引用本文： 李艷利, 韓鋒鋒, 李妍, 劉乾, 崔志磊, 羅勇, 徐衛國. PI3K/AKT/mTOR途徑在慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌萎縮中的作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2014, 13(5): 474-479. doi: 10.7507/1671-6205.2014116 復制
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一種全身性疾病，發病率和死亡率較高，能導致全身組織器官功能等多方面改變，患者出現惡病質和骨骼肌功能障礙[1]。營養不良和骨骼肌萎縮影響慢阻肺的進展和預后，以往的研究主要涉及慢阻肺骨骼肌萎縮機制中的蛋白降解途徑[2-4]，而蛋白合成途徑的研究很少，因此本研究針對慢阻肺骨骼肌萎縮機制中PI3K/AKT/mTOR蛋白合成途徑，進一步探索骨骼肌萎縮的機制。
材料與方法
一 動物模型建立
清潔級雄性SD大鼠，6周齡，共24只(購自上海實驗動物中心)，動物毛色均勻，反應良好，性情溫和，無脫毛、斷尾現象，采用隨機數字表方法分為兩組：對照組(12只)和慢阻肺組(12只)。每箱6只大鼠飼養，對照組吸入正常空氣，慢阻肺組采用熏香煙法：慢阻肺組大鼠每天被動吸煙2次，之間間隔至少2 h，每次三個循環，一個循環4支大前門香煙，燃盡后開始下個循環，每周5天，持續12周。所有大鼠均普通飲食飼養，自由進食、進水，定期測定體重。12周后應用小動物肺功能儀(BUXCO，美國)測定兩組大鼠肺功能情況。結束后用戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉, 麻醉成功后，心臟抽血盡量去除外周血。死亡15 min內，無創游離右側趾長伸肌，放入凍存管中，液氮凍存，用Western blot方法測定大鼠趾長伸肌內PI3K、總的及磷酸化的mTORC(t-mTOR，p-mTOR)、總的及磷酸化的GSK-3β(t-GSK-3β，p-GSK-3β)、總的及磷酸化的4E-BP1(t-4E-BP1，p-4E-BP1)、總的及磷酸化的p70S6K1(t-p70S6K1，p-p70S6K1)的蛋白表達。在右肺矢狀面最大周徑處取肺組織，浸入4%多聚甲醛中固定，6 h內包埋。
二 肺組織、趾長伸肌組織病理學檢查
石蠟組織塊切片；二甲苯脫蠟2次，每次10 min；無水乙醇洗去二甲苯2次，每次2 min；95%、80%、70%酒精浸泡各1 min，自來水沖洗1 min；蘇木素染色5 min，自來水沖洗1 min；1%鹽酸酒精分化20 s，自來水沖洗1 min；1%氨水返藍30 s，自來水沖洗1 min；伊紅染色5 min，自來水沖洗50 s；70%酒精脫水20 s，80%酒精脫水30 s；95%酒精脫水2次，每次1 min；無水乙醇脫水2次，每次2 min；二甲苯透明3次，每次2 min；中性樹膠封片。
三 Western blot測定趾長伸肌中相關蛋白表達
取相同質量50 mg的趾長伸肌提蛋白，放入勻漿器內，加入500μL裂解液[RIPA裂解液中要加入PMSF(100 :1)和羅氏磷酸酶抑制劑(100 :10)]，研磨成均一狀態，冰上裂解30 min，離心15 000 r/min，吸取相同體積300μL的上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，測完后用裂解液稀釋蛋白至相同濃度，然后加入1/4稀釋后蛋白樣品總體積的5×SDS，沸水浴變性10 min，放入-80℃備用。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，不同的蛋白分子量使用不同濃度的膠，先制備下層膠，異丙醇壓平，靜置40 min, 待下層凝固后棄去異丙醇，雙蒸水洗3遍，瀝干，加入上層膠，插入梳子，盡量不要產生氣泡，靜置40 min。進行電泳，加入相同體積10μL的蛋白樣品于膠孔中，80 V 30 min，換電壓，120 V 60 min。轉膜，切取所需位置的膠帶轉膜，PVDF膜甲醇活化后恒流濕轉，根據分子量大小設定轉膜時間。封閉，使用5%脫脂奶粉溶液封閉2h，TBST洗膜2次，每次2 min。一抗稀釋液稀釋一抗1 :1 000(CST，美國)，孵育PVDF膜4℃振蕩過夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min。5%脫脂奶粉溶液稀釋HRP標記的二抗1 :1 000(碧云天，中國), 室溫孵育PVDF膜1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min。然后使用化學發光劑(Millipore，美國)顯影，AB液1 :1混均后均勻覆蓋整張膜，選擇合適的曝光時間，掃描膠片，結果進行圖像分析(上海復日SmartView 2000生物電泳圖像分析軟件)，計算目的蛋白相對表達量(蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參GAPDH條帶灰度值)。
四 統計學處理
應用GraphPad Prism5統計軟件對數據進行統計學分析，數據以
結果
一 體重變化
煙熏0周和4周時慢阻肺組和對照組大鼠平均體重差異不具有統計學意義，煙熏8周時慢阻肺組大鼠體重明顯低于對照組，但尚未達到營養不良的標準。煙熏12周時慢阻肺組大鼠體重明顯低于對照組(P < 0.01)，且體重下降已超過預計值的10%，出現營養不良改變。結果見圖 1。
圖1
大鼠體重變化
與對照組比較，*
二 大鼠的肺功能變化
BUXCO系統測定以下數據：吸氣量(IC)，肺活量(VC)，用力肺活量(FVC), 功能殘氣量(FRC)，肺總量(TLC), 第1秒用力呼氣量(FEV1)，第2秒用力呼氣量(FEV2), 用力呼氣中段流量(FEF25, FEF50, FEF75)。兩組肺功能結果見表 1，各項指標慢阻肺組較對照組模型下降(P < 0.01)。
表1
兩組大鼠肺功能結果(三 肺組織形態學改變
肺組織石蠟切片HE染色，光學顯微鏡下可見：對照組大鼠氣道上皮結構完整，纖毛排列整齊，肺泡結構正常；慢阻肺組呈細支氣管慢性炎及肺氣腫的典型改變，肺泡破裂、融合形成肺大皰，炎癥細胞浸潤，支氣管上皮脫落、壞死等。結果見圖 2。
圖2
大鼠肺組織病理學檢查(HE×100)
a.對照組; b.慢阻肺組
四 大鼠趾長伸肌組織形態
對照組大鼠趾長伸肌組織大體觀察飽滿、有光澤、彈性佳，HE切片顯微鏡下觀察肌纖維排列緊密，細胞核排列整齊，間質內有少量纖維組織。慢阻肺組大鼠趾長伸肌組織大體觀察暗澀、綿軟，HE切片顯微鏡下觀察發現肌纖維橫截面積較正常對照組減小，血管組織增生及部分毛細血管擴張充血，間質內纖維組織增生。同時大鼠趾長伸肌組織經蘇木素-伊紅染色，計數每高倍鏡視野下肌纖維數目，間接反應骨骼肌纖維截面積，煙熏12周慢阻肺模型組及對照組各選擇6只大鼠，每只大鼠骨骼肌組織觀察4個高倍鏡視野進行計數和統計。結果顯示每高倍鏡下肌纖維數量慢阻肺組明顯高于對照組(P < 0.05)，間接反應出肌纖維萎縮。結果見圖 3。
圖3
與對照組比較，*P < 0.05
大鼠趾長伸肌組織學形態變化及每高倍鏡下肌纖維計數(HE×100)
五 PI3K、t-mTOR、p-mTOR、t-GSK-3β、p-GSK-3β、t-4E-BP1、p-4E-BP1、t-p70S6K1、p-p70S6K1蛋白表達變化
Western blot分析結果顯示，PI3K蛋白表達在兩組間差異不顯著(P > 0.05)；t-mTOR、p-mTOR、t-GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達慢阻肺組顯著高于對照組(P < 0.05，其中p-GSK-3β兩組對照P < 0.01)；t-4E-BP1、t-p70S6K1蛋白表達在兩組間差異不顯著(P > 0.05)；p-4E-BP1、p-p70S6K1蛋白表達慢阻肺組顯著高于對照組(P < 0.05)。結果見圖 4、5和6。
圖4
大鼠趾長伸肌內PI3K的蛋白表達
與對照組比較，
圖5
與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01
大鼠趾長伸肌內t-mTOR, p-mTOR, t-GSK-3β及p-GSK-3β的蛋白表達
圖6
與對照組比較，*P < 0.05
大鼠趾長伸肌內t-p70S6K1, p-p70S6K1, t-4E-BP1及p-4E-BP1的蛋白表達
討論
慢阻肺患者骨骼肌萎縮引起骨骼肌功能障礙，直接影響疾病的進展和預后[1]。慢阻肺患者發生骨骼肌萎縮是一種多因素、多種分子生物學機制共同參與的復雜過程，其最終歸結為骨骼肌蛋白合成和降解之間的不平衡，蛋白降解增加大于蛋白合成，導致骨骼肌萎縮[5]。國內外大部分研究[2-4, 21-25]集中在慢阻肺骨骼肌萎縮機制中的蛋白降解途徑，包括溶酶體途徑、泛素-蛋白酶體途徑和Ca2+依賴性途徑等，其中泛素-蛋白酶體途徑最為重要。但是關于慢阻肺骨骼肌萎縮機制中的蛋白合成途徑卻少有研究，因而本研究選取PI3K/AKT/mTOR蛋白合成途徑為研究對象，觀察該途徑在慢阻肺骨骼肌萎縮中的作用。
PI3K/AKT/mTOR是細胞內重要的信號轉導通路。PI3K主要由催化亞基P110和調節亞基P85組成，可被生長因子、細胞因子、激素等細胞外信號刺激激活，使膜磷酸肌醇磷酸化，生成PIP2及PIP3，它們作為第二信使與AKT的PH區結合來激活AKT[6]。腫瘤抑制基因PTEN表達產物可誘導磷酸肌醇去磷酸化失活，從而抑制PI3K途徑[7]。AKT是一種Ser/Thr蛋白激酶，在磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶(PDK)的協同作用下，PIP2和PIP3與胞漿內AKT結合，AKT轉位到質膜，并促進Ser473和Thr308位點磷酸化[8]。Ser473或/和Thr308位點的磷酸化是AKT激活的必要條件，而AKT激活是其發揮促細胞生存功能的重要前提。激活的AKT可促進mTOR、GSK-3β等下游底物磷酸化而發揮廣泛的生物學效應，包括抗凋亡、促細胞生存等功能。mTOR激活后，翻譯調節因子4E-BP1和p70S6k1磷酸化啟動翻譯過程[9]。4E-BP1磷酸化失活，脫離翻譯起始因子eIF-4E，啟動翻譯。p70S6k1磷酸化可通過促使40S核糖體蛋白S6磷酸化而啟動翻譯。另外，mTOR還受AMPK的調節，當AMP/ATP升高時，AMPK被激活，抑制mTOR，啟動負向調節。磷酸化的AKT作用于GSK-3β，使其磷酸化失活，釋放翻譯起始因子eIF2B，啟動翻譯[10]。
PI3K/AKT/mTOR傳導通路可維持細胞內環境平衡，傳導的異常可能導致疾病和腫瘤產生，干預PI3K/AKT/mTOR傳導通路可以重塑細胞內環境使其恢復平衡狀態[11]。例如飲食導致的母源性肥胖，其后代心臟肥大，這與后代肥胖無關，與AKT/mTOR的激活有關[12]。人乳頭瘤病毒-16(HPV-16)感染時，激活宿主細胞PI3K/AKT/mTOR通路，可抑制宿主細胞自噬，協助病毒感染[13]。在體外研究中，增生性玻璃體視網膜病變的初始事件為視網膜色素上皮細胞遷移，此過程需要腫瘤壞死因子-α(TNF-α)激活PI3K/AKT/mTOR傳導通路，為治療提供新的靶點[14]。人類長期暴露于重金屬可導致身體多部位腫瘤的發生，與PI3K/AKT/mTOR傳導通路異常有關，治療可以針對信號通路上的這些靶點[15]。肺腺癌細胞PI3K/AKT/mTOR傳導通路傳導增強，硫化舒磷酸酰胺可抑制PI3K/AKT/mTOR傳導通路并且誘導自噬，導致腫瘤細胞死亡，為肺癌的治療提供新方向[16]。此外，PI3K/AKT/mTOR傳導通路與溫度也有關，大鼠處于41℃時比目魚肌和趾肌的p-AKT和p-p70S6K蛋白表達增高，升高水平與溫度呈正相關，溫度可能是激活PI3K/AKT/mTOR通路的關鍵因子[17]。
PI3K/AKT/mTOR在骨骼肌萎縮和肥大的調節中發揮著主要的作用[18]。在去除神經支配導致小鼠脛前肌萎縮的模型中，Norrby等[19]發現p-AKT、t-AKT、p-4E-BP1、p-p70S6K1蛋白表達量顯著高于對照組，PI3K/AKT/mTOR信號通路傳導增強，說明骨骼肌萎縮的主要原因是骨骼肌蛋白降解增加而非蛋白合成減少。大鼠去除崗上神經導致肩甲肌萎縮的模型中，也發現PI3K/AKT/mTOR信號通路傳導增強，萎縮主要是通過上調萎縮相關基因MuRF-1和MAFbx的表達增加蛋白降解[20]。在一項研究中，慢阻肺患者股四頭肌p-AKT、p-GSK-3β及p-p70S6K蛋白表達量與對照組無明顯差別，說明慢阻肺骨骼肌萎縮時AKT信號肽表達沒有下調也沒有上調[21]。但是在其他研究中，慢阻肺患者的股四頭肌IGF-1的mRNA顯著高于對照組[22、23]，PI3K/AKT/mTOR信號通路激活，骨骼肌肥大的信號增強，可能是骨骼肌萎縮過程中的一個代償機制。
本研究的結果顯示，煙熏12周的慢阻肺組大鼠趾長伸肌t-mTOR、p-mTOR、t-GSK-3β、p-GSK-3β, p-4E-BP1、p-p70S6K1蛋白的相對表達量顯著高于對照組，說明PI3K/AKT/mTOR信號通路被激活，傳導增強，骨骼肌蛋白合成增多。慢阻肺大鼠骨骼肌蛋白合成雖然增加了，但是骨骼肌蛋白降解大于合成，無法逆轉骨骼肌萎縮。慢阻肺骨骼肌合成途徑的激活可能是機體自我保護對抗萎縮的一種代償機制，在慢阻肺骨骼肌萎縮中具有重要意義，為慢阻肺的治療提供新的思路，即激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，增加骨骼肌蛋白合成，可以抑制骨骼肌萎縮。但是如果給予IGF-1抑制骨骼肌萎縮，可能會增加機體患腫瘤的風險，因此，影響信號通路下游或者肌衛星細胞分化的因子作為信號靶點更為合適[24]。GSK-3β也可以作為一個治療的靶點，它既參與UPS介導的骨骼肌蛋白降解，也參與蛋白質合成，影響肌細胞增生和死亡，使用抑制劑抑制GSK-3β的活性，可抑制骨骼肌萎縮，對治療骨骼肌萎縮具有重大意義[25]。
總之，骨骼肌萎縮機制中的PI3K/AKT/mTOR蛋白合成途徑被激活，抑制骨骼肌萎縮，可能是機體的一個代償機制，為治療慢阻肺骨骼肌萎縮提供一個新思路，即干預PI3K/AKT/mTOR信號通路上的某些靶點使其進一步激活，增加骨骼肌蛋白質的合成抑制骨骼肌萎縮，這需要我們進一步的研究。
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一種全身性疾病，發病率和死亡率較高，能導致全身組織器官功能等多方面改變，患者出現惡病質和骨骼肌功能障礙[1]。營養不良和骨骼肌萎縮影響慢阻肺的進展和預后，以往的研究主要涉及慢阻肺骨骼肌萎縮機制中的蛋白降解途徑[2-4]，而蛋白合成途徑的研究很少，因此本研究針對慢阻肺骨骼肌萎縮機制中PI3K/AKT/mTOR蛋白合成途徑，進一步探索骨骼肌萎縮的機制。
材料與方法
一 動物模型建立
清潔級雄性SD大鼠，6周齡，共24只(購自上海實驗動物中心)，動物毛色均勻，反應良好，性情溫和，無脫毛、斷尾現象，采用隨機數字表方法分為兩組：對照組(12只)和慢阻肺組(12只)。每箱6只大鼠飼養，對照組吸入正常空氣，慢阻肺組采用熏香煙法：慢阻肺組大鼠每天被動吸煙2次，之間間隔至少2 h，每次三個循環，一個循環4支大前門香煙，燃盡后開始下個循環，每周5天，持續12周。所有大鼠均普通飲食飼養，自由進食、進水，定期測定體重。12周后應用小動物肺功能儀(BUXCO，美國)測定兩組大鼠肺功能情況。結束后用戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉, 麻醉成功后，心臟抽血盡量去除外周血。死亡15 min內，無創游離右側趾長伸肌，放入凍存管中，液氮凍存，用Western blot方法測定大鼠趾長伸肌內PI3K、總的及磷酸化的mTORC(t-mTOR，p-mTOR)、總的及磷酸化的GSK-3β(t-GSK-3β，p-GSK-3β)、總的及磷酸化的4E-BP1(t-4E-BP1，p-4E-BP1)、總的及磷酸化的p70S6K1(t-p70S6K1，p-p70S6K1)的蛋白表達。在右肺矢狀面最大周徑處取肺組織，浸入4%多聚甲醛中固定，6 h內包埋。
二 肺組織、趾長伸肌組織病理學檢查
石蠟組織塊切片；二甲苯脫蠟2次，每次10 min；無水乙醇洗去二甲苯2次，每次2 min；95%、80%、70%酒精浸泡各1 min，自來水沖洗1 min；蘇木素染色5 min，自來水沖洗1 min；1%鹽酸酒精分化20 s，自來水沖洗1 min；1%氨水返藍30 s，自來水沖洗1 min；伊紅染色5 min，自來水沖洗50 s；70%酒精脫水20 s，80%酒精脫水30 s；95%酒精脫水2次，每次1 min；無水乙醇脫水2次，每次2 min；二甲苯透明3次，每次2 min；中性樹膠封片。
三 Western blot測定趾長伸肌中相關蛋白表達
取相同質量50 mg的趾長伸肌提蛋白，放入勻漿器內，加入500μL裂解液[RIPA裂解液中要加入PMSF(100 :1)和羅氏磷酸酶抑制劑(100 :10)]，研磨成均一狀態，冰上裂解30 min，離心15 000 r/min，吸取相同體積300μL的上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，測完后用裂解液稀釋蛋白至相同濃度，然后加入1/4稀釋后蛋白樣品總體積的5×SDS，沸水浴變性10 min，放入-80℃備用。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，不同的蛋白分子量使用不同濃度的膠，先制備下層膠，異丙醇壓平，靜置40 min, 待下層凝固后棄去異丙醇，雙蒸水洗3遍，瀝干，加入上層膠，插入梳子，盡量不要產生氣泡，靜置40 min。進行電泳，加入相同體積10μL的蛋白樣品于膠孔中，80 V 30 min，換電壓，120 V 60 min。轉膜，切取所需位置的膠帶轉膜，PVDF膜甲醇活化后恒流濕轉，根據分子量大小設定轉膜時間。封閉，使用5%脫脂奶粉溶液封閉2h，TBST洗膜2次，每次2 min。一抗稀釋液稀釋一抗1 :1 000(CST，美國)，孵育PVDF膜4℃振蕩過夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min。5%脫脂奶粉溶液稀釋HRP標記的二抗1 :1 000(碧云天，中國), 室溫孵育PVDF膜1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min。然后使用化學發光劑(Millipore，美國)顯影，AB液1 :1混均后均勻覆蓋整張膜，選擇合適的曝光時間，掃描膠片，結果進行圖像分析(上海復日SmartView 2000生物電泳圖像分析軟件)，計算目的蛋白相對表達量(蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參GAPDH條帶灰度值)。
四 統計學處理
應用GraphPad Prism5統計軟件對數據進行統計學分析，數據以
結果
一 體重變化
煙熏0周和4周時慢阻肺組和對照組大鼠平均體重差異不具有統計學意義，煙熏8周時慢阻肺組大鼠體重明顯低于對照組，但尚未達到營養不良的標準。煙熏12周時慢阻肺組大鼠體重明顯低于對照組(P < 0.01)，且體重下降已超過預計值的10%，出現營養不良改變。結果見圖 1。
圖1
大鼠體重變化
與對照組比較，*
二 大鼠的肺功能變化
BUXCO系統測定以下數據：吸氣量(IC)，肺活量(VC)，用力肺活量(FVC), 功能殘氣量(FRC)，肺總量(TLC), 第1秒用力呼氣量(FEV1)，第2秒用力呼氣量(FEV2), 用力呼氣中段流量(FEF25, FEF50, FEF75)。兩組肺功能結果見表 1，各項指標慢阻肺組較對照組模型下降(P < 0.01)。
表1
兩組大鼠肺功能結果(三 肺組織形態學改變
肺組織石蠟切片HE染色，光學顯微鏡下可見：對照組大鼠氣道上皮結構完整，纖毛排列整齊，肺泡結構正常；慢阻肺組呈細支氣管慢性炎及肺氣腫的典型改變，肺泡破裂、融合形成肺大皰，炎癥細胞浸潤，支氣管上皮脫落、壞死等。結果見圖 2。
圖2
大鼠肺組織病理學檢查(HE×100)
a.對照組; b.慢阻肺組
四 大鼠趾長伸肌組織形態
對照組大鼠趾長伸肌組織大體觀察飽滿、有光澤、彈性佳，HE切片顯微鏡下觀察肌纖維排列緊密，細胞核排列整齊，間質內有少量纖維組織。慢阻肺組大鼠趾長伸肌組織大體觀察暗澀、綿軟，HE切片顯微鏡下觀察發現肌纖維橫截面積較正常對照組減小，血管組織增生及部分毛細血管擴張充血，間質內纖維組織增生。同時大鼠趾長伸肌組織經蘇木素-伊紅染色，計數每高倍鏡視野下肌纖維數目，間接反應骨骼肌纖維截面積，煙熏12周慢阻肺模型組及對照組各選擇6只大鼠，每只大鼠骨骼肌組織觀察4個高倍鏡視野進行計數和統計。結果顯示每高倍鏡下肌纖維數量慢阻肺組明顯高于對照組(P < 0.05)，間接反應出肌纖維萎縮。結果見圖 3。
圖3
與對照組比較，*P < 0.05
大鼠趾長伸肌組織學形態變化及每高倍鏡下肌纖維計數(HE×100)
五 PI3K、t-mTOR、p-mTOR、t-GSK-3β、p-GSK-3β、t-4E-BP1、p-4E-BP1、t-p70S6K1、p-p70S6K1蛋白表達變化
Western blot分析結果顯示，PI3K蛋白表達在兩組間差異不顯著(P > 0.05)；t-mTOR、p-mTOR、t-GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達慢阻肺組顯著高于對照組(P < 0.05，其中p-GSK-3β兩組對照P < 0.01)；t-4E-BP1、t-p70S6K1蛋白表達在兩組間差異不顯著(P > 0.05)；p-4E-BP1、p-p70S6K1蛋白表達慢阻肺組顯著高于對照組(P < 0.05)。結果見圖 4、5和6。
圖4
大鼠趾長伸肌內PI3K的蛋白表達
與對照組比較，
圖5
與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01
大鼠趾長伸肌內t-mTOR, p-mTOR, t-GSK-3β及p-GSK-3β的蛋白表達
圖6
與對照組比較，*P < 0.05
大鼠趾長伸肌內t-p70S6K1, p-p70S6K1, t-4E-BP1及p-4E-BP1的蛋白表達
討論
慢阻肺患者骨骼肌萎縮引起骨骼肌功能障礙，直接影響疾病的進展和預后[1]。慢阻肺患者發生骨骼肌萎縮是一種多因素、多種分子生物學機制共同參與的復雜過程，其最終歸結為骨骼肌蛋白合成和降解之間的不平衡，蛋白降解增加大于蛋白合成，導致骨骼肌萎縮[5]。國內外大部分研究[2-4, 21-25]集中在慢阻肺骨骼肌萎縮機制中的蛋白降解途徑，包括溶酶體途徑、泛素-蛋白酶體途徑和Ca2+依賴性途徑等，其中泛素-蛋白酶體途徑最為重要。但是關于慢阻肺骨骼肌萎縮機制中的蛋白合成途徑卻少有研究，因而本研究選取PI3K/AKT/mTOR蛋白合成途徑為研究對象，觀察該途徑在慢阻肺骨骼肌萎縮中的作用。
PI3K/AKT/mTOR是細胞內重要的信號轉導通路。PI3K主要由催化亞基P110和調節亞基P85組成，可被生長因子、細胞因子、激素等細胞外信號刺激激活，使膜磷酸肌醇磷酸化，生成PIP2及PIP3，它們作為第二信使與AKT的PH區結合來激活AKT[6]。腫瘤抑制基因PTEN表達產物可誘導磷酸肌醇去磷酸化失活，從而抑制PI3K途徑[7]。AKT是一種Ser/Thr蛋白激酶，在磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶(PDK)的協同作用下，PIP2和PIP3與胞漿內AKT結合，AKT轉位到質膜，并促進Ser473和Thr308位點磷酸化[8]。Ser473或/和Thr308位點的磷酸化是AKT激活的必要條件，而AKT激活是其發揮促細胞生存功能的重要前提。激活的AKT可促進mTOR、GSK-3β等下游底物磷酸化而發揮廣泛的生物學效應，包括抗凋亡、促細胞生存等功能。mTOR激活后，翻譯調節因子4E-BP1和p70S6k1磷酸化啟動翻譯過程[9]。4E-BP1磷酸化失活，脫離翻譯起始因子eIF-4E，啟動翻譯。p70S6k1磷酸化可通過促使40S核糖體蛋白S6磷酸化而啟動翻譯。另外，mTOR還受AMPK的調節，當AMP/ATP升高時，AMPK被激活，抑制mTOR，啟動負向調節。磷酸化的AKT作用于GSK-3β，使其磷酸化失活，釋放翻譯起始因子eIF2B，啟動翻譯[10]。
PI3K/AKT/mTOR傳導通路可維持細胞內環境平衡，傳導的異常可能導致疾病和腫瘤產生，干預PI3K/AKT/mTOR傳導通路可以重塑細胞內環境使其恢復平衡狀態[11]。例如飲食導致的母源性肥胖，其后代心臟肥大，這與后代肥胖無關，與AKT/mTOR的激活有關[12]。人乳頭瘤病毒-16(HPV-16)感染時，激活宿主細胞PI3K/AKT/mTOR通路，可抑制宿主細胞自噬，協助病毒感染[13]。在體外研究中，增生性玻璃體視網膜病變的初始事件為視網膜色素上皮細胞遷移，此過程需要腫瘤壞死因子-α(TNF-α)激活PI3K/AKT/mTOR傳導通路，為治療提供新的靶點[14]。人類長期暴露于重金屬可導致身體多部位腫瘤的發生，與PI3K/AKT/mTOR傳導通路異常有關，治療可以針對信號通路上的這些靶點[15]。肺腺癌細胞PI3K/AKT/mTOR傳導通路傳導增強，硫化舒磷酸酰胺可抑制PI3K/AKT/mTOR傳導通路并且誘導自噬，導致腫瘤細胞死亡，為肺癌的治療提供新方向[16]。此外，PI3K/AKT/mTOR傳導通路與溫度也有關，大鼠處于41℃時比目魚肌和趾肌的p-AKT和p-p70S6K蛋白表達增高，升高水平與溫度呈正相關，溫度可能是激活PI3K/AKT/mTOR通路的關鍵因子[17]。
PI3K/AKT/mTOR在骨骼肌萎縮和肥大的調節中發揮著主要的作用[18]。在去除神經支配導致小鼠脛前肌萎縮的模型中，Norrby等[19]發現p-AKT、t-AKT、p-4E-BP1、p-p70S6K1蛋白表達量顯著高于對照組，PI3K/AKT/mTOR信號通路傳導增強，說明骨骼肌萎縮的主要原因是骨骼肌蛋白降解增加而非蛋白合成減少。大鼠去除崗上神經導致肩甲肌萎縮的模型中，也發現PI3K/AKT/mTOR信號通路傳導增強，萎縮主要是通過上調萎縮相關基因MuRF-1和MAFbx的表達增加蛋白降解[20]。在一項研究中，慢阻肺患者股四頭肌p-AKT、p-GSK-3β及p-p70S6K蛋白表達量與對照組無明顯差別，說明慢阻肺骨骼肌萎縮時AKT信號肽表達沒有下調也沒有上調[21]。但是在其他研究中，慢阻肺患者的股四頭肌IGF-1的mRNA顯著高于對照組[22、23]，PI3K/AKT/mTOR信號通路激活，骨骼肌肥大的信號增強，可能是骨骼肌萎縮過程中的一個代償機制。
本研究的結果顯示，煙熏12周的慢阻肺組大鼠趾長伸肌t-mTOR、p-mTOR、t-GSK-3β、p-GSK-3β, p-4E-BP1、p-p70S6K1蛋白的相對表達量顯著高于對照組，說明PI3K/AKT/mTOR信號通路被激活，傳導增強，骨骼肌蛋白合成增多。慢阻肺大鼠骨骼肌蛋白合成雖然增加了，但是骨骼肌蛋白降解大于合成，無法逆轉骨骼肌萎縮。慢阻肺骨骼肌合成途徑的激活可能是機體自我保護對抗萎縮的一種代償機制，在慢阻肺骨骼肌萎縮中具有重要意義，為慢阻肺的治療提供新的思路，即激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，增加骨骼肌蛋白合成，可以抑制骨骼肌萎縮。但是如果給予IGF-1抑制骨骼肌萎縮，可能會增加機體患腫瘤的風險，因此，影響信號通路下游或者肌衛星細胞分化的因子作為信號靶點更為合適[24]。GSK-3β也可以作為一個治療的靶點，它既參與UPS介導的骨骼肌蛋白降解，也參與蛋白質合成，影響肌細胞增生和死亡，使用抑制劑抑制GSK-3β的活性，可抑制骨骼肌萎縮，對治療骨骼肌萎縮具有重大意義[25]。
總之，骨骼肌萎縮機制中的PI3K/AKT/mTOR蛋白合成途徑被激活，抑制骨骼肌萎縮，可能是機體的一個代償機制，為治療慢阻肺骨骼肌萎縮提供一個新思路，即干預PI3K/AKT/mTOR信號通路上的某些靶點使其進一步激活，增加骨骼肌蛋白質的合成抑制骨骼肌萎縮，這需要我們進一步的研究。
