引用本文： 徐憲韜, 孫麗華, 史瑩. 柚皮素對人肺成纖維細胞表達血管內皮生長因子的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2014, 13(1): 18-20. doi: 10.7507/1671-6205.2014005 復制
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是我國乃至世界范圍內主要影響人類健康的疾病之一。目前認為慢阻肺是以氣道、肺實質和肺血管的慢性炎癥為特征的病變[1]。在疾病發展過程中，血管內皮生長因子(VEGF)通過誘導血管內皮細胞生長、遷移及增加血管滲透性等參與了慢性炎癥和血管生成 [2]。在我國，慢阻肺的發生與吸煙有密切關系。研究發現香煙提取物(CSE)能夠通過Smad3介導促使肺成纖維細胞產生VEGF，成為慢阻肺患者肺內VEGF的重要來源[3]。柚皮素是一種天然的、不良反應輕微的二氫黃酮類化合物，具有抗炎、免疫調節、抗氧化、抗增殖、抗腫瘤等作用[4-7]。研究表明在大鼠動脈損傷重建后，柚皮素具有抑制平滑肌細胞增殖和抑制血管內皮內細胞過渡增生的作用[8]。因此，柚皮素可能抑制慢阻肺的氣道重塑過程。我們之前的研究已發現，柚皮素能抑制Smad2磷酸化，但是柚皮素對Smad3及VEGF的作用如何，目前尚不清楚。本研究以肺成纖維細胞為研究對象，探討柚皮素能否影響CSE誘導的VEGF的生成，并對其機制做進一步探討。
對象與方法
一 材料
DEME培養基、0.25%Trypsin-EDTA、胎牛血清(GIBCO公司)；多克隆兔VEGFR-1抗體(SC-316)、辣根過氧化物酶標記羊抗體兔IgG、單克隆小鼠抗β-actin、柚皮素激動劑T0901317(Santa Cruz)、VEGF ELISA檢測試劑盒、人胚肺成纖維細胞(南京凱基生物公司)。
二 方法
1．細胞培養以及柚皮素和CSE的準備：將人胚肺成纖維細胞接種于50 mL培養瓶，培養基為RPMI 1640+10%胎牛血清。每隔3 d換液1次，當細胞80%~90%鋪滿，先用PBS洗滌2次，加入1.5 mL 0.25%Trypsin-EDTA，顯微鏡下觀察，當細胞收縮成圓形后，棄去消化液，加入培養液，無菌吸管吹打至貼壁細胞全部浮起，1∶3接種于培養瓶繼續培養，初始細胞接種密度為(2~5)×105個/mL。柚皮素用DMSO溶解，終濃度0.1 mg/ L。CSE制備參照Yunchao等[9]的方法，1只香煙用25 mL無血清的DMEM培養液制成懸液，密封瓶內，搖動使其充分溶解，調pH至7.3，過濾除菌，放置1 h。
2．細胞分組：當細胞進入對數生長期，細胞融合達80%~90%時，分為對照組、CES組(2.5%，5%，10%)和柚皮素干預組。對照組為不含血清的DEME培養液；CSE組為2.5%、5%、10%CSE的DEME培養液；柚皮素干預組再分為低劑量組、中劑量組和高劑量組，終濃度分別為5、10、20 μmol/L。
3．ELISA檢測：使用ELISA試劑盒測定細胞培養上清液中的VEGF，根據試劑盒說明制作標準曲線，取100 μL樣品加入已包被抗血管內皮生長因子抗體的酶標板上，充分混勻后置37 ℃溫度下反應90 min，洗板后加入生物素化的一抗1 h，再次洗板后加入酶標二抗30 min，然后加入酶底物15 min，測定吸光度，計算樣品中的VEGF的含量。
4．Western blot法測定Smad3水平和磷酸化后的Smad3(p-Smad3)水平：提取對照組、CSE(5%)組，以及柚皮素干預低劑量組、中劑量組、高劑量組的細胞總蛋白，電泳后轉膜，以脫脂奶粉封閉，標一抗4 ℃過夜，二抗為辣根過氧化物酶標記抗體，于室溫下震搖1 h，X光壓片曝光后分析。
三 統計學處理
采用SPSS 15.0統計軟件進行統計學分析。數據以
結果
一 CSE對人胚肺成纖維細胞VEGF表達的影響
用含CSE的DEME培養基培養的人胚肺成纖維細胞VEGF表達較對照組明顯升高，且隨著劑量與時間的增加，VEGF的增加越明顯。結果見圖 1。
圖1
CSE誘導人胚肺成纖維細胞生成VEGF
與對照組比較，*
二 柚皮素對CSE誘導的人胚肺成纖維細胞VEGF表達的影響
CSE可以刺激成纖維細胞釋放VEGF，加入2 mL含10、20和40 μmol/L柚皮素的DEME培養液(加入5%CSE)，與對照組和5%CSE組比較，柚皮素干預組VEGF釋放減少，且隨著柚皮素濃度的增加，抑制越明顯。結果見圖 2。
圖2
柚皮素對CSE誘導的VEGF表達的影響
與對照組比較，*
三 柚皮素干預對TGF-β1誘導的Smad3磷酸化的影響
對照組和CSE組Smad3表達總量無明顯差異(P＞0.05)，而CSE組p-Smad3明顯高于對照組。與柚皮素共同孵育，柚皮素干預組Smda3的表達總量與CSE組比較無明顯差異，而p-Smad3的含量較CSE組明顯降低(P＜0.05)，且柚皮素劑量越大，降低越明顯。結果見圖 3。
圖3
柚皮素(20 μmol/L)對Smad3及p-Smad3的影響 a：Smad3和p-Smad3電泳圖；b：Smad3與GAPDH灰度比值；c：p-Smad3與GAPDH灰度比值
與對照組比較，*
討論
在慢阻肺病程中，成纖維細胞不僅起著結構支撐作用，還能釋放生長因子以旁分泌和自分泌的形式調節和維持微環境穩態。其中成纖維細胞分泌的VEGF通過刺激有絲分裂調節內皮細胞的生存與分化，促進肺氣腫、肺動脈高壓的形成。煙霧作為慢阻肺主要的發病原因之一，其引起的氣道損傷及此后的肺動脈高壓與VEGF密切相關，因此研究VEGF的生成及影響因素具有重要意義。目前已發現成纖維細胞可以在TGF-β1刺激下誘導生成VEGF。Kobayashi等[10]通過siRNA對Smad2與Smad3的RNA干擾實驗，發現TGF-β1與TβR1結合后，通過Smad3而非Smad2產生VEGF。CSE可以不依賴TGF-β1活化TβR1，從而通過Smad3誘導VEGF生成。我們的研究亦發現，隨著CSE濃度的增加，成纖維細胞生成VEGF逐漸增加，與之前的研究一致。
柚皮素活化后能抑制部分炎性基因的表達，并且能降低大鼠動脈損傷重建后血管內皮的過度增生，提示其可能具有抑制血管增生及氣道重塑的作用。本研究發現柚皮素能抑制CSE引起的VEGF生成，并且隨柚皮素濃度的增加，抑制作用越明顯。
由于CSE是通過TβR1/Smad3途徑誘導VEGF生成，而柚皮素可以抑制此種效應，那么柚皮素可否抑制TβR1/Smad3通路呢？通過對Smad3及Smad3磷酸化程度的檢測，我們發現柚皮素能抑制加入CSE后60 min時人胚肺成纖維細胞內Smad3的總量，同時Smad3磷酸化程度降低，提示柚皮素可以通過抑制TβR1/Smad3通路抑制CSE誘導的VEGF產生。
綜上所述，本研究證實了柚皮素可以抑制成纖維細胞生成VEGF，原因可能是抑制了Smad3效應蛋白行使生物學功能，從而影響TβR1/Smad3通路，減少了其靶基因的表達。本研究結果為利用柚皮素治療呼吸系統疾病提供了理論依據，為治療慢阻肺提供了新的思路和方法
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是我國乃至世界范圍內主要影響人類健康的疾病之一。目前認為慢阻肺是以氣道、肺實質和肺血管的慢性炎癥為特征的病變[1]。在疾病發展過程中，血管內皮生長因子(VEGF)通過誘導血管內皮細胞生長、遷移及增加血管滲透性等參與了慢性炎癥和血管生成 [2]。在我國，慢阻肺的發生與吸煙有密切關系。研究發現香煙提取物(CSE)能夠通過Smad3介導促使肺成纖維細胞產生VEGF，成為慢阻肺患者肺內VEGF的重要來源[3]。柚皮素是一種天然的、不良反應輕微的二氫黃酮類化合物，具有抗炎、免疫調節、抗氧化、抗增殖、抗腫瘤等作用[4-7]。研究表明在大鼠動脈損傷重建后，柚皮素具有抑制平滑肌細胞增殖和抑制血管內皮內細胞過渡增生的作用[8]。因此，柚皮素可能抑制慢阻肺的氣道重塑過程。我們之前的研究已發現，柚皮素能抑制Smad2磷酸化，但是柚皮素對Smad3及VEGF的作用如何，目前尚不清楚。本研究以肺成纖維細胞為研究對象，探討柚皮素能否影響CSE誘導的VEGF的生成，并對其機制做進一步探討。
對象與方法
一 材料
DEME培養基、0.25%Trypsin-EDTA、胎牛血清(GIBCO公司)；多克隆兔VEGFR-1抗體(SC-316)、辣根過氧化物酶標記羊抗體兔IgG、單克隆小鼠抗β-actin、柚皮素激動劑T0901317(Santa Cruz)、VEGF ELISA檢測試劑盒、人胚肺成纖維細胞(南京凱基生物公司)。
二 方法
1．細胞培養以及柚皮素和CSE的準備：將人胚肺成纖維細胞接種于50 mL培養瓶，培養基為RPMI 1640+10%胎牛血清。每隔3 d換液1次，當細胞80%~90%鋪滿，先用PBS洗滌2次，加入1.5 mL 0.25%Trypsin-EDTA，顯微鏡下觀察，當細胞收縮成圓形后，棄去消化液，加入培養液，無菌吸管吹打至貼壁細胞全部浮起，1∶3接種于培養瓶繼續培養，初始細胞接種密度為(2~5)×105個/mL。柚皮素用DMSO溶解，終濃度0.1 mg/ L。CSE制備參照Yunchao等[9]的方法，1只香煙用25 mL無血清的DMEM培養液制成懸液，密封瓶內，搖動使其充分溶解，調pH至7.3，過濾除菌，放置1 h。
2．細胞分組：當細胞進入對數生長期，細胞融合達80%~90%時，分為對照組、CES組(2.5%，5%，10%)和柚皮素干預組。對照組為不含血清的DEME培養液；CSE組為2.5%、5%、10%CSE的DEME培養液；柚皮素干預組再分為低劑量組、中劑量組和高劑量組，終濃度分別為5、10、20 μmol/L。
3．ELISA檢測：使用ELISA試劑盒測定細胞培養上清液中的VEGF，根據試劑盒說明制作標準曲線，取100 μL樣品加入已包被抗血管內皮生長因子抗體的酶標板上，充分混勻后置37 ℃溫度下反應90 min，洗板后加入生物素化的一抗1 h，再次洗板后加入酶標二抗30 min，然后加入酶底物15 min，測定吸光度，計算樣品中的VEGF的含量。
4．Western blot法測定Smad3水平和磷酸化后的Smad3(p-Smad3)水平：提取對照組、CSE(5%)組，以及柚皮素干預低劑量組、中劑量組、高劑量組的細胞總蛋白，電泳后轉膜，以脫脂奶粉封閉，標一抗4 ℃過夜，二抗為辣根過氧化物酶標記抗體，于室溫下震搖1 h，X光壓片曝光后分析。
三 統計學處理
采用SPSS 15.0統計軟件進行統計學分析。數據以
結果
一 CSE對人胚肺成纖維細胞VEGF表達的影響
用含CSE的DEME培養基培養的人胚肺成纖維細胞VEGF表達較對照組明顯升高，且隨著劑量與時間的增加，VEGF的增加越明顯。結果見圖 1。
圖1
CSE誘導人胚肺成纖維細胞生成VEGF
與對照組比較，*
二 柚皮素對CSE誘導的人胚肺成纖維細胞VEGF表達的影響
CSE可以刺激成纖維細胞釋放VEGF，加入2 mL含10、20和40 μmol/L柚皮素的DEME培養液(加入5%CSE)，與對照組和5%CSE組比較，柚皮素干預組VEGF釋放減少，且隨著柚皮素濃度的增加，抑制越明顯。結果見圖 2。
圖2
柚皮素對CSE誘導的VEGF表達的影響
與對照組比較，*
三 柚皮素干預對TGF-β1誘導的Smad3磷酸化的影響
對照組和CSE組Smad3表達總量無明顯差異(P＞0.05)，而CSE組p-Smad3明顯高于對照組。與柚皮素共同孵育，柚皮素干預組Smda3的表達總量與CSE組比較無明顯差異，而p-Smad3的含量較CSE組明顯降低(P＜0.05)，且柚皮素劑量越大，降低越明顯。結果見圖 3。
圖3
柚皮素(20 μmol/L)對Smad3及p-Smad3的影響 a：Smad3和p-Smad3電泳圖；b：Smad3與GAPDH灰度比值；c：p-Smad3與GAPDH灰度比值
與對照組比較，*
討論
在慢阻肺病程中，成纖維細胞不僅起著結構支撐作用，還能釋放生長因子以旁分泌和自分泌的形式調節和維持微環境穩態。其中成纖維細胞分泌的VEGF通過刺激有絲分裂調節內皮細胞的生存與分化，促進肺氣腫、肺動脈高壓的形成。煙霧作為慢阻肺主要的發病原因之一，其引起的氣道損傷及此后的肺動脈高壓與VEGF密切相關，因此研究VEGF的生成及影響因素具有重要意義。目前已發現成纖維細胞可以在TGF-β1刺激下誘導生成VEGF。Kobayashi等[10]通過siRNA對Smad2與Smad3的RNA干擾實驗，發現TGF-β1與TβR1結合后，通過Smad3而非Smad2產生VEGF。CSE可以不依賴TGF-β1活化TβR1，從而通過Smad3誘導VEGF生成。我們的研究亦發現，隨著CSE濃度的增加，成纖維細胞生成VEGF逐漸增加，與之前的研究一致。
柚皮素活化后能抑制部分炎性基因的表達，并且能降低大鼠動脈損傷重建后血管內皮的過度增生，提示其可能具有抑制血管增生及氣道重塑的作用。本研究發現柚皮素能抑制CSE引起的VEGF生成，并且隨柚皮素濃度的增加，抑制作用越明顯。
由于CSE是通過TβR1/Smad3途徑誘導VEGF生成，而柚皮素可以抑制此種效應，那么柚皮素可否抑制TβR1/Smad3通路呢？通過對Smad3及Smad3磷酸化程度的檢測，我們發現柚皮素能抑制加入CSE后60 min時人胚肺成纖維細胞內Smad3的總量，同時Smad3磷酸化程度降低，提示柚皮素可以通過抑制TβR1/Smad3通路抑制CSE誘導的VEGF產生。
綜上所述，本研究證實了柚皮素可以抑制成纖維細胞生成VEGF，原因可能是抑制了Smad3效應蛋白行使生物學功能，從而影響TβR1/Smad3通路，減少了其靶基因的表達。本研究結果為利用柚皮素治療呼吸系統疾病提供了理論依據，為治療慢阻肺提供了新的思路和方法
