輔助方法，隨著先進的分子和抗原技術在BALF中的應用，BALF在診斷肺部真菌感染中的價值將越來越重要。
肺部真菌感染在臨床上是引起死亡的重要原因之一，尤其是免疫功能低下和癌癥患者[1-2]。及時和準確的診斷非常重要，但由于臨床表現不典型造成診斷困難[3-4]。可通過肺組織活檢和培養作出正確的診斷[5]，但組織活檢的主要缺點是侵入性檢查，而培養往往需要較長時間且陽性率較低[6]，肺孢子菌感染不能通過培養獲得。在免疫抑制患者中真菌血清抗體效價過低造成假陰性結果；而真菌抗原檢測和分子生物學技術是新近出現的能快速診斷肺部真菌感染的方法，但只能用于少數真菌檢測，且前者的敏感性較低，后者的費用較高、有假陰性結果，故在臨床上使用受到限制[7-9]，可彎曲氣管鏡肺泡灌洗液(BALF)病原菌檢查成為診斷肺部真菌感染重要方法[10-11]。由于支氣管鏡下的BALF檢查并非無菌性操作，檢查的結果難以區別定植還是感染[12-13]。區分是肺部定植菌還是真正的真菌感染臨床上至關重要，幾乎所有肺部腫瘤患者氣道內均可同時伴有真菌定植[14-15]。本研究通過5年回顧分析肺泡灌洗液真菌種類，結合患者臨床表現、影像學改變和組織活檢結果，探討BALF細胞學檢查在診斷肺部真菌感染中價值。
對象與方法
一 對象
收集2009年1月1日至2013年12月31日我院呼吸科通過BALF找到真菌的60例住院患者的臨床資料，男46例，女14例；年齡38~78歲，平均(47.8±20.0)歲。最常見的臨床癥狀為咳嗽(32例)、 咳痰(26例)、咯血(10例)和氣促(7例)。16例患者有吸煙病史。其中6例患者有反復肺炎經抗生素治療效果欠佳且血氣分析有呼吸衰竭。2例患者因血清胞漿型抗中性粒細胞胞漿抗體(C-ANCA)陽性且兩肺多發空洞樣小結節診斷韋格納肉芽腫。3例患者曾有惡性腫瘤病史接受過放射治療或化學治療。18例患者入院后經實驗室檢查發現細胞免疫、體液免疫低下考慮存在免疫功能不全，使用免疫抑制劑；嚴重糖尿病伴有臟器功能損害；惡性腫瘤；人類免疫缺陷病毒(HIV)感染和呼吸系統及其他臟器嚴重疾病。結果見表 1。其中27例診斷為肺部真菌感染，33例為肺部定植菌，診斷標準參照肺部真菌感染和專家共識的標準。確診患者均經組織病理學確診，標本包括經皮肺穿刺、支氣管鏡下肺活檢和手術肺組織病理等。
表1
18例免疫功能不全的真菌肺炎患者的臨床特征[例(%)]
二 方法
BALF標本采集：所有需行支氣管鏡檢查的患者均在治療前(排除抗生素及抗真菌藥物等干擾因素)簽署知情同意書后行支氣管檢查，在活檢、刷檢前行支氣管肺泡灌洗，常規行左舌葉或右中葉灌洗，影像學有改變行病變肺段灌洗，每次灌洗20 mL，總灌洗量為60~100 mL，回收率達40%~60%，每一份灌洗液通過離心沉淀作PAS和吉姆薩染色確認真菌病原體，通過六胺銀染色進一步辨認真菌和肺孢子菌形態[16-24]。進行誘導痰細胞學檢查，同時記錄患者的臨床表現、免疫狀況、影像學表現和有關肺組織活檢病理結果。通過臨床、影像、氣管鏡檢查和組織病理結果分析判斷是定植菌還是真正的肺部真菌感染。
結果
一 BALF細胞學檢查
最常見的病原體為曲霉35例(58.33%)，念珠菌13例(21.67%)，隱球菌10例(16.67%)和肺孢子菌2例(3.33%)。曲霉顯示有分隔菌絲分支約成45°角，念珠菌為2~5 μm大小帶有假菌絲的酵母菌(圖 1)，隱球菌直徑為4~10 μm有莢膜的酵母菌(圖 2)，肺孢子菌在肺泡灌洗液中呈串或簇分布，大小4~7 μm，有較厚囊壁(圖 3)。
圖1
糖尿病患者肺泡灌洗液離心沉淀六胺銀染色(×200) a.念珠菌纖細、假菌絲；b.念珠菌孢子
圖2
肺泡灌洗液多核巨細胞內可見圓形含有折射體的隱球菌(×400) 圖 3 肺泡灌洗液離心沉淀后可見成簇的肺孢子菌(×400)
二 影像學和病理學結果
60例中有33例為定植菌(表 2和表 3)。BALF中找到曲霉(23例)和念珠菌(10例)的患者胸部CT影像檢查發現肺實質腫塊，或纖維支氣管鏡(簡稱纖支鏡)發現支氣管管腔內有新生物。曲霉中20例(86.96%)和念珠菌中9例(90.00%)最終通過肺組織活檢確診為非小細胞肺癌。1例患者診斷為支氣管平滑肌瘤同時伴有曲霉定植。33例患者中有3例同時在BALF中找到惡性腫瘤細胞。另有3例診斷為定植菌的患者，既未發現支氣管內有新生物，也未通過實變的肺組織活檢找到惡性腫瘤細胞(表 2)，所有診斷為定植菌的患者，反復痰找真菌陰性，免疫功能檢查正常，且GM及乳膠凝集試驗均為陰性，33例患者中30例(90.91%)纖支鏡檢查發現氣管內新生物，最終經病理確診非小細胞肺癌29例，平滑肌瘤1例。27例經病理確診為肺部真菌感染的患者(表 4)影像學有多發結節和實變表現(圖 4a，b)而纖支鏡檢查正常，4例隱球菌肺炎影像學表現為肺實質團塊樣改變(圖 4c)，3例患者通過經皮肺組織活檢確診為隱球菌肺炎，1例患者經氣管鏡下肺活檢確診為隱球菌肺炎。2例肺孢子菌感染影像學表現為多發磨玻璃樣滲出影，1例侵襲性曲霉菌肺炎纖支鏡檢查發現氣管內有新生物，18例免疫功能低下，12例診斷為曲霉菌肺炎和10例診斷為隱球菌肺炎患者血檢查(GM、乳膠凝集試驗)均提示陽性。通過BALF診斷肺部真菌感染和組織病理學吻合率為45%。
表2
BALF中找到真菌
表3
肺部真菌定植患者的纖支鏡、影像學和免疫狀況(例)
表4
27例肺部真菌感染患者的纖支鏡、影像學和免疫狀況(例)
圖4
肺部真菌感染影像學改變 a.肺窗示兩肺多發散在小結節；b.左上肺小結節及右下肺外后基底段實變影；c.右下肺團塊，邊緣有長毛刺
討論
由于臨床癥狀和影像表現不典型，同時存在其他感染和非感染(腫瘤)情況，真菌培養相對較困難且時間較長，肺部真菌感染的診斷及區分定植菌對臨床醫生是一個挑戰[6, 20]。侵襲性肺部真菌有時類似惡性腫瘤生長，也有報道肺部腫瘤被誤診為肺部真菌感染[6, 25]。組織活檢診斷特異性較高，但屬于侵入性檢查，不適于病情較重患者[6, 26]。BALF細胞學檢查有助于侵襲性肺部真菌早期診斷，區分是肺部惡性腫瘤的定植菌還是真正的肺部感染臨床上至關重要。影像學檢查發現肺部腫塊或纖支鏡檢查發現支氣管內有新生物時，診斷肺部真菌感染時需考慮定植菌。回顧5年我院呼吸科纖支鏡肺泡灌洗液找到真菌60例，其中30例患者通過組織活檢確診為肺部惡性腫瘤。當患者臨床癥狀不典型或在肺泡灌洗液中同時找到腫瘤細胞時，診斷定植菌相對較容易，如前文敘述，有3例患者同時在肺泡灌洗液中找到腫瘤[27]。
另一方面，有免疫功能低下的患者，侵襲性肺部真菌感染可能造成致命威脅，需要早期、準確作出診斷，盡早使用抗真菌藥。肺部真菌感染影像學可表現為肺部實變、肺內單發或多發結節，肺門和縱隔淋巴結腫大，有時可表現肺部磨玻璃樣滲出影[28-29]。27例肺部真菌感染患者中有6例臨床癥狀和影像上類似肺部惡性腫瘤，最后有4例確診為隱球菌肺炎、1例確診為侵襲性肺曲霉菌感染和1例為念珠菌肺炎。在通過肺泡灌洗液細胞學檢查診斷肺部真菌感染時，需同時全面評估患者免疫狀況(包括細胞免疫和體液免疫)，患者的免疫情況在診斷是肺部真菌感染而非定植菌時有參考價值，據報道，有較多的肺部真菌感染患者伴有免疫功能低下[30-31]。回顧27例肺部真菌感染患者，4例隱球菌肺炎和2例肺孢子菌患者有顯著的免疫功能缺陷，實驗顯示肺孢子菌可以在免疫低下的宿主肺泡中反復復制和引起持續感染[32]，在免疫低下患者中隱球菌肺炎可引起較高發病率和死亡率[33-34]。盡管有報道肺部惡性腫瘤患者同時伴有隱球菌為定植菌，我院卻未發現類似病例[35-36]。有別于組織活檢可發現局部肺組織缺血壞死、血管侵犯和栓塞很容易確認為肺部真菌感染，灌洗液中找到隱球菌無法從形態上區分是定植菌還是肺部真菌感染[37]。但兩者在臨床上有細微區別，肺部真菌感染往往有咯血和肺泡出血，同時在其他部位體液和組織活檢標本中找到病原菌[38]。有3例隱球菌肺炎和1例侵襲性肺曲霉菌感染通過組織活檢得到確認。在灌洗液中找到肺孢子菌可以確認為致病菌。
臨床上區分是定植菌還是肺部真菌感染具有重要意義。通常在隆突以上有少數真菌定植，曲霉和念珠菌是最常見的定植菌。通過詳細詢問病史、特別是患者的免疫情況，相關的影像學和纖支鏡檢查，經綜合考慮可區分是定植菌還是肺部真菌感染，如果臨床高度疑似惡性腫瘤而灌洗液細胞學檢查陰性需考慮進一步組織活檢明確診斷。
綜上所述，肺部有惡性腫瘤的患者中曲霉和念珠菌是最常見定植菌，而侵襲性肺曲霉菌和念珠菌肺炎臨床和影像有時類似肺部惡性腫瘤。患者的免疫狀況在鑒別是定植菌還是肺部真菌感染有重要參考價值，在免疫低下的患者中肺部真菌感染發病率顯著高于免疫正常的患者。 在免疫正常的患者肺泡灌洗液中找到真菌首先考慮定植菌，且需警惕可能存在肺部惡性腫瘤。通過肺泡灌洗液診斷肺部真菌感染與組織病理學吻合率為45%。目前，BALF病原菌檢查已成為肺部真菌感染的重要輔助方法，隨著先進的分子和抗原技術在BALF中的應用，BALF在診斷肺部真菌感染中的價值將越來越重要。
