引用本文： 程克斌, 高蓓蘭, 劉錦銘, 蘇奕亮, 徐金富. 肺癌患者血栓前狀態分子標志物的檢測及意義. 中國呼吸與危重監護雜志, 2014, 13(4): 381-384. doi: 10.7507/1671-6205.2014093 復制
血栓前狀態(prethrombotic state)是多因素引起的止血、凝血和抗凝系統失調的一種病理過程，具有易致血栓形成的多種血液學變化。腫瘤患者常伴有凝血、纖溶、血小板及血管異常所導致的出血和血栓形成，這些止血、凝血機制的異常在腫瘤轉移中起著重要作用[1]。肺癌是我國發病率及病死率最高的惡性腫瘤，它與血栓栓塞性疾病關系密切。肺癌可合并肺血栓栓塞癥(PTE)、下肢深靜脈血栓形成(DVT)、彌散性血管內凝血(DIC)等血栓性疾病[2-3]。當肺癌合并非大面積PTE時，其臨床表現不典型或與肺癌癥狀相似，易漏診、誤診；而合并大面積PTE時，患者病情兇險，如不及時診治可迅速死亡。因此，尋找敏感且特異性高的血液指標，及早檢測肺癌患者的血栓前狀態，防止致死性肺栓塞的發生，具有重要意義。
對象與方法
一 對象
選取90例門診健康體檢者為健康對照組，其中男54例，女36例；年齡26~78歲，平均(59.6±10.7)歲。肺癌組為上海市肺科醫院2010年6月至2012年6月住院確診的肺癌患者90例，其中男56例，女34例；年齡(59.3±11.1)歲。所有肺癌患者均符合肺癌診斷標準，經過一級診斷(病理組織學、細胞學)，二級診斷(纖維支氣管鏡、CT、MRI、骨ECT等)。肺癌分期采用2009年國際肺癌研究協會(IASLC)新分期，其中Ⅰa期1例、Ⅰb期5例、Ⅱa期9例、Ⅱb期9例、Ⅲa期13例、Ⅲb期20例、Ⅳ期33例。肺癌組患者均未進行放、化療及手術治療。所有受試者均排除嚴重心、肝、腎、血栓性疾病、糖尿病、風濕病、慢性阻塞性肺疾病、感染性疾病、貧血、長期服用激素及1個月內有手術外傷史。本研究經我院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署書面知情同意書。肺癌組與對照組在一般人口學特征方面匹配，且均為上海地區漢族人種，具有可比性。
二 方法
1．人血管性血友病因子(vWF)、人P-選擇素、人凝血酶抗凝血酶復合物(TAT)的檢測：采集研究對象的清晨空腹周圍靜脈血5 mL，置于枸櫞酸鈉抗凝管，3 000 r/min，離心15 min，離心后取上清液置于-20 ℃冰箱保存備測；vWF(批號：R-5637)、人P-選擇素 (批號：RV-391)、TAT(R-72981)試劑盒均由美國Rapidbio(RB)公司提供。3種指標的測定均采用酶聯免疫分析法(ELISA)，具體操作按試劑盒說明書進行。
2．凝血功能全套的檢測：凝血全套檢測指標包括活化部分凝血活酶時間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)、血漿凝血酶原時間(PT)、血漿D-二聚體以及抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)。取清晨空腹靜脈血2 mL，置于枸櫞酸鈉抗凝真空管，3 000 r/min，離心15 min，然后用ACLTOP全自動凝血分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)檢測。其中，PT、APTT、FIB的檢測采用凝固法，D-二聚體的檢測采用免疫比濁法，AT-Ⅲ檢測采用底物發光法。具體操作過程按說明書進行。
三 統計學處理
應用SPSS 18.0軟件進行分析。計量資料用
結果
一 肺癌組與對照組血栓前狀態各項指標的比較
肺癌組血漿vWF、P-選擇素、TAT均較對照組明顯增高(P＜0.05)。在凝血功能全套指標檢測中，肺癌組APTT較正常對照組顯著縮短(P＜0.05)，而PT與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。而肺癌組中反映血栓形成或溶解的指標FIB及D-二聚體則較正常對照組明顯升高(P＜0.05)。同時，肺癌組中AT-Ⅲ活性較正常對照組明顯降低(P＜0.05)。結果見表 1。
表1
肺癌組與對照組vWF、P-選擇素、TAT及凝血全套指標的比較(n=90，二 不同分期肺癌患者血栓前狀態各項指標的比較
由表 2可見，Ⅳ期肺癌患者的血漿vWF、P-選擇素、TAT、FIB、D-二聚體水平均顯著高于Ⅲ期及Ⅰ+Ⅱ期肺癌患者(P＜0.05)。Ⅳ期肺癌患者的血漿PT及APTT均較Ⅲ期及Ⅰ+Ⅱ期肺癌明顯縮短(P＜0.05)，且Ⅳ期肺癌患者的AT-Ⅲ活性也較后二者明顯降低(P＜0.05)。
表2
不同分期肺癌患者vWF、P-選擇素、TAT及凝血全套指標比較(討論
血栓前狀態是指凝血、血小板功能增強，纖溶、抗凝功能減弱，血液黏度增高，有血栓形成傾向但尚未形成血栓，或者形成少量血栓正處于溶解狀態。它的分子標志物有AT-Ⅲ、vWF、D-二聚體、FIB、TAT、P-選擇素、纖維蛋白降解產物(FDP)等。肺癌細胞呈浸潤性生長，可破壞血管壁引起血管內皮細胞損傷，釋放出一系列物質促進血栓形成。其中第Ⅷ因子關連抗原vWF就是外源凝血系統中促進血栓形成的重要因子。vWF有兩個重要的生理功能，一是可與血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅳa結合，使血小板粘附在血管內皮上；二是其本身是凝血因子Ⅷ的載體，可穩定和加強凝血因子Ⅷ的凝血功能[4]。研究表明vWF是腫瘤患者VTE的危險因子[5]。肺癌患者癌細胞浸潤血管壁使血管內皮分泌vWF增多，其升高水平與腫瘤分期呈正相關[6]。我們研究發現肺癌患者vWF較正常對照組增高，且隨著分期越晚，增高越顯著，與以上研究結果一致。
P-選擇素又稱CD62p或GMP140，存在于血小板的α顆粒內，是反映血小板活化與釋放最特異的標志物，在啟動和擴大血栓形成中具有重要意義[7]。活化血小板上的P-選擇素可以介導血小板與中性粒細胞、腫瘤細胞等細胞間的黏附，促進炎癥和血栓形成。研究表明，P-選擇素參與了血栓形成，其在腫瘤患者的表達明顯高于正常人群，反映腫瘤患者血小板活化程度較高，促進了腫瘤細胞和血小板之間的相互作用，參與了腫瘤細胞浸潤和轉移過程[8]。Ay等[9]研究發現高水平的血漿P-選擇素是預測腫瘤患者發生VTE的獨立危險因子。本研究結果發現90例肺癌患者的血小板表面P-選擇素的表達量明顯高于正常對照組，且其升高與肺癌分期呈正相關。這與國外報道一致，提示肺癌患者本身存在血小板活化，從而介導激活血小板聚集在癌細胞周圍，使其免受清除而發生轉移[10]。
AT-Ⅲ是由肝臟和內皮細胞合成的一種多功能的抗絲蛋白酶，其抗凝作用占體內總抗凝作用的50%~60%，對血小板聚集也有一定的抑制作用。AT-Ⅲ含量或活性降低有利于促進血栓形成。TAT是活化的凝血因子與抗凝因子形成的復合物，是凝血因子活化的分子標志物。血漿TAT升高是凝血激活的一個特征，也是凝血酶大量生成的直接證據。血漿TAT是凝血酶早期形成的敏感分子標志物，在凝血功能早期改變和血栓前狀態時血漿TAT值即可明顯升高，故血漿TAT可識別肺癌患者術后血栓的形成[11]。惡性腫瘤患者出現凝血功能亢進的同時存在抗凝活性減弱，突出表現在血漿AT-Ⅲ水平降低，這與凝血酶形成有關。本研究結果顯示肺癌組患者血漿AT-Ⅲ活性水平顯著低于對照組，同時反映體內凝血酶形成的分子標志物TAT也顯著增高，說明肺癌患者機體凝血系統處于激活狀態。PT、FIB、APTT是反映凝血功能狀況的指標。血漿中FIB含量增加，機體便存在血栓形成傾向，對血栓前狀態的診斷有幫助[12]。腫瘤細胞能通過組織因子或其他促凝血因子的作用直接激活導致血液高凝狀態，為癌細胞的聚集、附著、浸潤形成轉移瘤創造了有利條件[13]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，肺癌組FIB水平升高，APTT縮短，提示肺癌患者存在血凝高凝狀態，易導致血栓形成。Ay等[14]研究發現腫瘤患者血漿FIB水平升高2倍，VTE發生風險增加2.1倍。一般而言，當人體凝血系統被激活時，纖溶系統也被激活而形成纖溶酶，纖溶酶可降解已交聯的纖維蛋白產生D-二聚體，后者含量增高表明機體的凝血和纖溶系統雙重激活，是繼發性纖溶亢進的敏感指標。本研究顯示肺癌組D-二聚體顯著增高，提示有交聯纖維蛋白降解增多、凝血激活和繼發纖溶狀態。對于腫瘤患者，血漿D-二聚體水平升高2倍，則VTE發生風險增加1.3倍，且患者死亡風險增加1.5倍[15]。
近年來，多學科綜合治療使肺癌患者生存期延長，但其發生VTE常常提示預后不良，1年生存率僅12%，是肺癌患者僅次于原發病的第二大最常見死因[16-17]。在總結11項相關隨機臨床試驗結果的基礎上，國外一項關于未發生VTE的腫瘤患者抗凝藥物治療療效及安全性的薈萃分析得出結論：抗凝藥物可以改善腫瘤患者的總生存率，但同時出血風險也相應增加[18]。2007年ASCO指南指出：所有接受惡性腫瘤相關大手術的患者應考慮預防血栓形成；不推薦對非臥床的腫瘤患者進行常規的抗血栓預防；住院腫瘤患者，若無出血及其他抗凝禁忌證，可考慮預防性抗凝[19]。本組資料中，肺癌組血漿vWF、P-選擇素、TAT、FIB、D-二聚體水平高于正常對照組，血漿PT、APTT較后者降低，且這種變化與肺癌的分期呈正相關。這提示肺癌患者存在血栓前狀態，且晚期患者比早期患者血栓前狀態更加顯著，更易合并VTE的發生。Wun等[20]研究發現VTE的發生率與惡性腫瘤分期相關，轉移性腫瘤VTE發生率明顯高于局限期患者。因此，AT-Ⅲ、vWF、D-二聚體、FIB、TAT、P-選擇素以及APTT是比較可靠的血栓前狀態標志物。我們可以通過檢測這些分子標志物的改變，早期診斷血栓前狀態的存在，采取相關適當的抗凝措施，從而改善肺癌患者的預后。
血栓前狀態(prethrombotic state)是多因素引起的止血、凝血和抗凝系統失調的一種病理過程，具有易致血栓形成的多種血液學變化。腫瘤患者常伴有凝血、纖溶、血小板及血管異常所導致的出血和血栓形成，這些止血、凝血機制的異常在腫瘤轉移中起著重要作用[1]。肺癌是我國發病率及病死率最高的惡性腫瘤，它與血栓栓塞性疾病關系密切。肺癌可合并肺血栓栓塞癥(PTE)、下肢深靜脈血栓形成(DVT)、彌散性血管內凝血(DIC)等血栓性疾病[2-3]。當肺癌合并非大面積PTE時，其臨床表現不典型或與肺癌癥狀相似，易漏診、誤診；而合并大面積PTE時，患者病情兇險，如不及時診治可迅速死亡。因此，尋找敏感且特異性高的血液指標，及早檢測肺癌患者的血栓前狀態，防止致死性肺栓塞的發生，具有重要意義。
對象與方法
一 對象
選取90例門診健康體檢者為健康對照組，其中男54例，女36例；年齡26~78歲，平均(59.6±10.7)歲。肺癌組為上海市肺科醫院2010年6月至2012年6月住院確診的肺癌患者90例，其中男56例，女34例；年齡(59.3±11.1)歲。所有肺癌患者均符合肺癌診斷標準，經過一級診斷(病理組織學、細胞學)，二級診斷(纖維支氣管鏡、CT、MRI、骨ECT等)。肺癌分期采用2009年國際肺癌研究協會(IASLC)新分期，其中Ⅰa期1例、Ⅰb期5例、Ⅱa期9例、Ⅱb期9例、Ⅲa期13例、Ⅲb期20例、Ⅳ期33例。肺癌組患者均未進行放、化療及手術治療。所有受試者均排除嚴重心、肝、腎、血栓性疾病、糖尿病、風濕病、慢性阻塞性肺疾病、感染性疾病、貧血、長期服用激素及1個月內有手術外傷史。本研究經我院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署書面知情同意書。肺癌組與對照組在一般人口學特征方面匹配，且均為上海地區漢族人種，具有可比性。
二 方法
1．人血管性血友病因子(vWF)、人P-選擇素、人凝血酶抗凝血酶復合物(TAT)的檢測：采集研究對象的清晨空腹周圍靜脈血5 mL，置于枸櫞酸鈉抗凝管，3 000 r/min，離心15 min，離心后取上清液置于-20 ℃冰箱保存備測；vWF(批號：R-5637)、人P-選擇素 (批號：RV-391)、TAT(R-72981)試劑盒均由美國Rapidbio(RB)公司提供。3種指標的測定均采用酶聯免疫分析法(ELISA)，具體操作按試劑盒說明書進行。
2．凝血功能全套的檢測：凝血全套檢測指標包括活化部分凝血活酶時間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)、血漿凝血酶原時間(PT)、血漿D-二聚體以及抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)。取清晨空腹靜脈血2 mL，置于枸櫞酸鈉抗凝真空管，3 000 r/min，離心15 min，然后用ACLTOP全自動凝血分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)檢測。其中，PT、APTT、FIB的檢測采用凝固法，D-二聚體的檢測采用免疫比濁法，AT-Ⅲ檢測采用底物發光法。具體操作過程按說明書進行。
三 統計學處理
應用SPSS 18.0軟件進行分析。計量資料用
結果
一 肺癌組與對照組血栓前狀態各項指標的比較
肺癌組血漿vWF、P-選擇素、TAT均較對照組明顯增高(P＜0.05)。在凝血功能全套指標檢測中，肺癌組APTT較正常對照組顯著縮短(P＜0.05)，而PT與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。而肺癌組中反映血栓形成或溶解的指標FIB及D-二聚體則較正常對照組明顯升高(P＜0.05)。同時，肺癌組中AT-Ⅲ活性較正常對照組明顯降低(P＜0.05)。結果見表 1。
表1
肺癌組與對照組vWF、P-選擇素、TAT及凝血全套指標的比較(n=90，二 不同分期肺癌患者血栓前狀態各項指標的比較
由表 2可見，Ⅳ期肺癌患者的血漿vWF、P-選擇素、TAT、FIB、D-二聚體水平均顯著高于Ⅲ期及Ⅰ+Ⅱ期肺癌患者(P＜0.05)。Ⅳ期肺癌患者的血漿PT及APTT均較Ⅲ期及Ⅰ+Ⅱ期肺癌明顯縮短(P＜0.05)，且Ⅳ期肺癌患者的AT-Ⅲ活性也較后二者明顯降低(P＜0.05)。
表2
不同分期肺癌患者vWF、P-選擇素、TAT及凝血全套指標比較(討論
血栓前狀態是指凝血、血小板功能增強，纖溶、抗凝功能減弱，血液黏度增高，有血栓形成傾向但尚未形成血栓，或者形成少量血栓正處于溶解狀態。它的分子標志物有AT-Ⅲ、vWF、D-二聚體、FIB、TAT、P-選擇素、纖維蛋白降解產物(FDP)等。肺癌細胞呈浸潤性生長，可破壞血管壁引起血管內皮細胞損傷，釋放出一系列物質促進血栓形成。其中第Ⅷ因子關連抗原vWF就是外源凝血系統中促進血栓形成的重要因子。vWF有兩個重要的生理功能，一是可與血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅳa結合，使血小板粘附在血管內皮上；二是其本身是凝血因子Ⅷ的載體，可穩定和加強凝血因子Ⅷ的凝血功能[4]。研究表明vWF是腫瘤患者VTE的危險因子[5]。肺癌患者癌細胞浸潤血管壁使血管內皮分泌vWF增多，其升高水平與腫瘤分期呈正相關[6]。我們研究發現肺癌患者vWF較正常對照組增高，且隨著分期越晚，增高越顯著，與以上研究結果一致。
P-選擇素又稱CD62p或GMP140，存在于血小板的α顆粒內，是反映血小板活化與釋放最特異的標志物，在啟動和擴大血栓形成中具有重要意義[7]。活化血小板上的P-選擇素可以介導血小板與中性粒細胞、腫瘤細胞等細胞間的黏附，促進炎癥和血栓形成。研究表明，P-選擇素參與了血栓形成，其在腫瘤患者的表達明顯高于正常人群，反映腫瘤患者血小板活化程度較高，促進了腫瘤細胞和血小板之間的相互作用，參與了腫瘤細胞浸潤和轉移過程[8]。Ay等[9]研究發現高水平的血漿P-選擇素是預測腫瘤患者發生VTE的獨立危險因子。本研究結果發現90例肺癌患者的血小板表面P-選擇素的表達量明顯高于正常對照組，且其升高與肺癌分期呈正相關。這與國外報道一致，提示肺癌患者本身存在血小板活化，從而介導激活血小板聚集在癌細胞周圍，使其免受清除而發生轉移[10]。
AT-Ⅲ是由肝臟和內皮細胞合成的一種多功能的抗絲蛋白酶，其抗凝作用占體內總抗凝作用的50%~60%，對血小板聚集也有一定的抑制作用。AT-Ⅲ含量或活性降低有利于促進血栓形成。TAT是活化的凝血因子與抗凝因子形成的復合物，是凝血因子活化的分子標志物。血漿TAT升高是凝血激活的一個特征，也是凝血酶大量生成的直接證據。血漿TAT是凝血酶早期形成的敏感分子標志物，在凝血功能早期改變和血栓前狀態時血漿TAT值即可明顯升高，故血漿TAT可識別肺癌患者術后血栓的形成[11]。惡性腫瘤患者出現凝血功能亢進的同時存在抗凝活性減弱，突出表現在血漿AT-Ⅲ水平降低，這與凝血酶形成有關。本研究結果顯示肺癌組患者血漿AT-Ⅲ活性水平顯著低于對照組，同時反映體內凝血酶形成的分子標志物TAT也顯著增高，說明肺癌患者機體凝血系統處于激活狀態。PT、FIB、APTT是反映凝血功能狀況的指標。血漿中FIB含量增加，機體便存在血栓形成傾向，對血栓前狀態的診斷有幫助[12]。腫瘤細胞能通過組織因子或其他促凝血因子的作用直接激活導致血液高凝狀態，為癌細胞的聚集、附著、浸潤形成轉移瘤創造了有利條件[13]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，肺癌組FIB水平升高，APTT縮短，提示肺癌患者存在血凝高凝狀態，易導致血栓形成。Ay等[14]研究發現腫瘤患者血漿FIB水平升高2倍，VTE發生風險增加2.1倍。一般而言，當人體凝血系統被激活時，纖溶系統也被激活而形成纖溶酶，纖溶酶可降解已交聯的纖維蛋白產生D-二聚體，后者含量增高表明機體的凝血和纖溶系統雙重激活，是繼發性纖溶亢進的敏感指標。本研究顯示肺癌組D-二聚體顯著增高，提示有交聯纖維蛋白降解增多、凝血激活和繼發纖溶狀態。對于腫瘤患者，血漿D-二聚體水平升高2倍，則VTE發生風險增加1.3倍，且患者死亡風險增加1.5倍[15]。
近年來，多學科綜合治療使肺癌患者生存期延長，但其發生VTE常常提示預后不良，1年生存率僅12%，是肺癌患者僅次于原發病的第二大最常見死因[16-17]。在總結11項相關隨機臨床試驗結果的基礎上，國外一項關于未發生VTE的腫瘤患者抗凝藥物治療療效及安全性的薈萃分析得出結論：抗凝藥物可以改善腫瘤患者的總生存率，但同時出血風險也相應增加[18]。2007年ASCO指南指出：所有接受惡性腫瘤相關大手術的患者應考慮預防血栓形成；不推薦對非臥床的腫瘤患者進行常規的抗血栓預防；住院腫瘤患者，若無出血及其他抗凝禁忌證，可考慮預防性抗凝[19]。本組資料中，肺癌組血漿vWF、P-選擇素、TAT、FIB、D-二聚體水平高于正常對照組，血漿PT、APTT較后者降低，且這種變化與肺癌的分期呈正相關。這提示肺癌患者存在血栓前狀態，且晚期患者比早期患者血栓前狀態更加顯著，更易合并VTE的發生。Wun等[20]研究發現VTE的發生率與惡性腫瘤分期相關，轉移性腫瘤VTE發生率明顯高于局限期患者。因此，AT-Ⅲ、vWF、D-二聚體、FIB、TAT、P-選擇素以及APTT是比較可靠的血栓前狀態標志物。我們可以通過檢測這些分子標志物的改變，早期診斷血栓前狀態的存在，采取相關適當的抗凝措施，從而改善肺癌患者的預后。
