引用本文： 貴詩雨, 黃丹, 朱佳琳, 周小雨, 郭文愷, 方向. 基于腹膜組織病理探討腹外疝完全腹膜外腹膜前間隙補片修補術對腹膜的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(8): 919-925. doi: 10.7507/1007-9424.202304025 復制
腹外疝是腹腔臟器在腹內壓的作用下經過腹壁薄弱處突出體表所致，臨床表現為牽拉痛、可回納的腹壁包塊[1-2]。腹壁強度減弱如手術切口、外傷、炎癥、切斷腹壁神經、肌肉退化萎縮以及膠原代謝異常，或者腹內壓增加如咳嗽、便秘、晚期妊娠、腹水、排尿困難、嬰兒過度嚎哭、嘔吐、腹內腫瘤等因素均可導致腹外疝的發生[3]。腹外疝診斷一旦明確，首選手術治療。作為無張力疝修補術方案之一的完全腹膜外腹膜前間隙無張力補片修補術具有手術時間短、復發率低、術后疼痛輕、愈合快等優點，目前在臨床中得到了廣泛的應用[4]。但是腸粘連、腸穿孔等是完全腹膜外腹膜前間隙補片修補術的嚴重并發癥，這可能是該手術對腹膜的不同程度損傷所致[5-6]，但目前國內外并無研究明確進行該手術時對腹膜前間隙的廣泛游離及補片的植入是否會導致腹膜的缺血壞死以及對腹膜功能有所影響。故本研究擬在切口疝完全腹膜外腹膜前間隙補片修補術動物模型中觀察采用該手術修補前后腹膜的病理改變情況，以明確該手術中對腹膜前間隙的廣泛游離是否會造成腹膜的缺血壞死并影響腹膜功能，以期加強對腹外疝術后并發癥的預防，為臨床治療方案選擇提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗對象
本研究選取80只SD大鼠，其中體質量220 g左右的雄性大鼠40只，200 g左右的雌性大鼠40只，均購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。所有大鼠用耳釘予以標記，清潔環境（20～25 ℃），自由飲水，普通飲食。本研究獲得四川省醫學科學院·四川省人民醫院實驗動物研究所福利倫理委員會批準，實驗過程中動物的處理遵守倫理要求。
1.2 試劑和儀器
1.2.1 試劑
磷酸二氫鈉（批號為20200507，規格為500 g/瓶）和磷酸氫二鈉（批號為20210220，規格為500 g/瓶）均購自福晨（天津）化學試劑有限公司。甲醛（批號為2021033101，規格500 mL）購自成都市科隆化學有限公司。無水乙醇（分析純級，批號為GB678-90，規格為2.5 L/桶）購自成都海興化工試劑廠。蘇木精（hematoxylin，H）染液（批號為CR2102133，規格為500 mL/瓶）和伊紅（eosin，E）染液（批號為CR2101094，規格為500 mL/瓶）均購自武漢塞維爾生物科技有限公司。鹽酸-乙醇分化液：鹽酸（分析純級，批號為200630，規格為500 mL/瓶）購自成都西隴科學有限公司；中性樹膠（批號為70050050，規格為100 g/瓶）購自Biosharp生物公司。
1.2.2 儀器
JT-12S自動組織脫水機購自武漢俊杰電子有限公司；BMJ-A型包埋機購自常州郊區中威電子儀器廠；RS36型全自動染色機購自常州派斯杰醫療設備有限公司；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀購自常州市中威電子儀器有限公司；Pannoramic 250數字切片掃描儀購自匈牙利3D Histech公司。
1.3 實驗動物分組及處理
本研究實驗動物分為空白對照組、補片植入空白對照組、疝模型對照組及疝模型補片修補組。所有大鼠在實驗開始前無干擾適應性飼養1周。
1.3.1 空白對照組
采用簡單隨機抽樣方法（下同）選取8只SD大鼠（雌雄各半），予以舒泰?50（50 mg/kg）肌肉注射麻醉[6]，麻醉完成（大鼠呼吸心跳存在、痛覺刺激消失以及角膜反射消失代表麻醉完成[7]）后，大鼠置于恒溫（37 ℃）加熱臺上，用膠帶仰臥位固定四肢于泡沫板上，暴露手術部位，聚維酮碘消毒3次后，從劍突下約4 cm沿腹中線切開皮膚，分離皮下組織，從腹中線左側約1 cm處開始切開肌肉，取下一塊約3 cm×2 cm大小的整塊腹壁組織，于組織液中固定，取完組織后予以安樂死。
1.3.2 補片植入空白對照組
隨機選取32只SD大鼠（雌雄各半），麻醉、消毒完成后，從劍突下約4 cm處沿腹中線作一約4 cm切口，逐層分離至肌肉層，沿腹中線左側約0.1 cm處切開腹直肌前鞘，逐層分離腹直肌、腹直肌后鞘，游離腹膜前間隙至周邊的肌肉鞘膜，暴露左側腹膜約3.0 cm×0.6 cm大小，采用同左側的方法暴露右側腹膜約3.0 cm×0.6 cm大小，放入合適大小的補片 ［因游離腹膜前間隙時會至兩側肌肉鞘膜，故植入的補片（北京天助暢運醫療技術股份有限公司）會大于游離的腹膜前間隙面積，約3 cm×2 cm大小］，用可吸收線連續縫合肌肉、筋膜、皮下組織，不可吸收線間斷縫合皮膚。補片植入手術完成后，予以5萬U/只青霉素（連續3 d，肌肉注射）預防感染[8]（中國廣州白云天鑫藥業有限公司）和酒石酸布托諾啡（0.02 mg/只，肌肉注射）控制術后疼痛（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）。每只大鼠的手術時間控制在10 min內。最后分別于補片植入手術完成后的第1、4、8、12周時取手術切口旁3 cm×2 cm大小的整塊腹壁組織，于組織液中固定，每個時間點隨機抽取8只大鼠（雌雄各半）。取完組織后所有大鼠于相應時間點予以安樂死。
1.3.3 疝模型對照組及疝模型補片修補組
剩余40只雌雄各半的SD大鼠用于構建疝模型。所有大鼠麻醉完成后，游離左側腹膜前間隙方法與補片植入空白對照組相同，暴露左側腹膜約3.0 cm×0.6 cm大小，切除上方肌肉，充分止血，縫合皮膚。每只大鼠的造模過程控制在10 min內完成。然后無干擾飼養后第2周時40只大鼠切口疝造模均成功。① 隨機選取8只作為疝模型對照組，取手術切口左側約1 cm×3 cm大小的整塊腹壁組織，于組織液中固定。② 其余32只大鼠從原切口切開皮膚，分離疝囊與皮膚、周圍肌肉，游離腹膜前間隙至周圍肌肉鞘膜，腹膜前間隙（包括疝囊）約3.0 cm×1.2 cm大小（寬為腹中線左右各0.6 cm），放入合適大小（約3 cm×2 cm大小）補片后，后續處理過程同補片植入空白對照組。然后分別于疝修補手術完成后的第1、4、8、12周時取手術切口旁約3 cm×2 cm大小的整塊腹壁組織后于組織液中固定，每個時間點隨機抽取8只大鼠（雌雄各半）。取完組織后所有大鼠予以安樂死。
1.4 觀察小鼠腹膜組織病理形態變化及判斷標準
所有組織標本按照病理檢驗標準操作流程進行操作：10%甲醛固定、石蠟包埋、切成5 μm厚切片（腹壁組織縱切：包括腹膜、補片、肌肉），染色、封片等，最后采用匈牙利3D Histech公司的Pannoramic 250數字切片掃描儀對切片進行圖像采集，每張切片先于40倍鏡下觀察全部組織的大體病變，選擇要觀察的區域采集50倍和200倍圖片，采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察小鼠腹膜組織的病理形態，同時比較各組腹膜組織的炎細胞浸潤程度和纖維化增生程度。炎細胞浸潤程度和纖維化增生程度判斷標準參照文獻[9-10]：組織沒有病變，記為“（–）”；組織的變化幾乎未超過正常范圍內的變化即最低限度的變化，記為“（+）”；組織病變易于識別，但嚴重程度有限，組織病變可能不會產生任何功能障礙，病變組織面積的范圍占觀察區域的11%～20% ，記為“（++）”；組織病變突出，很有可能向嚴重性發展，可能產生有限度的組織或器官功能障礙，21%～40%的觀察區域組織受累，記為“（+++）”；組織病變程度嚴重且已形成完全性病變，預期會產生明顯的組織或器官功能障礙，病變涉及 41%～100%的觀察區域組織范圍，記為“（++++）”。本研究中將組織病理改變程度（–）定義為“無”，（+）定義為“輕度”，（++）定義為“中度”，（+++）和（++++）定義為“重度”，共4個等級。
1.5 統計學方法
用IBM SPSS 26.0軟件對數據進行統計。2組間的等級資料比較采用Wilcoxon Mann-Whitney秩和檢驗；多組間的等級資料比較使用Kruskal-Wallis秩和檢驗，檢驗水準α=0.05。若多組比較有統計學意義，再使用SPSS的Bonferroni法進行事后多重比較（事后多重比較所得的P值為乘以比較次數后的P值）。
2 結果
2.1 各組腹膜組織的病理變化
空白對照組的腹膜間皮細胞呈單層扁平上皮排列，整齊、結構完整、清晰，間皮下結締組織緊貼肌束膜，未見病理反應（圖1a）。
圖1
示各組SD大鼠腹膜組織病理變化（HE染色 ×200）
a、b：分別為空白對照組（a）和疝模型對照組（b）的腹膜組織改變（紅箭示腹膜間皮細胞，綠箭示受損肌肉細胞）；c、d：分別為術后第1周時補片植入空白對照組（c）和疝模型補片修補組（d）的腹膜組織改變（紅箭示腹膜間皮細胞，綠箭示肌肉變性壞死，黑箭示血管，藍箭示淋巴細胞，橙箭示中性粒細胞）；e、f：分別為術后第4周時補片植入空白對照組（e）和疝模型補片修補組（f）的腹膜組織改變（紅箭示腹膜間皮細胞，綠箭示肌肉變性壞死，黑箭示血管，藍箭示淋巴細胞， 橙箭示中性粒細胞，黃箭示成纖維細胞）；g、h：分別為術后第8周時補片植入空白對照組（g）和疝模型補片修補組（h）的腹膜組織改變（紅箭示腹膜間皮細胞，綠箭示纖維組織增生，黑箭示血管，藍箭示淋巴細胞，橙箭示中性粒細胞，黃箭示成纖維細胞）；i、j：分別為術后第12周時補片植入空白對照組（i）和疝模型補片修補組（j）的腹膜組織改變（紅箭示腹膜間皮細胞，綠箭示纖維組織增生，黑箭示血管，藍箭示淋巴細胞，橙箭示中性粒細胞，黃箭示肥大細胞，紫箭示含鐵血黃素沉積）
疝模型對照組的腹膜組織呈單層扁平上皮排列，較為整齊，間皮下結締組織壞死區域可見大量纖維組織增生伴細胞浸潤（圖1b）。
補片植入空白對照組及疝模型補片修補組的腹膜組織病理變化：術后第1周時，腹膜的間皮結構結構不清、排列錯亂甚至基本不見；腹膜下肌肉組織大面積壞死，補片周圍及壞死區域內可見大量纖維組織增生伴炎細胞浸潤，部分區域的纖維組織較為致密、紅染，可見增生纖維組織大面積取代原有肌肉組織，淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞、成纖維細胞及新生血管聚集（圖1c、1d）；術后第4周時，腹膜的間皮細胞結構較為清晰，間皮下、補片周圍纖維組織增生較為明顯，增生區域不同程度炎細胞浸潤，見淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞及成纖維細胞及新生血管聚集，部分巨噬細胞胞質內可見棕黃色含鐵血黃素沉積（圖1e、1f）；術后第8周時，腹膜的間皮細胞結構較為清晰，間皮下、補片周圍纖維組織增生較為明顯，增生區域輕微或輕度炎細胞浸潤（圖1g、1h）；術后第12周時，腹膜的間皮細胞結構較為清晰，間皮下、補片周圍纖維組織增生較為明顯，增生區域輕微或輕度炎細胞浸潤（圖1i、1j）。
2.2 各組腹膜組織的炎細胞浸潤程度變化
結果見表1。① 空白對照組與補片植入空白對照組各時間點亞組大鼠的腹膜組織的炎細胞浸潤程度整體比較差異有統計學意義（H=19.724、P＜0.001），進一步比較發現，補片植入空白對照組術后第1和4周時較空白對照組加重（P＜0.001、P=0.005），而術后第8和12周時與空白對照組比較差異無統計學意義（P=0.117，P=0.052）；補片植入空白對照組術后第4周與術后第1周比較差異無統計學意義（P=0.363），術后第8周時較術后第1周時明顯減輕（P=0.021），術后第12周時與術后第1周比較差異無統計學意義（P=0.051）。② 空白對照組、疝模型對照組及疝模型補片修補組各時間點亞組大鼠的腹膜組織的炎細胞浸潤程度整體比較差異有統計學意義（H=22.843、P＜0.001）。進一步比較發現，疝模型對照組與空白對照組比較差異無統計學意義（P=0.102）；疝模型補片修補組術后第1周時較疝模型對照組加重明顯（P=0.014），術后第4、8、12周時與疝模型對照組比較變化不明顯（P值分別為1.000、1.000、1.000）；疝模型補片修補組術后第4周與術后第1周比較差異無統計學意義（P=0.102）；術后第8和12周時較術后第1周減輕（P=0.040、P=0.040）。③ 相同時間點時補片植入空白對照組與疝模型補片修補組間比較差異均無統計學意義（Z值分別為1.000、0.236、1.118、0.522，P值分別為0.317、0.814、0.264、0.602）。
表1
各組腹膜組織的炎細胞浸潤程度與纖維化增生程度（只）
2.3 各組腹膜組織的纖維增生程度變化
結果見表1。① 空白對照組與補片植入空白對照組各時間點亞組大鼠腹膜組織的纖維化增生程度變化整體比較差異有統計學意義（H=18.685、P＜0.001）。進一步比較發現，補片植入空白對照組術后第1、4、12周時較空白對照組明顯加重（P＜0.001、P=0.003、P=0.043），術后第8周時較空白對照組變化不明顯（P=0.204）；補片植入空白對照組術后第4、8及12周時較術后第1周時減輕（P=0.017），尤其是第8周時。② 空白對照組、疝模型對照組及疝模型補片修補組各時間點亞組大鼠腹膜組織的纖維化增生程度變化整體比較差異有統計學意義（H=17.485、P＜0.001）。進一步比較發現，疝模型對照組較空白對照組明顯加重（P=0.012）；疝模型補片修補組術后第1、4、8、12周時與疝模型對照組比較差異未見有統計學意義（P值分別為0.524、1.000、1.000、1.000）；疝模型補片修補組術后第4、8、12周時與術后第1周比較比較差異未見有統計學意義（P值分別為1.000、0.055、0.056）。③ 相同時間點補片植入空白對照組與疝模型補片修補組間比較差異均無統計學意義（Z值分別為0.000、0.540、0.185、0.488，P值分別為1.000、0.589、0.854、0.626）。
3 討論
腹外疝根據其發生機制，除了部分嬰兒可自行痊愈外，外科手術是它能被治愈的唯一方式。目前無張力疝修補術是腹外疝治療的首選手術方式，根據補片放置層次不同，可分為肌鞘前的Onlay修補法、肌肉間的Inlay修補法、肌后和腹膜前的Sublay修補法、腹腔內補片植入修補法[11]。其中因腹膜前間隙是壁層腹膜和腹橫筋膜層之間的一層無血管和神經的脂肪結締組織間隙[12]，將補片植入腹膜前間隙，補片不與腹腔臟器直接接觸，同時能達到疝囊“超高位”結扎，是目前常用的手術方式之一。根據手術入路的不同，目前常見的手術方式可分為經腹腹膜前和完全腹膜外[13]，其中后者所有手術操作均在腹膜前間隙中操作，不進入腹腔，不切開腹膜，不與腹腔臟器直接接觸，能明顯減少腹腔粘連等并發癥發生。但大量研究[14-18]證明，完全腹膜外腹膜前間隙補片修補術后可能發生腸粘連、腸穿孔等并發癥，可能的原因是，完全腹膜外腹膜前間隙補片修補術中對腹膜的廣泛游離及補片的植入導致腹膜的不同程度損傷所致。但目前國內外對完全腹膜外腹膜前間隙補片修補手術中對腹膜前間隙的廣泛游離及補片的植入是否會導致腹膜的缺血壞死及對其功能有所影響的相關研究較少。基于此背景，本研究通過建立腹外疝完全腹膜外腹膜前間隙補片修補術動物模型，以觀察完全腹膜外腹膜前間隙補片疝修補術前與術后腹膜的病理改變情況，明確完全腹膜外腹膜前間隙補片修補術中對腹膜前間隙的廣泛游離是否會造成腹膜的缺血壞死并影響其功能，以期加強對腹外疝術后并發癥的預防，為臨床探索治療方案提供新思路。本研究通過動物實驗，從完全腹膜外腹膜前間隙補片修補手術后腹膜組織炎細胞浸潤和腹膜組織纖維化改變角度分析它是否會導致腹膜的缺血壞死以及對腹膜功能有所影響。
3.1 腹膜組織炎細胞浸潤變化情況
本研究中結果未發現疝模型對照組的腹膜組織炎細胞浸潤程度與空白對照組比較有統計學意義上的差異（P＞0.05），此結論提示，創傷所產生的炎細胞浸潤在術后2周即可被機體修復至正常狀態，并且疝不會刺激腹膜組織發生炎細胞浸潤，文君等[19]報道的傷口愈合過程中的炎癥期主要發生在術后1周的結論可對此進行佐證。
本研究中結果發現，補片植入空白對照組術后第1和4周時即可發現腹膜組織中炎細胞浸潤程度較空白對照組明顯加重（P＜0.05），但在術后第8和12周時即與空白對照組比較未見差異有統計學意義（P＞0.05），此結果提示，廣泛游離腹膜前間隙以及補片植入可造成腹膜的機械性損傷[20]，其原因是，腹膜損傷可引起巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞和單核細胞的激活，并且激活的炎細胞通過Toll樣受體識別細菌病原體或異物，分泌大量炎癥細胞因子，促進腹膜組織發生急性炎癥反應[21]，此炎癥反應可持續4～8周；然而當腹膜受到損傷后，不論腹膜缺損大小，間皮細胞的完整性被破壞后間皮細胞的再生在損傷后24 h內即可發生，通過愈合的雙峰機制使腹膜再間皮化[18]。經過機體修復，腹膜的分泌功能在術后第8周時可完全恢復，間皮細胞分泌的透明質酸可抑制血漿酶原激活，從而減少炎細胞浸潤[22-23]。此原因分析也可以解釋本研究中疝模型補片修補組術后隨著時間變化的結果，如疝模型補片修補組術后第 8、12周時腹膜組織中炎細胞浸潤程度較術后第 1 周時明顯減輕。
此外，本研究未發現補片修補術后各時間點時補片植入空白對照組與疝模型補片修補組間在腹膜組織炎細胞浸潤程度上差異有統計學意義（P＞0.05），此結果同樣提示，疝本身不會刺激腹膜組織發生炎細胞浸潤。
3.2 腹膜組織纖維化變化情況
慢性炎癥可導致腹膜組織發生纖維化[24]。將補片植入腹膜前間隙是否會刺激腹膜組織發生纖維化，本研究對此進行了分析。本研究中發現，疝模型對照組腹膜組織纖維化程度較空白對照組明顯加重（P＜0.05），此結果提示，疝構建模型過程中的手術創傷可能刺激腹膜組織纖維化增生。
本研究從另外角度觀察發現，補片植入空白對照組術后第1、4、12周時腹膜組織纖維增生程度較空白對照組明顯加重（P＜0.05），而在術后第8周時未見與空白對照組比較有統計學意義的差異（P>0.05），且還發現補片植入空白對照組術后第4、8及12周時較術后第1周時減輕（尤其是第8周時），此結果提示，廣泛腹膜前間隙游離以及補片的植入可造成腹膜的機械性損傷[20]，而腹膜損傷引起的巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞和單核細胞的激活是響應外部信號纖維化介質的主要來源[25]，一旦這些免疫細胞被激活，可進一步激活固有成纖維細胞（稱為“肌成纖維細胞”），這些肌成纖維細胞可分泌大量的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原，從而參與局部組織的重建和改建[26]。在廣泛游離腹膜前間隙以及植入補片時造成的腹膜損傷可刺激機體腹膜組織在術后第1、4、12周時產生大量的纖維組織，而在術后第8周時出現一過性降低，分析其原因，前期（術后第1、4周）腹膜組織纖維增生程度高可能是因為腹膜損傷后，成纖維細胞大量增殖、遷移至受損組織并分化為肌成纖維細胞，合成并分泌細胞外基質來促進傷口組織的修復[27]；而在后期（術后第12周）腹膜組織纖維增生程度再度升高可能是因為局部補片的異物刺激局部腹膜組織發生慢性炎癥反應并纖維化，從而形成瘢痕組織包裹補片；在術后第8周時出現一過性降低，其原因可能是，腹膜損傷后，經過機體的自身修復，腹膜功能完全恢復正常，然后它分泌的透明質酸可抑制血漿酶原激活，從而減少纖維素滲出[22-23]。
此外，在本研究中未發現補片修補術后各時間點時補片植入空白對照組與疝模型補片修補組間在腹膜組織纖維增生程度上差異有統計學意義（P＞0.05），此結果提示，疝病本身的存在不會刺激腹膜組織纖維化增生，而手術過程中的創傷會刺激腹膜組織纖維化增生。
總之，從本研究的大鼠實驗結果看，疝本身不會刺激腹膜組織發生炎細胞浸潤和纖維化增生，然而在行完全腹膜外腹膜前間隙補片修補過程中，廣泛的腹膜前間隙游離以及補片的植入操作會造成腹膜的損傷并影響其功能，但通過機體自身的修復，對腹膜損傷的功能影響在術后第8周時基本可完全恢復至正常。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：貴詩雨和黃丹負責醞釀和設計實驗、實施研究、采集數據、統計學分析以及撰寫文章；方向負責醞釀和設計實驗、獲取研究經費、技術和材料支持，對文章的知識性內容作批評性審閱；朱佳琳、周小雨和郭文愷負責醞釀和設計實驗、實施研究及采集數據。
倫理聲明：本研究通過四川省醫學科學院·四川省人民醫院實驗動物研究所福利倫理委員會審批通過（批文編號：倫審2022第006號），并且獲得動物許可證 ［動物許可證號：SYXK（川）2018-058］。
腹外疝是腹腔臟器在腹內壓的作用下經過腹壁薄弱處突出體表所致，臨床表現為牽拉痛、可回納的腹壁包塊[1-2]。腹壁強度減弱如手術切口、外傷、炎癥、切斷腹壁神經、肌肉退化萎縮以及膠原代謝異常，或者腹內壓增加如咳嗽、便秘、晚期妊娠、腹水、排尿困難、嬰兒過度嚎哭、嘔吐、腹內腫瘤等因素均可導致腹外疝的發生[3]。腹外疝診斷一旦明確，首選手術治療。作為無張力疝修補術方案之一的完全腹膜外腹膜前間隙無張力補片修補術具有手術時間短、復發率低、術后疼痛輕、愈合快等優點，目前在臨床中得到了廣泛的應用[4]。但是腸粘連、腸穿孔等是完全腹膜外腹膜前間隙補片修補術的嚴重并發癥，這可能是該手術對腹膜的不同程度損傷所致[5-6]，但目前國內外并無研究明確進行該手術時對腹膜前間隙的廣泛游離及補片的植入是否會導致腹膜的缺血壞死以及對腹膜功能有所影響。故本研究擬在切口疝完全腹膜外腹膜前間隙補片修補術動物模型中觀察采用該手術修補前后腹膜的病理改變情況，以明確該手術中對腹膜前間隙的廣泛游離是否會造成腹膜的缺血壞死并影響腹膜功能，以期加強對腹外疝術后并發癥的預防，為臨床治療方案選擇提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗對象
本研究選取80只SD大鼠，其中體質量220 g左右的雄性大鼠40只，200 g左右的雌性大鼠40只，均購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。所有大鼠用耳釘予以標記，清潔環境（20～25 ℃），自由飲水，普通飲食。本研究獲得四川省醫學科學院·四川省人民醫院實驗動物研究所福利倫理委員會批準，實驗過程中動物的處理遵守倫理要求。
1.2 試劑和儀器
1.2.1 試劑
磷酸二氫鈉（批號為20200507，規格為500 g/瓶）和磷酸氫二鈉（批號為20210220，規格為500 g/瓶）均購自福晨（天津）化學試劑有限公司。甲醛（批號為2021033101，規格500 mL）購自成都市科隆化學有限公司。無水乙醇（分析純級，批號為GB678-90，規格為2.5 L/桶）購自成都海興化工試劑廠。蘇木精（hematoxylin，H）染液（批號為CR2102133，規格為500 mL/瓶）和伊紅（eosin，E）染液（批號為CR2101094，規格為500 mL/瓶）均購自武漢塞維爾生物科技有限公司。鹽酸-乙醇分化液：鹽酸（分析純級，批號為200630，規格為500 mL/瓶）購自成都西隴科學有限公司；中性樹膠（批號為70050050，規格為100 g/瓶）購自Biosharp生物公司。
1.2.2 儀器
JT-12S自動組織脫水機購自武漢俊杰電子有限公司；BMJ-A型包埋機購自常州郊區中威電子儀器廠；RS36型全自動染色機購自常州派斯杰醫療設備有限公司；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀購自常州市中威電子儀器有限公司；Pannoramic 250數字切片掃描儀購自匈牙利3D Histech公司。
1.3 實驗動物分組及處理
本研究實驗動物分為空白對照組、補片植入空白對照組、疝模型對照組及疝模型補片修補組。所有大鼠在實驗開始前無干擾適應性飼養1周。
1.3.1 空白對照組
采用簡單隨機抽樣方法（下同）選取8只SD大鼠（雌雄各半），予以舒泰?50（50 mg/kg）肌肉注射麻醉[6]，麻醉完成（大鼠呼吸心跳存在、痛覺刺激消失以及角膜反射消失代表麻醉完成[7]）后，大鼠置于恒溫（37 ℃）加熱臺上，用膠帶仰臥位固定四肢于泡沫板上，暴露手術部位，聚維酮碘消毒3次后，從劍突下約4 cm沿腹中線切開皮膚，分離皮下組織，從腹中線左側約1 cm處開始切開肌肉，取下一塊約3 cm×2 cm大小的整塊腹壁組織，于組織液中固定，取完組織后予以安樂死。
1.3.2 補片植入空白對照組
隨機選取32只SD大鼠（雌雄各半），麻醉、消毒完成后，從劍突下約4 cm處沿腹中線作一約4 cm切口，逐層分離至肌肉層，沿腹中線左側約0.1 cm處切開腹直肌前鞘，逐層分離腹直肌、腹直肌后鞘，游離腹膜前間隙至周邊的肌肉鞘膜，暴露左側腹膜約3.0 cm×0.6 cm大小，采用同左側的方法暴露右側腹膜約3.0 cm×0.6 cm大小，放入合適大小的補片 ［因游離腹膜前間隙時會至兩側肌肉鞘膜，故植入的補片（北京天助暢運醫療技術股份有限公司）會大于游離的腹膜前間隙面積，約3 cm×2 cm大小］，用可吸收線連續縫合肌肉、筋膜、皮下組織，不可吸收線間斷縫合皮膚。補片植入手術完成后，予以5萬U/只青霉素（連續3 d，肌肉注射）預防感染[8]（中國廣州白云天鑫藥業有限公司）和酒石酸布托諾啡（0.02 mg/只，肌肉注射）控制術后疼痛（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）。每只大鼠的手術時間控制在10 min內。最后分別于補片植入手術完成后的第1、4、8、12周時取手術切口旁3 cm×2 cm大小的整塊腹壁組織，于組織液中固定，每個時間點隨機抽取8只大鼠（雌雄各半）。取完組織后所有大鼠于相應時間點予以安樂死。
1.3.3 疝模型對照組及疝模型補片修補組
剩余40只雌雄各半的SD大鼠用于構建疝模型。所有大鼠麻醉完成后，游離左側腹膜前間隙方法與補片植入空白對照組相同，暴露左側腹膜約3.0 cm×0.6 cm大小，切除上方肌肉，充分止血，縫合皮膚。每只大鼠的造模過程控制在10 min內完成。然后無干擾飼養后第2周時40只大鼠切口疝造模均成功。① 隨機選取8只作為疝模型對照組，取手術切口左側約1 cm×3 cm大小的整塊腹壁組織，于組織液中固定。② 其余32只大鼠從原切口切開皮膚，分離疝囊與皮膚、周圍肌肉，游離腹膜前間隙至周圍肌肉鞘膜，腹膜前間隙（包括疝囊）約3.0 cm×1.2 cm大小（寬為腹中線左右各0.6 cm），放入合適大小（約3 cm×2 cm大小）補片后，后續處理過程同補片植入空白對照組。然后分別于疝修補手術完成后的第1、4、8、12周時取手術切口旁約3 cm×2 cm大小的整塊腹壁組織后于組織液中固定，每個時間點隨機抽取8只大鼠（雌雄各半）。取完組織后所有大鼠予以安樂死。
1.4 觀察小鼠腹膜組織病理形態變化及判斷標準
所有組織標本按照病理檢驗標準操作流程進行操作：10%甲醛固定、石蠟包埋、切成5 μm厚切片（腹壁組織縱切：包括腹膜、補片、肌肉），染色、封片等，最后采用匈牙利3D Histech公司的Pannoramic 250數字切片掃描儀對切片進行圖像采集，每張切片先于40倍鏡下觀察全部組織的大體病變，選擇要觀察的區域采集50倍和200倍圖片，采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察小鼠腹膜組織的病理形態，同時比較各組腹膜組織的炎細胞浸潤程度和纖維化增生程度。炎細胞浸潤程度和纖維化增生程度判斷標準參照文獻[9-10]：組織沒有病變，記為“（–）”；組織的變化幾乎未超過正常范圍內的變化即最低限度的變化，記為“（+）”；組織病變易于識別，但嚴重程度有限，組織病變可能不會產生任何功能障礙，病變組織面積的范圍占觀察區域的11%～20% ，記為“（++）”；組織病變突出，很有可能向嚴重性發展，可能產生有限度的組織或器官功能障礙，21%～40%的觀察區域組織受累，記為“（+++）”；組織病變程度嚴重且已形成完全性病變，預期會產生明顯的組織或器官功能障礙，病變涉及 41%～100%的觀察區域組織范圍，記為“（++++）”。本研究中將組織病理改變程度（–）定義為“無”，（+）定義為“輕度”，（++）定義為“中度”，（+++）和（++++）定義為“重度”，共4個等級。
1.5 統計學方法
用IBM SPSS 26.0軟件對數據進行統計。2組間的等級資料比較采用Wilcoxon Mann-Whitney秩和檢驗；多組間的等級資料比較使用Kruskal-Wallis秩和檢驗，檢驗水準α=0.05。若多組比較有統計學意義，再使用SPSS的Bonferroni法進行事后多重比較（事后多重比較所得的P值為乘以比較次數后的P值）。
2 結果
2.1 各組腹膜組織的病理變化
空白對照組的腹膜間皮細胞呈單層扁平上皮排列，整齊、結構完整、清晰，間皮下結締組織緊貼肌束膜，未見病理反應（圖1a）。
圖1
示各組SD大鼠腹膜組織病理變化（HE染色 ×200）
a、b：分別為空白對照組（a）和疝模型對照組（b）的腹膜組織改變（紅箭示腹膜間皮細胞，綠箭示受損肌肉細胞）；c、d：分別為術后第1周時補片植入空白對照組（c）和疝模型補片修補組（d）的腹膜組織改變（紅箭示腹膜間皮細胞，綠箭示肌肉變性壞死，黑箭示血管，藍箭示淋巴細胞，橙箭示中性粒細胞）；e、f：分別為術后第4周時補片植入空白對照組（e）和疝模型補片修補組（f）的腹膜組織改變（紅箭示腹膜間皮細胞，綠箭示肌肉變性壞死，黑箭示血管，藍箭示淋巴細胞， 橙箭示中性粒細胞，黃箭示成纖維細胞）；g、h：分別為術后第8周時補片植入空白對照組（g）和疝模型補片修補組（h）的腹膜組織改變（紅箭示腹膜間皮細胞，綠箭示纖維組織增生，黑箭示血管，藍箭示淋巴細胞，橙箭示中性粒細胞，黃箭示成纖維細胞）；i、j：分別為術后第12周時補片植入空白對照組（i）和疝模型補片修補組（j）的腹膜組織改變（紅箭示腹膜間皮細胞，綠箭示纖維組織增生，黑箭示血管，藍箭示淋巴細胞，橙箭示中性粒細胞，黃箭示肥大細胞，紫箭示含鐵血黃素沉積）
疝模型對照組的腹膜組織呈單層扁平上皮排列，較為整齊，間皮下結締組織壞死區域可見大量纖維組織增生伴細胞浸潤（圖1b）。
補片植入空白對照組及疝模型補片修補組的腹膜組織病理變化：術后第1周時，腹膜的間皮結構結構不清、排列錯亂甚至基本不見；腹膜下肌肉組織大面積壞死，補片周圍及壞死區域內可見大量纖維組織增生伴炎細胞浸潤，部分區域的纖維組織較為致密、紅染，可見增生纖維組織大面積取代原有肌肉組織，淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞、成纖維細胞及新生血管聚集（圖1c、1d）；術后第4周時，腹膜的間皮細胞結構較為清晰，間皮下、補片周圍纖維組織增生較為明顯，增生區域不同程度炎細胞浸潤，見淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞及成纖維細胞及新生血管聚集，部分巨噬細胞胞質內可見棕黃色含鐵血黃素沉積（圖1e、1f）；術后第8周時，腹膜的間皮細胞結構較為清晰，間皮下、補片周圍纖維組織增生較為明顯，增生區域輕微或輕度炎細胞浸潤（圖1g、1h）；術后第12周時，腹膜的間皮細胞結構較為清晰，間皮下、補片周圍纖維組織增生較為明顯，增生區域輕微或輕度炎細胞浸潤（圖1i、1j）。
2.2 各組腹膜組織的炎細胞浸潤程度變化
結果見表1。① 空白對照組與補片植入空白對照組各時間點亞組大鼠的腹膜組織的炎細胞浸潤程度整體比較差異有統計學意義（H=19.724、P＜0.001），進一步比較發現，補片植入空白對照組術后第1和4周時較空白對照組加重（P＜0.001、P=0.005），而術后第8和12周時與空白對照組比較差異無統計學意義（P=0.117，P=0.052）；補片植入空白對照組術后第4周與術后第1周比較差異無統計學意義（P=0.363），術后第8周時較術后第1周時明顯減輕（P=0.021），術后第12周時與術后第1周比較差異無統計學意義（P=0.051）。② 空白對照組、疝模型對照組及疝模型補片修補組各時間點亞組大鼠的腹膜組織的炎細胞浸潤程度整體比較差異有統計學意義（H=22.843、P＜0.001）。進一步比較發現，疝模型對照組與空白對照組比較差異無統計學意義（P=0.102）；疝模型補片修補組術后第1周時較疝模型對照組加重明顯（P=0.014），術后第4、8、12周時與疝模型對照組比較變化不明顯（P值分別為1.000、1.000、1.000）；疝模型補片修補組術后第4周與術后第1周比較差異無統計學意義（P=0.102）；術后第8和12周時較術后第1周減輕（P=0.040、P=0.040）。③ 相同時間點時補片植入空白對照組與疝模型補片修補組間比較差異均無統計學意義（Z值分別為1.000、0.236、1.118、0.522，P值分別為0.317、0.814、0.264、0.602）。
表1
各組腹膜組織的炎細胞浸潤程度與纖維化增生程度（只）
2.3 各組腹膜組織的纖維增生程度變化
結果見表1。① 空白對照組與補片植入空白對照組各時間點亞組大鼠腹膜組織的纖維化增生程度變化整體比較差異有統計學意義（H=18.685、P＜0.001）。進一步比較發現，補片植入空白對照組術后第1、4、12周時較空白對照組明顯加重（P＜0.001、P=0.003、P=0.043），術后第8周時較空白對照組變化不明顯（P=0.204）；補片植入空白對照組術后第4、8及12周時較術后第1周時減輕（P=0.017），尤其是第8周時。② 空白對照組、疝模型對照組及疝模型補片修補組各時間點亞組大鼠腹膜組織的纖維化增生程度變化整體比較差異有統計學意義（H=17.485、P＜0.001）。進一步比較發現，疝模型對照組較空白對照組明顯加重（P=0.012）；疝模型補片修補組術后第1、4、8、12周時與疝模型對照組比較差異未見有統計學意義（P值分別為0.524、1.000、1.000、1.000）；疝模型補片修補組術后第4、8、12周時與術后第1周比較比較差異未見有統計學意義（P值分別為1.000、0.055、0.056）。③ 相同時間點補片植入空白對照組與疝模型補片修補組間比較差異均無統計學意義（Z值分別為0.000、0.540、0.185、0.488，P值分別為1.000、0.589、0.854、0.626）。
3 討論
腹外疝根據其發生機制，除了部分嬰兒可自行痊愈外，外科手術是它能被治愈的唯一方式。目前無張力疝修補術是腹外疝治療的首選手術方式，根據補片放置層次不同，可分為肌鞘前的Onlay修補法、肌肉間的Inlay修補法、肌后和腹膜前的Sublay修補法、腹腔內補片植入修補法[11]。其中因腹膜前間隙是壁層腹膜和腹橫筋膜層之間的一層無血管和神經的脂肪結締組織間隙[12]，將補片植入腹膜前間隙，補片不與腹腔臟器直接接觸，同時能達到疝囊“超高位”結扎，是目前常用的手術方式之一。根據手術入路的不同，目前常見的手術方式可分為經腹腹膜前和完全腹膜外[13]，其中后者所有手術操作均在腹膜前間隙中操作，不進入腹腔，不切開腹膜，不與腹腔臟器直接接觸，能明顯減少腹腔粘連等并發癥發生。但大量研究[14-18]證明，完全腹膜外腹膜前間隙補片修補術后可能發生腸粘連、腸穿孔等并發癥，可能的原因是，完全腹膜外腹膜前間隙補片修補術中對腹膜的廣泛游離及補片的植入導致腹膜的不同程度損傷所致。但目前國內外對完全腹膜外腹膜前間隙補片修補手術中對腹膜前間隙的廣泛游離及補片的植入是否會導致腹膜的缺血壞死及對其功能有所影響的相關研究較少。基于此背景，本研究通過建立腹外疝完全腹膜外腹膜前間隙補片修補術動物模型，以觀察完全腹膜外腹膜前間隙補片疝修補術前與術后腹膜的病理改變情況，明確完全腹膜外腹膜前間隙補片修補術中對腹膜前間隙的廣泛游離是否會造成腹膜的缺血壞死并影響其功能，以期加強對腹外疝術后并發癥的預防，為臨床探索治療方案提供新思路。本研究通過動物實驗，從完全腹膜外腹膜前間隙補片修補手術后腹膜組織炎細胞浸潤和腹膜組織纖維化改變角度分析它是否會導致腹膜的缺血壞死以及對腹膜功能有所影響。
3.1 腹膜組織炎細胞浸潤變化情況
本研究中結果未發現疝模型對照組的腹膜組織炎細胞浸潤程度與空白對照組比較有統計學意義上的差異（P＞0.05），此結論提示，創傷所產生的炎細胞浸潤在術后2周即可被機體修復至正常狀態，并且疝不會刺激腹膜組織發生炎細胞浸潤，文君等[19]報道的傷口愈合過程中的炎癥期主要發生在術后1周的結論可對此進行佐證。
本研究中結果發現，補片植入空白對照組術后第1和4周時即可發現腹膜組織中炎細胞浸潤程度較空白對照組明顯加重（P＜0.05），但在術后第8和12周時即與空白對照組比較未見差異有統計學意義（P＞0.05），此結果提示，廣泛游離腹膜前間隙以及補片植入可造成腹膜的機械性損傷[20]，其原因是，腹膜損傷可引起巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞和單核細胞的激活，并且激活的炎細胞通過Toll樣受體識別細菌病原體或異物，分泌大量炎癥細胞因子，促進腹膜組織發生急性炎癥反應[21]，此炎癥反應可持續4～8周；然而當腹膜受到損傷后，不論腹膜缺損大小，間皮細胞的完整性被破壞后間皮細胞的再生在損傷后24 h內即可發生，通過愈合的雙峰機制使腹膜再間皮化[18]。經過機體修復，腹膜的分泌功能在術后第8周時可完全恢復，間皮細胞分泌的透明質酸可抑制血漿酶原激活，從而減少炎細胞浸潤[22-23]。此原因分析也可以解釋本研究中疝模型補片修補組術后隨著時間變化的結果，如疝模型補片修補組術后第 8、12周時腹膜組織中炎細胞浸潤程度較術后第 1 周時明顯減輕。
此外，本研究未發現補片修補術后各時間點時補片植入空白對照組與疝模型補片修補組間在腹膜組織炎細胞浸潤程度上差異有統計學意義（P＞0.05），此結果同樣提示，疝本身不會刺激腹膜組織發生炎細胞浸潤。
3.2 腹膜組織纖維化變化情況
慢性炎癥可導致腹膜組織發生纖維化[24]。將補片植入腹膜前間隙是否會刺激腹膜組織發生纖維化，本研究對此進行了分析。本研究中發現，疝模型對照組腹膜組織纖維化程度較空白對照組明顯加重（P＜0.05），此結果提示，疝構建模型過程中的手術創傷可能刺激腹膜組織纖維化增生。
本研究從另外角度觀察發現，補片植入空白對照組術后第1、4、12周時腹膜組織纖維增生程度較空白對照組明顯加重（P＜0.05），而在術后第8周時未見與空白對照組比較有統計學意義的差異（P>0.05），且還發現補片植入空白對照組術后第4、8及12周時較術后第1周時減輕（尤其是第8周時），此結果提示，廣泛腹膜前間隙游離以及補片的植入可造成腹膜的機械性損傷[20]，而腹膜損傷引起的巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞和單核細胞的激活是響應外部信號纖維化介質的主要來源[25]，一旦這些免疫細胞被激活，可進一步激活固有成纖維細胞（稱為“肌成纖維細胞”），這些肌成纖維細胞可分泌大量的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原，從而參與局部組織的重建和改建[26]。在廣泛游離腹膜前間隙以及植入補片時造成的腹膜損傷可刺激機體腹膜組織在術后第1、4、12周時產生大量的纖維組織，而在術后第8周時出現一過性降低，分析其原因，前期（術后第1、4周）腹膜組織纖維增生程度高可能是因為腹膜損傷后，成纖維細胞大量增殖、遷移至受損組織并分化為肌成纖維細胞，合成并分泌細胞外基質來促進傷口組織的修復[27]；而在后期（術后第12周）腹膜組織纖維增生程度再度升高可能是因為局部補片的異物刺激局部腹膜組織發生慢性炎癥反應并纖維化，從而形成瘢痕組織包裹補片；在術后第8周時出現一過性降低，其原因可能是，腹膜損傷后，經過機體的自身修復，腹膜功能完全恢復正常，然后它分泌的透明質酸可抑制血漿酶原激活，從而減少纖維素滲出[22-23]。
此外，在本研究中未發現補片修補術后各時間點時補片植入空白對照組與疝模型補片修補組間在腹膜組織纖維增生程度上差異有統計學意義（P＞0.05），此結果提示，疝病本身的存在不會刺激腹膜組織纖維化增生，而手術過程中的創傷會刺激腹膜組織纖維化增生。
總之，從本研究的大鼠實驗結果看，疝本身不會刺激腹膜組織發生炎細胞浸潤和纖維化增生，然而在行完全腹膜外腹膜前間隙補片修補過程中，廣泛的腹膜前間隙游離以及補片的植入操作會造成腹膜的損傷并影響其功能，但通過機體自身的修復，對腹膜損傷的功能影響在術后第8周時基本可完全恢復至正常。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：貴詩雨和黃丹負責醞釀和設計實驗、實施研究、采集數據、統計學分析以及撰寫文章；方向負責醞釀和設計實驗、獲取研究經費、技術和材料支持，對文章的知識性內容作批評性審閱；朱佳琳、周小雨和郭文愷負責醞釀和設計實驗、實施研究及采集數據。
倫理聲明：本研究通過四川省醫學科學院·四川省人民醫院實驗動物研究所福利倫理委員會審批通過（批文編號：倫審2022第006號），并且獲得動物許可證 ［動物許可證號：SYXK（川）2018-058］。
