引用本文： 劉海霞, 金先橋, 鄭明睿, 喬建甌. 慢性煙曲霉暴露對哮喘大鼠氣道嗜酸粒細胞性炎癥及氣道高反應性的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2014, 13(1): 28-33. doi: 10.7507/1671-6205.2014008 復制
支氣管哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，大多數炎癥以嗜酸粒細胞浸潤為特征。研究發現，哮喘患者氣道嗜酸性細胞浸潤增加，并與疾病嚴重程度正相關[1]。嗜酸粒細胞趨化因子(Eotaxin)在多種細胞中都有表達，主要參與嗜酸粒細胞的粘附、募集和脫顆粒[2]。白細胞介素5(IL-5)在骨髓源嗜酸粒細胞的成熟、釋放及進一步活化、分泌過程中發揮作用。兩者在嗜酸粒細胞發育及功能調控中的作用至關重要。煙曲霉(Aspergillus fumigatus)孢子是室內外環境中常見的吸入性過敏原。流行病學研究提示空氣中煙曲霉孢子濃度的升高與哮喘病情的加重密切相關[3]。我們前期的研究發現，煙曲霉上調粘蛋白MUC5AC的表達，并誘導時間依賴性IL-13、轉化生長因子β(TGF-β)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的表達，導致慢性哮喘大鼠的氣道上皮損傷及氣道重塑加重[4-6]。慢性煙曲霉暴露對哮喘大鼠氣道嗜酸粒細胞的募集活化及相關細胞因子Eotaxin、IL-5表達的影響及相關機制目前尚不明確。本研究用卵白蛋白(OVA)致敏和激發建立大鼠慢性哮喘模型，給予長期的煙曲霉孢子霧化吸入，觀察氣道反應性、氣道嗜酸粒細胞募集活化及相關炎癥因子的變化，旨在探討慢性煙曲霉暴露加重支氣管哮喘的機制。
對象與方法
一 材料
1．實驗動物：清潔級Wistar大鼠，雄性，體重150~200 g，6~7周齡，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2003-0003]提供。實驗前1周飼養于上海交通大學附屬第一人民醫院動物房[SYXK(滬)2002-0002]，清潔級恒溫(25 ℃)環境，標準飼料，自由取水，12 h晝夜。
2．主要試劑：OVA干粉(GradeV，美國Sigma公司)，氫氧化鋁(美國Sigma公司)，滅活百日咳桿菌疫苗(5×109個百日咳桿菌/mL，北京生物制品研究所)，沙氏瓊脂平板培養基(法國Biomerieux公司)，吐溫80(上海博光生物公司)，乙酰甲膽堿(美國Sigma公司)，大鼠ELISA試劑盒(上海鈺森生物技術有限公司)，大鼠Eotaxin ELISA測定試劑盒(上海鈺森生物技術有限公司)，HE染色套裝(南京建成生物制品研究所)。
3．主要儀器設備：超聲霧化器(PARI-BOY N037，德國Pari公司)，霧化箱(自制)，無束縛全身體積描記系統系統(美國Buxco公司)，iMark酶標儀(美國伯樂BioRad公司)，萬能細胞離心涂片機(美國StatSpin公司)。
二 方法
1．實驗分組及干預方案：32只雄性Wistar大鼠隨機分為4組(n=8)。生理鹽水對照組(A組)：應用生理鹽水致敏大鼠，生理鹽水激發，然后霧化吸入生理鹽水4周；生理鹽水+煙曲霉孢子吸入組(B組)：應用生理鹽水致敏大鼠，生理鹽水激發，然后霧化吸入煙曲霉孢子4周；慢性哮喘+生理鹽水吸入組(C組)：應用OVA系統致敏和反復激發的方法制備大鼠慢性哮喘模型，隨后經鼻霧化吸入生理鹽水4周；慢性哮喘+煙曲霉孢子吸入組(D組)：慢性哮喘大鼠經鼻霧化吸入煙曲霉孢子4周。
哮喘組(C組+D組)于第0 d和第7 d用新鮮配制的OVA 1 mg+氫氧化鋁100 mg+生理鹽水1 mL混懸液，在大鼠兩腹股溝、腹、前足跖，共4點作皮下注射，每點0.2 mL，腹腔注射0.2 mL，同時腹腔注射滅活百日咳桿菌菌苗1 mL。從第14 d至第37 d，將大鼠放于自制密閉有機玻璃箱(50 cm×27 cm×25 cm)內，連接霧化器，以2%OVA生理鹽水溶液進行霧化吸入，每周3次，每次30 min。A組和B組以0.9%生理鹽水代替OVA致敏、激發。自第42 d開始，B組和D組以1×105 cfu/mL煙曲霉孢子懸液進行霧化吸入，每周5次，每次30 min，煙曲霉孢子懸液的霧化吸入量為每組5 mL/次。A組和C組以等量0.9%生理鹽水代替孢子吸入。各組大鼠于末次霧化吸入后72 h進行氣道高反應性的測定。相關動物實驗方案已得到實驗動物倫理委員會的許可。動物模型制備流程見圖 1。
圖1
大鼠模型制備流程圖
2．氣道高反應性檢測：采用美國BUXCO公司WBP全身體積描記系統實施檢測，將清醒的大鼠置入體描器，采用乙酰甲膽堿(Mch)進行霧化攻擊，霧化給藥濃度依次為0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL，給藥量為每只200 μL/次。按照計算機提示，將大鼠編號及體重信息輸入，隨后逐步吸入Mch，按儀器操作規程，參數分別設定為：霧化時間2 min，反應時間3 min，恢復時間7 min。儀器通過傳感器、放大器及分析軟件等自動對反應過程的數據進行采集分析，可通過檢測由動物鼻部氣流和胸腹呼吸運動引起的氣流變化導致的“box flow”數據變化，參考溫度、濕度和壓力的數據計算得出各種指標參數。記錄Penh值，作為動物氣道縮窄的指數來反映氣道高反應的程度。
3．標本收集：氣道反應性測定完畢后，以1%異戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉大鼠，剪開頸部皮膚，暴露氣管，在氣管上作一切口，插入導管。剖開胸腔，心臟采血處死大鼠。結扎右肺，經氣管插管分3次注入PBS液10 mL行左肺支氣管肺泡灌洗，回收的支氣管肺泡灌洗液(BALF)經2 000 r/min離心10 min，上清液-80 ℃保存。取右肺上葉液氮中保存待用；右肺下葉置于10%甲醛中固定48 h，脫水、石蠟包埋，5 μm厚切片，行HE染色。
4．BALF上清IL-5及Eotaxin水平測定：按照試劑盒說明，以酶聯免疫吸附法分別測定BALF上清中IL-5及Eotaxin水平。
5．嗜酸粒細胞計數
(1)BALF中嗜酸粒細胞計數：將離心得到的細胞沉淀重懸于1 mL生理鹽水，其中200 μL采用血球計數板進行細胞總數的測定；另600 μL應用細胞離心甩片機在1 500 r/min條件下離心甩片10 min，待細胞涂片干燥后行瑞士姬姆薩復合染色，嗜酸粒細胞可被染成橘紅色，鏡檢得到嗜酸粒細胞相對值。
(2)肺組織切片嗜酸粒細胞浸潤程度測量分析：對肺組織切片行HE染色。結果判定：選取完整肺組織，于高倍鏡(×400)下計數5個視野后取平均數，評分標準為：未見或少見嗜酸粒細胞(0~2)個/HP，0分；嗜酸粒細胞數(3~10)個/HP，1分；嗜酸粒細胞(11~50)個/HP，2分；嗜酸粒細胞數＞50個/HP，3分。
三 統計學處理
數據處理采用SPSS 16.0統計軟件包。計量數據用
結果
一 氣道高反應性測定
各實驗組Penh值隨Mch濃度的升高呈上升趨勢。各實驗組之間，哮喘組(C組+D組)較生理鹽水對照組(A組)的氣道反應性升高，且Penh值在各濃度梯度上差異均有統計學意義(P＜0.05)；其中哮喘組大鼠中，慢性哮喘+煙曲霉孢子吸入組(D組)較慢性哮喘+生理鹽水吸入組(C組)氣道反應性更高。健康大鼠吸入煙曲霉(B組)后，氣道反應性較生理鹽水對照組(A組)無顯著差異。結果見圖 2。
圖2
各組大叔氣道高反應性測定
*
二 各組大鼠BALF中IL-5、Eotaxin水平比較
哮喘組大鼠(C組+D組)BALF上清中IL-5、Eotaxin水平均高于A組大鼠(P均＜0.01)；D組大鼠BALF上清中IL-5、Eotaxin均較C組增高(P＜0.05)；而B組大鼠BALF上清中IL-5、Eotaxin水平與A組比較均無明顯變化(P＞0.05)。結果見表 1。
表1
各組大鼠BALF中IL-5、Eotaxin水平(n=8，ng/L，三 各組大鼠嗜酸粒細胞計數
1．BALF中嗜酸粒細胞計數：由圖 3可見，哮喘組(C組+D組)BALF中嗜酸粒細胞百分比較生理鹽水對照組(A組)顯著升高(C組/A組：0.249±0.088比0.113±0.027，P＜0.05；D組/A組：0.312±0.038比0.113±0.027，P＜0.05)，慢性煙曲霉暴露可引起哮喘大鼠肺泡灌洗液中嗜酸粒細胞百分比顯著升高(C組/D組：0.249±0.088比0.312±0.038，P＜0.05)，但健康大鼠吸入煙曲霉孢子4周后BALF中嗜酸粒細胞百分比較生理鹽水對照組并無顯著改變(B組/A組：0.133±0.020比0.113±0.027，P＞0.05)。
圖3
BALF中嗜酸粒細胞計數 a．BALF細胞沉淀瑞士吉姆薩染色鏡檢結果；b．嗜酸粒細胞百分比統計結果
*
2．肺組織病理切片觀察：大鼠肺組織形態學觀察對照組(圖 4a和4b)肺泡結構清晰，支氣管黏膜無明顯破壞，支氣管壁無增厚。哮喘大鼠模型組(圖 4c和4d)支氣管黏膜存在不同程度的炎癥改變，支氣管壁黏膜下及管壁周圍有大量炎性細胞浸潤，較對照組氣道壁明顯增厚，氣道平滑肌增生，符合哮喘的病理表現。從觀察結果看，生理鹽水+煙曲霉孢子吸入組(B組)與生理鹽水對照組(A組)相比無顯著炎癥表現。哮喘組(C組+D組)部分黏膜上皮脫落，組織水腫，上皮細胞及基底層伴有大量的嗜酸粒細胞(圖 4c和4d)，嗜酸粒細胞數目與生理鹽水對照組(A組)相比均有顯著差異。與慢性哮喘組+生理鹽水吸入組(C組)相比，D組嗜酸粒細胞浸潤程度加重。肺組織切片嗜酸粒細胞浸潤程度測量分析結果見表 2。
圖4
各組大鼠肺組織病理切片(HE ×400) a．生理鹽水對照組(A組)；b．生理鹽水+煙曲霉孢子吸入組(B組)；c．慢性哮喘+生理鹽水吸入組(C組)；d．慢性哮喘+煙曲霉孢子吸入組(D組)
表2
各組大鼠肺組織嗜酸粒細胞計數評分結果(n=16，只)
四 各指標間的相關性分析
BALF中IL-5、Eotaxin表達水平與肺組織切片嗜酸粒細胞浸潤程度正相關(r=0.786，P＜0.01；r=0.614，P＜0.01)，表明IL-5、Eotaxin表達的增強均與肺組織嗜酸粒細胞浸潤增加有一定的相關性。
討論
煙曲霉是周圍環境中最常見的腐生寄生真菌，其孢子極易被吸入到下呼吸道。一般情況下，吸入煙曲霉孢子并不會對正常人構成危害，而哮喘患者氣道呈過敏性炎癥改變，可抑制宿主固有的抗感染免疫功能，有利于煙曲霉孢子的粘附定植[7]，因此哮喘患者感染煙曲霉菌后易誘發較為嚴重的病理改變。流行病學研究提示，持續的煙曲霉暴露是哮喘進展的驅動因素之一，對煙曲霉過敏是哮喘加重的危險因素[3]。與塵螨、花粉、蟑螂等過敏原不同，煙曲霉孢子既有蛋白酶活性和抗原性，又可在合適的條件下發芽生長，定植于呼吸道或引發侵襲性感染，其產生的毒素和酶可能在引發過敏中起輔助作用。因此，煙曲霉孢子可能較其他過敏原更能激發宿主的免疫反應，從而引發嚴重而持久的氣道炎癥及氣道結構和功能的改變。
臨床上對于部分持續性哮喘發作患者應用抗真菌藥取得了良好的療效，對于煙曲霉感染加重哮喘的效應已基本達成共識，對其機制的探究目前正處于起步階段。相關研究表明煙曲霉菌可誘發組胺及多種細胞因子釋放，降低IFN-γ水平，造成Th1/Th2失衡，導致過敏性免疫反應的增強[8-9]，相關炎性因子的來源及相關調控機制有待進一步研究。煙曲霉一方面可誘導劑量及時間依賴性的IL-6和IL-8表達，加重炎癥反應[10]；另一方面可致少量細胞因子甚至抑制細胞因子產生，不能使足夠的炎癥細胞向局部趨化，使其長期存活、芽生、釋放大量過敏原[11]。相關研究表明煙曲霉菌可上調粘蛋白MUC5AC表達，并誘導時間依賴性IL-13，TGF-β、粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)表達，導致慢性哮喘大鼠的氣道上皮損傷及氣道重塑加重，加重氣道炎癥[4-6]。我們前期就煙曲霉孢子對氣道炎癥及氣道高反應的影響進行了初步探究[12]，本研究在其基礎上，進一步探究煙曲霉菌對嗜酸粒細胞及相關細胞因子(IL-5、Eotaxin)的影響，有助于進一步闡明煙曲霉加重哮喘炎癥及氣道高反應性的具體機制。上述研究結果提示煙曲霉可通過調控嗜酸粒細胞及相關的細胞因子水平，影響氣道上皮及相應炎癥細胞的募集活化狀態，從而導致哮喘的加重，但對于煙曲霉所致的哮喘氣道復雜病理改變的確切調控機制有待進一步深入探究。
氣道嗜酸粒細胞浸潤是哮喘典型的病理特征。嗜酸粒細胞在氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應形成過程中發揮重要作用，在遷延病程、促進哮喘慢性化方面的作用也已受到重視。Eotaxin是哮喘發病中重要的誘導性趨化因子，可通過與C-C趨化因子受體3(CCR3)相互作用，選擇性促進嗜酸粒細胞自血液募集至炎癥部位。臨床資料表明，CCR3配體/CCR3與哮喘、過敏性鼻炎及變應性皮炎的發病密切相關，可通過阻斷該受體達到治療哮喘的目的[13]。IL-5在骨髓源嗜酸粒細胞的成熟、釋放以及進一步活化、分泌過程中的作用至關重要。鑒于IL-5在嗜酸粒細胞發育及功能調控中的重要作用，IL-5也可作為預防及緩解哮喘的潛在治療靶點之一[14]。動物實驗已證實，IL-5特異性單克隆抗體(mAbs)可抑制哮喘動物氣道嗜酸粒細胞性炎癥及氣道高反應性[15]。相關臨床試驗中，對中重度哮喘患者應用抗-IL-5 mAb美泊利單抗后，血液和痰液中嗜酸粒細胞數目顯著減少，但對過敏原誘導的氣道高反應并無明顯影響[16-17]。哮喘惡化是哮喘患者住院治療的最常見原因，而氣道嗜酸粒細胞性炎癥與哮喘加重風險密切相關，通過控制氣道嗜酸粒細胞性炎癥降低哮喘惡化風險，可以減少臨床發作次數，提高患者生活質量，降低醫療費用。嗜酸粒細胞在真菌相關性哮喘的發病過程中的作用也至關重要。相關研究表明，真菌細胞壁的重要組分β-D-葡聚糖可誘導嗜酸粒細胞脫顆粒[18]。作為重癥哮喘類型之一的變應性支氣管肺曲霉病早期病理改變主要表現為支氣管壁大量嗜酸粒細胞浸潤，進一步還可發展為嗜酸細胞性肺炎[19]。臨床研究中也發現大部分真菌感染的哮喘患者其嗜酸粒細胞水平顯著升高[20]，但其具體機制目前尚不明確。
本研究發現，長期煙曲霉暴露可促進趨化因子IL-5、Eotaxin的生成，促進哮喘大鼠氣道嗜酸粒細胞的募集活化，并可加重氣道高反應性。對于氣道嗜酸粒細胞炎癥與氣道高反應之間的關系目前尚無定論，多數學者認為氣道嗜酸粒細胞分泌的因子可進一步促進氣道高反應的形成，也有研究表明氣道嗜酸粒細胞增多與氣道高反應性形成之間相互獨立，因此對于兩者關聯及相應機制方面的研究有待進一步完善。本研究在一定程度上揭示了嗜酸粒細胞及相關趨化因子在真菌加重哮喘的機制中扮演著重要的角色，為真菌相關性哮喘的靶向治療提供了重要理論依據。
支氣管哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，大多數炎癥以嗜酸粒細胞浸潤為特征。研究發現，哮喘患者氣道嗜酸性細胞浸潤增加，并與疾病嚴重程度正相關[1]。嗜酸粒細胞趨化因子(Eotaxin)在多種細胞中都有表達，主要參與嗜酸粒細胞的粘附、募集和脫顆粒[2]。白細胞介素5(IL-5)在骨髓源嗜酸粒細胞的成熟、釋放及進一步活化、分泌過程中發揮作用。兩者在嗜酸粒細胞發育及功能調控中的作用至關重要。煙曲霉(Aspergillus fumigatus)孢子是室內外環境中常見的吸入性過敏原。流行病學研究提示空氣中煙曲霉孢子濃度的升高與哮喘病情的加重密切相關[3]。我們前期的研究發現，煙曲霉上調粘蛋白MUC5AC的表達，并誘導時間依賴性IL-13、轉化生長因子β(TGF-β)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的表達，導致慢性哮喘大鼠的氣道上皮損傷及氣道重塑加重[4-6]。慢性煙曲霉暴露對哮喘大鼠氣道嗜酸粒細胞的募集活化及相關細胞因子Eotaxin、IL-5表達的影響及相關機制目前尚不明確。本研究用卵白蛋白(OVA)致敏和激發建立大鼠慢性哮喘模型，給予長期的煙曲霉孢子霧化吸入，觀察氣道反應性、氣道嗜酸粒細胞募集活化及相關炎癥因子的變化，旨在探討慢性煙曲霉暴露加重支氣管哮喘的機制。
對象與方法
一 材料
1．實驗動物：清潔級Wistar大鼠，雄性，體重150~200 g，6~7周齡，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2003-0003]提供。實驗前1周飼養于上海交通大學附屬第一人民醫院動物房[SYXK(滬)2002-0002]，清潔級恒溫(25 ℃)環境，標準飼料，自由取水，12 h晝夜。
2．主要試劑：OVA干粉(GradeV，美國Sigma公司)，氫氧化鋁(美國Sigma公司)，滅活百日咳桿菌疫苗(5×109個百日咳桿菌/mL，北京生物制品研究所)，沙氏瓊脂平板培養基(法國Biomerieux公司)，吐溫80(上海博光生物公司)，乙酰甲膽堿(美國Sigma公司)，大鼠ELISA試劑盒(上海鈺森生物技術有限公司)，大鼠Eotaxin ELISA測定試劑盒(上海鈺森生物技術有限公司)，HE染色套裝(南京建成生物制品研究所)。
3．主要儀器設備：超聲霧化器(PARI-BOY N037，德國Pari公司)，霧化箱(自制)，無束縛全身體積描記系統系統(美國Buxco公司)，iMark酶標儀(美國伯樂BioRad公司)，萬能細胞離心涂片機(美國StatSpin公司)。
二 方法
1．實驗分組及干預方案：32只雄性Wistar大鼠隨機分為4組(n=8)。生理鹽水對照組(A組)：應用生理鹽水致敏大鼠，生理鹽水激發，然后霧化吸入生理鹽水4周；生理鹽水+煙曲霉孢子吸入組(B組)：應用生理鹽水致敏大鼠，生理鹽水激發，然后霧化吸入煙曲霉孢子4周；慢性哮喘+生理鹽水吸入組(C組)：應用OVA系統致敏和反復激發的方法制備大鼠慢性哮喘模型，隨后經鼻霧化吸入生理鹽水4周；慢性哮喘+煙曲霉孢子吸入組(D組)：慢性哮喘大鼠經鼻霧化吸入煙曲霉孢子4周。
哮喘組(C組+D組)于第0 d和第7 d用新鮮配制的OVA 1 mg+氫氧化鋁100 mg+生理鹽水1 mL混懸液，在大鼠兩腹股溝、腹、前足跖，共4點作皮下注射，每點0.2 mL，腹腔注射0.2 mL，同時腹腔注射滅活百日咳桿菌菌苗1 mL。從第14 d至第37 d，將大鼠放于自制密閉有機玻璃箱(50 cm×27 cm×25 cm)內，連接霧化器，以2%OVA生理鹽水溶液進行霧化吸入，每周3次，每次30 min。A組和B組以0.9%生理鹽水代替OVA致敏、激發。自第42 d開始，B組和D組以1×105 cfu/mL煙曲霉孢子懸液進行霧化吸入，每周5次，每次30 min，煙曲霉孢子懸液的霧化吸入量為每組5 mL/次。A組和C組以等量0.9%生理鹽水代替孢子吸入。各組大鼠于末次霧化吸入后72 h進行氣道高反應性的測定。相關動物實驗方案已得到實驗動物倫理委員會的許可。動物模型制備流程見圖 1。
圖1
大鼠模型制備流程圖
2．氣道高反應性檢測：采用美國BUXCO公司WBP全身體積描記系統實施檢測，將清醒的大鼠置入體描器，采用乙酰甲膽堿(Mch)進行霧化攻擊，霧化給藥濃度依次為0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL，給藥量為每只200 μL/次。按照計算機提示，將大鼠編號及體重信息輸入，隨后逐步吸入Mch，按儀器操作規程，參數分別設定為：霧化時間2 min，反應時間3 min，恢復時間7 min。儀器通過傳感器、放大器及分析軟件等自動對反應過程的數據進行采集分析，可通過檢測由動物鼻部氣流和胸腹呼吸運動引起的氣流變化導致的“box flow”數據變化，參考溫度、濕度和壓力的數據計算得出各種指標參數。記錄Penh值，作為動物氣道縮窄的指數來反映氣道高反應的程度。
3．標本收集：氣道反應性測定完畢后，以1%異戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉大鼠，剪開頸部皮膚，暴露氣管，在氣管上作一切口，插入導管。剖開胸腔，心臟采血處死大鼠。結扎右肺，經氣管插管分3次注入PBS液10 mL行左肺支氣管肺泡灌洗，回收的支氣管肺泡灌洗液(BALF)經2 000 r/min離心10 min，上清液-80 ℃保存。取右肺上葉液氮中保存待用；右肺下葉置于10%甲醛中固定48 h，脫水、石蠟包埋，5 μm厚切片，行HE染色。
4．BALF上清IL-5及Eotaxin水平測定：按照試劑盒說明，以酶聯免疫吸附法分別測定BALF上清中IL-5及Eotaxin水平。
5．嗜酸粒細胞計數
(1)BALF中嗜酸粒細胞計數：將離心得到的細胞沉淀重懸于1 mL生理鹽水，其中200 μL采用血球計數板進行細胞總數的測定；另600 μL應用細胞離心甩片機在1 500 r/min條件下離心甩片10 min，待細胞涂片干燥后行瑞士姬姆薩復合染色，嗜酸粒細胞可被染成橘紅色，鏡檢得到嗜酸粒細胞相對值。
(2)肺組織切片嗜酸粒細胞浸潤程度測量分析：對肺組織切片行HE染色。結果判定：選取完整肺組織，于高倍鏡(×400)下計數5個視野后取平均數，評分標準為：未見或少見嗜酸粒細胞(0~2)個/HP，0分；嗜酸粒細胞數(3~10)個/HP，1分；嗜酸粒細胞(11~50)個/HP，2分；嗜酸粒細胞數＞50個/HP，3分。
三 統計學處理
數據處理采用SPSS 16.0統計軟件包。計量數據用
結果
一 氣道高反應性測定
各實驗組Penh值隨Mch濃度的升高呈上升趨勢。各實驗組之間，哮喘組(C組+D組)較生理鹽水對照組(A組)的氣道反應性升高，且Penh值在各濃度梯度上差異均有統計學意義(P＜0.05)；其中哮喘組大鼠中，慢性哮喘+煙曲霉孢子吸入組(D組)較慢性哮喘+生理鹽水吸入組(C組)氣道反應性更高。健康大鼠吸入煙曲霉(B組)后，氣道反應性較生理鹽水對照組(A組)無顯著差異。結果見圖 2。
圖2
各組大叔氣道高反應性測定
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二 各組大鼠BALF中IL-5、Eotaxin水平比較
哮喘組大鼠(C組+D組)BALF上清中IL-5、Eotaxin水平均高于A組大鼠(P均＜0.01)；D組大鼠BALF上清中IL-5、Eotaxin均較C組增高(P＜0.05)；而B組大鼠BALF上清中IL-5、Eotaxin水平與A組比較均無明顯變化(P＞0.05)。結果見表 1。
表1
各組大鼠BALF中IL-5、Eotaxin水平(n=8，ng/L，三 各組大鼠嗜酸粒細胞計數
1．BALF中嗜酸粒細胞計數：由圖 3可見，哮喘組(C組+D組)BALF中嗜酸粒細胞百分比較生理鹽水對照組(A組)顯著升高(C組/A組：0.249±0.088比0.113±0.027，P＜0.05；D組/A組：0.312±0.038比0.113±0.027，P＜0.05)，慢性煙曲霉暴露可引起哮喘大鼠肺泡灌洗液中嗜酸粒細胞百分比顯著升高(C組/D組：0.249±0.088比0.312±0.038，P＜0.05)，但健康大鼠吸入煙曲霉孢子4周后BALF中嗜酸粒細胞百分比較生理鹽水對照組并無顯著改變(B組/A組：0.133±0.020比0.113±0.027，P＞0.05)。
圖3
BALF中嗜酸粒細胞計數 a．BALF細胞沉淀瑞士吉姆薩染色鏡檢結果；b．嗜酸粒細胞百分比統計結果
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2．肺組織病理切片觀察：大鼠肺組織形態學觀察對照組(圖 4a和4b)肺泡結構清晰，支氣管黏膜無明顯破壞，支氣管壁無增厚。哮喘大鼠模型組(圖 4c和4d)支氣管黏膜存在不同程度的炎癥改變，支氣管壁黏膜下及管壁周圍有大量炎性細胞浸潤，較對照組氣道壁明顯增厚，氣道平滑肌增生，符合哮喘的病理表現。從觀察結果看，生理鹽水+煙曲霉孢子吸入組(B組)與生理鹽水對照組(A組)相比無顯著炎癥表現。哮喘組(C組+D組)部分黏膜上皮脫落，組織水腫，上皮細胞及基底層伴有大量的嗜酸粒細胞(圖 4c和4d)，嗜酸粒細胞數目與生理鹽水對照組(A組)相比均有顯著差異。與慢性哮喘組+生理鹽水吸入組(C組)相比，D組嗜酸粒細胞浸潤程度加重。肺組織切片嗜酸粒細胞浸潤程度測量分析結果見表 2。
圖4
各組大鼠肺組織病理切片(HE ×400) a．生理鹽水對照組(A組)；b．生理鹽水+煙曲霉孢子吸入組(B組)；c．慢性哮喘+生理鹽水吸入組(C組)；d．慢性哮喘+煙曲霉孢子吸入組(D組)
表2
各組大鼠肺組織嗜酸粒細胞計數評分結果(n=16，只)
四 各指標間的相關性分析
BALF中IL-5、Eotaxin表達水平與肺組織切片嗜酸粒細胞浸潤程度正相關(r=0.786，P＜0.01；r=0.614，P＜0.01)，表明IL-5、Eotaxin表達的增強均與肺組織嗜酸粒細胞浸潤增加有一定的相關性。
討論
煙曲霉是周圍環境中最常見的腐生寄生真菌，其孢子極易被吸入到下呼吸道。一般情況下，吸入煙曲霉孢子并不會對正常人構成危害，而哮喘患者氣道呈過敏性炎癥改變，可抑制宿主固有的抗感染免疫功能，有利于煙曲霉孢子的粘附定植[7]，因此哮喘患者感染煙曲霉菌后易誘發較為嚴重的病理改變。流行病學研究提示，持續的煙曲霉暴露是哮喘進展的驅動因素之一，對煙曲霉過敏是哮喘加重的危險因素[3]。與塵螨、花粉、蟑螂等過敏原不同，煙曲霉孢子既有蛋白酶活性和抗原性，又可在合適的條件下發芽生長，定植于呼吸道或引發侵襲性感染，其產生的毒素和酶可能在引發過敏中起輔助作用。因此，煙曲霉孢子可能較其他過敏原更能激發宿主的免疫反應，從而引發嚴重而持久的氣道炎癥及氣道結構和功能的改變。
臨床上對于部分持續性哮喘發作患者應用抗真菌藥取得了良好的療效，對于煙曲霉感染加重哮喘的效應已基本達成共識，對其機制的探究目前正處于起步階段。相關研究表明煙曲霉菌可誘發組胺及多種細胞因子釋放，降低IFN-γ水平，造成Th1/Th2失衡，導致過敏性免疫反應的增強[8-9]，相關炎性因子的來源及相關調控機制有待進一步研究。煙曲霉一方面可誘導劑量及時間依賴性的IL-6和IL-8表達，加重炎癥反應[10]；另一方面可致少量細胞因子甚至抑制細胞因子產生，不能使足夠的炎癥細胞向局部趨化，使其長期存活、芽生、釋放大量過敏原[11]。相關研究表明煙曲霉菌可上調粘蛋白MUC5AC表達，并誘導時間依賴性IL-13，TGF-β、粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)表達，導致慢性哮喘大鼠的氣道上皮損傷及氣道重塑加重，加重氣道炎癥[4-6]。我們前期就煙曲霉孢子對氣道炎癥及氣道高反應的影響進行了初步探究[12]，本研究在其基礎上，進一步探究煙曲霉菌對嗜酸粒細胞及相關細胞因子(IL-5、Eotaxin)的影響，有助于進一步闡明煙曲霉加重哮喘炎癥及氣道高反應性的具體機制。上述研究結果提示煙曲霉可通過調控嗜酸粒細胞及相關的細胞因子水平，影響氣道上皮及相應炎癥細胞的募集活化狀態，從而導致哮喘的加重，但對于煙曲霉所致的哮喘氣道復雜病理改變的確切調控機制有待進一步深入探究。
氣道嗜酸粒細胞浸潤是哮喘典型的病理特征。嗜酸粒細胞在氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應形成過程中發揮重要作用，在遷延病程、促進哮喘慢性化方面的作用也已受到重視。Eotaxin是哮喘發病中重要的誘導性趨化因子，可通過與C-C趨化因子受體3(CCR3)相互作用，選擇性促進嗜酸粒細胞自血液募集至炎癥部位。臨床資料表明，CCR3配體/CCR3與哮喘、過敏性鼻炎及變應性皮炎的發病密切相關，可通過阻斷該受體達到治療哮喘的目的[13]。IL-5在骨髓源嗜酸粒細胞的成熟、釋放以及進一步活化、分泌過程中的作用至關重要。鑒于IL-5在嗜酸粒細胞發育及功能調控中的重要作用，IL-5也可作為預防及緩解哮喘的潛在治療靶點之一[14]。動物實驗已證實，IL-5特異性單克隆抗體(mAbs)可抑制哮喘動物氣道嗜酸粒細胞性炎癥及氣道高反應性[15]。相關臨床試驗中，對中重度哮喘患者應用抗-IL-5 mAb美泊利單抗后，血液和痰液中嗜酸粒細胞數目顯著減少，但對過敏原誘導的氣道高反應并無明顯影響[16-17]。哮喘惡化是哮喘患者住院治療的最常見原因，而氣道嗜酸粒細胞性炎癥與哮喘加重風險密切相關，通過控制氣道嗜酸粒細胞性炎癥降低哮喘惡化風險，可以減少臨床發作次數，提高患者生活質量，降低醫療費用。嗜酸粒細胞在真菌相關性哮喘的發病過程中的作用也至關重要。相關研究表明，真菌細胞壁的重要組分β-D-葡聚糖可誘導嗜酸粒細胞脫顆粒[18]。作為重癥哮喘類型之一的變應性支氣管肺曲霉病早期病理改變主要表現為支氣管壁大量嗜酸粒細胞浸潤，進一步還可發展為嗜酸細胞性肺炎[19]。臨床研究中也發現大部分真菌感染的哮喘患者其嗜酸粒細胞水平顯著升高[20]，但其具體機制目前尚不明確。
本研究發現，長期煙曲霉暴露可促進趨化因子IL-5、Eotaxin的生成，促進哮喘大鼠氣道嗜酸粒細胞的募集活化，并可加重氣道高反應性。對于氣道嗜酸粒細胞炎癥與氣道高反應之間的關系目前尚無定論，多數學者認為氣道嗜酸粒細胞分泌的因子可進一步促進氣道高反應的形成，也有研究表明氣道嗜酸粒細胞增多與氣道高反應性形成之間相互獨立，因此對于兩者關聯及相應機制方面的研究有待進一步完善。本研究在一定程度上揭示了嗜酸粒細胞及相關趨化因子在真菌加重哮喘的機制中扮演著重要的角色，為真菌相關性哮喘的靶向治療提供了重要理論依據。
