引用本文： 趙姣姣, 莽源祎, 李立, 張升寧, 高楊. 大鼠原位肝移植模型不同灌注方式和吻合方法的效果比較. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(5): 549-553. doi: 10.7507/1007-9424.202212002 復制
大鼠原位肝移植模型是一個復雜的實驗動物模型，適用于研究肝臟再生[1-3]、小肝綜合征[4]、肝臟的排斥及耐受[5]、肝臟缺血再灌注損傷[6-7]等問題。Kamada等[8]提出的“二袖套法”是目前各學者對大鼠肝移植模型研究的基礎，由于該方法手術操作復雜、難度大，成功建立該模型是研究肝臟出現病理狀態并研究其機制的重點，而供肝質量的保證及肝上下腔靜脈的吻合是模型建立的關鍵。本研究旨在通過對大鼠供肝不同灌注方式與受體不同吻合方法的分析，為大鼠肝移植模型的成功建立提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
9～11周齡的雄性SD大鼠80只，為無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級別動物，體質量為230~270 g，供受體體質量相差10~15 g，受體略輕于供體。大鼠購于昆明醫科大學實驗動物學部 ［生產許可證號：SCXK（滇）K2020-0004］，所有實驗動物均在昆明醫科大學動物學部SPF級動物房飼養 ［實驗動物使用許可證號為SYXK（滇）K2020-0006］ 且實驗通過昆明醫科大學動物學部倫理審批（批文編號：kmmu20211208）。
1.2 實驗器械及試劑
實驗器械及試劑包括手術器械（剪刀、血管鉗、顯微器械、輸液器等購于蘇州市朗米尼康醫療器械有限公司）、8-0 Prolene顯微縫合線（寧波醫用縫針有限公司）、微量泵（MedRena公司）、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶技術有限公司）。
1.3 實驗藥品
實驗藥品包括肝素鈉（批號152012087A）、乙醚（批號20181001）、0.9%生理鹽水（批號T22071101）、阿托品（批號2011062）、乳酸鈉林格液（批號B21010409）、五水唑林鈉液（批號2007268）、地塞米松（批號2103214）等。
1.4 建立動物模型
術前準備包括阿托品配置、肝素鈉配置、灌注液配置和受體術前注射液配置。阿托品配置濃度為0.5 mg/L。肝素鈉配置：500 mL 0.9%生理鹽水與2支肝素（25 000 U/支，2 mL/支）。灌注液配置：500 mL乳酸鈉林格液與2支肝素（12 500 U/支，2 mL/支）、1支地塞米松（5 mg/mL）。受體術前注射液共1 mL，包括：0.1 mL阿托品（0.5 mg/L）、0.7 mL五水唑林鈉（1 mg/L）和0.2 mL生理鹽水。手術前禁食8 h，未禁水，供受體大鼠均采用乙醚進行麻醉。
1.5 實驗分組與方法
按照Kamada等[8]提出的“二袖套法”建立大鼠原位肝移植模型。采用隨機數字表法將大鼠隨機分為供體組和受體肝移植組。供體組為供肝獲取組：輸液器滴灌組使用腹主動脈輸液器滴灌法（n=10），滴灌法的速度為1滴/s（0.05 mL/s）；微量泵灌注組使用腹主動脈微量泵灌注法，微量泵灌注的速度為6 mL/min（n=10）；分別對供肝進行灌注，之后分別進行肝移植（各組均對應10只受體大鼠，吻合方法為減張力半針吻合法）。另一組為受體肝移植組：連續吻合組（成功完成10只即截止）使用連續吻合法，減張力半針吻合組（成功完成10只即截止）使用減張力半針吻合法分別對肝上下腔靜脈進行吻合（圖1），供肝來自未接受任何處理的健康大鼠（各組均對應10只供體大鼠，供肝灌注采用腹主動脈微量泵灌注法）。其中連續吻合法按文獻[9]提供的吻合步驟進行吻合。減張力半針縫合法：供肝肝上下腔靜脈左右兩端使用8-0 Prolene顯微縫合線與受體肝上下腔靜脈進行固定后，尾線部分的牽引線使用血管夾進行牽拉，隨后進行血管壁的吻合。在吻合肝上下腔靜脈時，左手用鑷子向頭側輕牽拉供肝后壁角端，即為減張力；右手持針先穿過供肝后壁并牽拉吻合線，即針穿過供體或受體的一側壁為半針。再使用鑷子向腹側輕拉受體后壁，右手持針穿過受體后壁后牽拉吻合線，使得供體后壁與受體后壁吻合緊密。按照此法，依次吻合后續血管壁。后壁的吻合先從右到左，吻合到最左端時，不與左端的牽引線打結，繼續從左到右吻合到供受體前壁的角端、與右端牽引線打結。
圖1
示連續吻合法和減張力半針吻合法術中操作及其示意圖
a：連續吻合法；b：減張力半針吻合法，帶針先穿過供體的一側血管壁；c：減張力半針吻合法，帶針再穿過受體的一側血管壁；d：連續吻合法示意圖；e：減張力半針吻合法示意圖
1.6 檢測指標
1.6.1 供肝灌注時間和供肝獲取時間
收集輸液器滴灌組和微量泵灌注組大鼠的供肝灌注時間和供肝獲取時間。每只大鼠供肝灌注時間開始計時和結束計時的標志是相同的。開始計時的標志是第1滴灌注液流入肝臟，結束的標志是肝臟變為土黃色后，自數3 s，撤離灌注針。
1.6.2 組織病理學特點
分別取輸液器滴灌組和微量泵灌注組大鼠灌注后的供肝、供肝移植24 h后的肝臟組織1 g，經4%多聚甲醛固定，進行包埋，使用病理切片機將肝臟蠟塊切為4 μm厚的組織于載玻片上，經過二甲苯、乙醇梯度脫水后，根據HE染色試劑盒使用說明書分別對其進行染色，分析供肝組織的病理學特點。
1.6.3 肝上下腔靜脈吻合時間、無肝期時間和術后發生并發癥
收集連續吻合組和減張力半針吻合組大鼠的肝上下腔靜脈吻合時間、無肝期時間和術后并發癥發生情況。
1.7 統計學方法
實驗數據使用 SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。各組間差異分析采用成組設計的t檢驗和Fisher確切概率法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 2種不同灌注方法供體大鼠的供肝灌注時間和供肝獲取時間比較
輸液器滴灌組大鼠存活3只，其中有1只僅存活4 d，其余2只分別存活7 d和10 d；微量泵灌注組大鼠存活9只，9只全部存活超過2周。由于是統計供肝灌注和獲取的時間，只需要用計時器統計時間即可，因此，10只大鼠全部統計了2項指標。與輸液器滴灌組比較，微量泵灌注組的供肝灌注時間和供肝獲取時間均較短，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。
表1
2種不同灌注方法供體組大鼠的供肝灌注時間和供肝獲取時間比較（
，min）
2.2 2種不同灌注方法供體大鼠供肝的病理學特點
通過觀察供肝灌注后與移植24 h后肝臟病理組織切片的HE染色，結果表明，與微量泵灌注組相比，輸液器滴灌組的供肝在灌注后肝細胞呈現大片狀壞死，而在等待移植的時間中，肝臟多位置會表現出白斑；移植后24 h出現炎癥細胞大面積浸潤、膽管上皮細胞水腫（圖2）。
圖2
示輸液器滴灌組與微量泵灌注組大鼠肝臟的組織病理學結果（HE ×20）
a：輸液器滴灌組灌注后肝臟組織的中央靜脈周圍大量炎癥細胞浸潤，部分肝細胞出現大片狀壞死；b：微量泵灌注組灌注后的肝臟組織的中央靜脈部分出現點狀壞死，少量炎癥細胞浸潤；c：輸液器滴灌組移植24 h后肝臟組織中炎癥細胞大量浸潤，膽道上皮細胞水腫；d：微量泵灌注組移植24 h后肝臟組織中有少量炎癥細胞，中央靜脈接近完好，并未觀察到膽道上皮細胞水腫等變化
2.3 2種不同吻合方法受體大鼠的肝上下腔靜脈吻合時間和無肝期時間比較
與連續吻合組比較，減張力半針吻合組大鼠的肝上下腔靜脈吻合時間和無肝期時間較短，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。
表2
2種不同吻合方法受體大鼠的肝上下腔靜脈吻合時間和無肝期時間比較（
，min）
2.4 2種不同吻合方法受體大鼠的術后并發癥比較
與連續吻合組比較，減張力半針吻合組大鼠術后吻合口出血和供肝灌注不全發生率較低（P＜0.05）；減張力半針吻合組的大鼠存活數量多于連續吻合組，見表3。
表3
2種不同吻合方法受體大鼠的術后并發癥比較（只）
3 討論
大鼠肝移植模型為肝移植在臨床上的進展提供了研究基礎。1973年，大鼠肝移植模型由Lee等[10]率先報道。由于該模型操作過程時間長且復雜，較難推廣，之后不斷有報道對大鼠肝移植模型進行改進。1975年，Lee等[11]對大鼠肝移植模型進行了簡化，省略了門靜脈分流和肝臟動脈化步驟，但仍未解決難題。1983年，Kamada等[8]提出了“二袖套法”，即肝下下腔靜脈與門靜脈采用套管形式重建，“二袖套法”的應用使得操作步驟更加簡化，同時縮短無肝期時間，提高了大鼠存活率，因此這一模型成為現在應用最為廣泛的大鼠肝移植模型。筆者在經過前期的摸索與訓練后，認為此模型的難點在于肝上下腔靜脈的吻合與穩定的套管過程。基于“二袖套法”建立大鼠肝移植模型，并結合其他學者對大鼠肝移植模型提出的改進方法[12-16]，本研究聚焦于不同速度對供肝灌注后質量的影響，以及不同吻合方式對肝上下腔靜脈吻合口出血的影響，為大鼠肝移植模型的建立提供一定的參考。
供肝灌注的方式有經腹主動脈、經門靜脈、經升主動脈或者腹主動脈與門靜脈同時灌注，已有學者[17]比較了不同灌注方式對供肝的影響，而對于灌注速度和壓力其他學者并沒有作過多要求，認為獲得優質供肝在于是否可以均勻地灌注。本研究就灌注速度進行了進一步的比較。以1滴/s的速度對供肝進行20 mL灌注液的灌注時，平均時間長達6 min，肝臟熱缺血時間延長；且將供肝置于4 ℃生理鹽水中、等待移植時，觀察到供肝表面出現白斑，在開放門靜脈結束無肝期時，肝臟呈現不均一復流，顏色呈暗紅色，需要較長時間才能恢復色澤與復流面積。而在以6 mL/min的速度對供肝進行灌注后，獲取的供肝與滴灌法獲取的供肝相比，在相同等待移植時間的過程中，并沒有出現白斑，復流時，觀察到肝臟迅速恢復血供且顏色鮮紅。取不同速度灌注后與移植24 h后的肝臟組織做病理學檢查，結果顯示1滴/s灌注后的肝臟發生肝細胞水腫、大片狀壞死、并有大量炎癥細胞的浸潤；而6 mL/min速度灌注后的肝臟則只出現點狀壞死，并無其他明顯炎癥現象，提示灌注時間過長容易對肝臟的質量造成影響，無法獲得優質供肝。與腹主動脈輸液器滴灌法相比，微量泵灌注法的時間縮短將近1倍；對比供肝獲取時間，微量泵灌注法獲取供肝的時間比腹主動脈輸液器滴灌法縮短約3 min；考慮到供肝越早植入效果越好，因此，縮短的3 min將降低供肝在體外破壞的程度。通過組織病理學檢查也證明了微量泵灌注法要優于腹主動脈輸液器滴灌法。
肝上下腔靜脈的吻合是大鼠肝移植模型成功建立的一個關鍵。大鼠體積小、視野暴露不良、血管脆弱導致術者在吻合時較為困難。有研究[18]報道，大鼠肝移植術后24 h腹腔滲血多是由于肝上下腔靜脈的出血造成的。本研究在先前學者研究的基礎上，提出減張力半針吻合法，認為在吻合肝上下腔靜脈時，半針吻合較為妥當。半針吻合是指用顯微鑷先牽拉一側血管壁，持針穿過這一側壁后拉緊即為半針，隨后再去牽拉對應位置的另一血管壁，持針穿過后再拉緊。減張力意在顯微鑷牽拉血管壁，方便吻合針穿過血管壁，并非增加吻合張力。如此吻合，不會造成滲血或者漏針致術后發生出血等情況，同時也利于提高大鼠存活率。本研究結果表明，與連續吻合組相比，減張力半針吻合組的吻合時間縮短，且減張力半針吻合組的無肝期時間比連續吻合組縮短約2 min，吻合時間的縮短也縮短了大鼠處于無肝期的時間。研究[19]報道，大鼠無肝期需控制在 26 min之內，否則無法存活。因此，盡量縮短無肝期也是提高大鼠存活率的重要因素。對于大鼠術后并發癥的發生率和存活率，筆者認為實驗中存在一些不可控因素，比如大鼠的體質量、環境的無菌程度等，這些或多或少都會影響到大鼠術后的存活情況。因此，考慮血栓等并發癥在2種方法下沒有差別，可能與上述不可控因素有關。
總之，大鼠肝移植模型是一項手術操作難度極高的實驗技術，不僅需要大量的練習，還需要在每一次操作過程中不斷總結經驗。對于大鼠肝移植存活率的提高，顯微操作技術的掌握是一方面，極大的耐心和細心也是重要的一個因素。本研究的目的都是聚焦于操作過程中的細節，旨在為大鼠肝移植存活率的提高提供參考。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：趙姣姣，負責實驗操作、數據整理和論文撰寫；李立，研究指導；張升寧，實驗設計和研究指導；莽源祎，研究指導；高楊，實驗操作和數據整理。
倫理聲明：本研究已通過昆明醫科大學動物實驗倫理審查委員會的審批（批文編號：kmmu20211208）。
大鼠原位肝移植模型是一個復雜的實驗動物模型，適用于研究肝臟再生[1-3]、小肝綜合征[4]、肝臟的排斥及耐受[5]、肝臟缺血再灌注損傷[6-7]等問題。Kamada等[8]提出的“二袖套法”是目前各學者對大鼠肝移植模型研究的基礎，由于該方法手術操作復雜、難度大，成功建立該模型是研究肝臟出現病理狀態并研究其機制的重點，而供肝質量的保證及肝上下腔靜脈的吻合是模型建立的關鍵。本研究旨在通過對大鼠供肝不同灌注方式與受體不同吻合方法的分析，為大鼠肝移植模型的成功建立提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
9～11周齡的雄性SD大鼠80只，為無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級別動物，體質量為230~270 g，供受體體質量相差10~15 g，受體略輕于供體。大鼠購于昆明醫科大學實驗動物學部 ［生產許可證號：SCXK（滇）K2020-0004］，所有實驗動物均在昆明醫科大學動物學部SPF級動物房飼養 ［實驗動物使用許可證號為SYXK（滇）K2020-0006］ 且實驗通過昆明醫科大學動物學部倫理審批（批文編號：kmmu20211208）。
1.2 實驗器械及試劑
實驗器械及試劑包括手術器械（剪刀、血管鉗、顯微器械、輸液器等購于蘇州市朗米尼康醫療器械有限公司）、8-0 Prolene顯微縫合線（寧波醫用縫針有限公司）、微量泵（MedRena公司）、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶技術有限公司）。
1.3 實驗藥品
實驗藥品包括肝素鈉（批號152012087A）、乙醚（批號20181001）、0.9%生理鹽水（批號T22071101）、阿托品（批號2011062）、乳酸鈉林格液（批號B21010409）、五水唑林鈉液（批號2007268）、地塞米松（批號2103214）等。
1.4 建立動物模型
術前準備包括阿托品配置、肝素鈉配置、灌注液配置和受體術前注射液配置。阿托品配置濃度為0.5 mg/L。肝素鈉配置：500 mL 0.9%生理鹽水與2支肝素（25 000 U/支，2 mL/支）。灌注液配置：500 mL乳酸鈉林格液與2支肝素（12 500 U/支，2 mL/支）、1支地塞米松（5 mg/mL）。受體術前注射液共1 mL，包括：0.1 mL阿托品（0.5 mg/L）、0.7 mL五水唑林鈉（1 mg/L）和0.2 mL生理鹽水。手術前禁食8 h，未禁水，供受體大鼠均采用乙醚進行麻醉。
1.5 實驗分組與方法
按照Kamada等[8]提出的“二袖套法”建立大鼠原位肝移植模型。采用隨機數字表法將大鼠隨機分為供體組和受體肝移植組。供體組為供肝獲取組：輸液器滴灌組使用腹主動脈輸液器滴灌法（n=10），滴灌法的速度為1滴/s（0.05 mL/s）；微量泵灌注組使用腹主動脈微量泵灌注法，微量泵灌注的速度為6 mL/min（n=10）；分別對供肝進行灌注，之后分別進行肝移植（各組均對應10只受體大鼠，吻合方法為減張力半針吻合法）。另一組為受體肝移植組：連續吻合組（成功完成10只即截止）使用連續吻合法，減張力半針吻合組（成功完成10只即截止）使用減張力半針吻合法分別對肝上下腔靜脈進行吻合（圖1），供肝來自未接受任何處理的健康大鼠（各組均對應10只供體大鼠，供肝灌注采用腹主動脈微量泵灌注法）。其中連續吻合法按文獻[9]提供的吻合步驟進行吻合。減張力半針縫合法：供肝肝上下腔靜脈左右兩端使用8-0 Prolene顯微縫合線與受體肝上下腔靜脈進行固定后，尾線部分的牽引線使用血管夾進行牽拉，隨后進行血管壁的吻合。在吻合肝上下腔靜脈時，左手用鑷子向頭側輕牽拉供肝后壁角端，即為減張力；右手持針先穿過供肝后壁并牽拉吻合線，即針穿過供體或受體的一側壁為半針。再使用鑷子向腹側輕拉受體后壁，右手持針穿過受體后壁后牽拉吻合線，使得供體后壁與受體后壁吻合緊密。按照此法，依次吻合后續血管壁。后壁的吻合先從右到左，吻合到最左端時，不與左端的牽引線打結，繼續從左到右吻合到供受體前壁的角端、與右端牽引線打結。
圖1
示連續吻合法和減張力半針吻合法術中操作及其示意圖
a：連續吻合法；b：減張力半針吻合法，帶針先穿過供體的一側血管壁；c：減張力半針吻合法，帶針再穿過受體的一側血管壁；d：連續吻合法示意圖；e：減張力半針吻合法示意圖
1.6 檢測指標
1.6.1 供肝灌注時間和供肝獲取時間
收集輸液器滴灌組和微量泵灌注組大鼠的供肝灌注時間和供肝獲取時間。每只大鼠供肝灌注時間開始計時和結束計時的標志是相同的。開始計時的標志是第1滴灌注液流入肝臟，結束的標志是肝臟變為土黃色后，自數3 s，撤離灌注針。
1.6.2 組織病理學特點
分別取輸液器滴灌組和微量泵灌注組大鼠灌注后的供肝、供肝移植24 h后的肝臟組織1 g，經4%多聚甲醛固定，進行包埋，使用病理切片機將肝臟蠟塊切為4 μm厚的組織于載玻片上，經過二甲苯、乙醇梯度脫水后，根據HE染色試劑盒使用說明書分別對其進行染色，分析供肝組織的病理學特點。
1.6.3 肝上下腔靜脈吻合時間、無肝期時間和術后發生并發癥
收集連續吻合組和減張力半針吻合組大鼠的肝上下腔靜脈吻合時間、無肝期時間和術后并發癥發生情況。
1.7 統計學方法
實驗數據使用 SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。各組間差異分析采用成組設計的t檢驗和Fisher確切概率法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 2種不同灌注方法供體大鼠的供肝灌注時間和供肝獲取時間比較
輸液器滴灌組大鼠存活3只，其中有1只僅存活4 d，其余2只分別存活7 d和10 d；微量泵灌注組大鼠存活9只，9只全部存活超過2周。由于是統計供肝灌注和獲取的時間，只需要用計時器統計時間即可，因此，10只大鼠全部統計了2項指標。與輸液器滴灌組比較，微量泵灌注組的供肝灌注時間和供肝獲取時間均較短，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。
表1
2種不同灌注方法供體組大鼠的供肝灌注時間和供肝獲取時間比較（，min）
2.2 2種不同灌注方法供體大鼠供肝的病理學特點
通過觀察供肝灌注后與移植24 h后肝臟病理組織切片的HE染色，結果表明，與微量泵灌注組相比，輸液器滴灌組的供肝在灌注后肝細胞呈現大片狀壞死，而在等待移植的時間中，肝臟多位置會表現出白斑；移植后24 h出現炎癥細胞大面積浸潤、膽管上皮細胞水腫（圖2）。
圖2
示輸液器滴灌組與微量泵灌注組大鼠肝臟的組織病理學結果（HE ×20）
a：輸液器滴灌組灌注后肝臟組織的中央靜脈周圍大量炎癥細胞浸潤，部分肝細胞出現大片狀壞死；b：微量泵灌注組灌注后的肝臟組織的中央靜脈部分出現點狀壞死，少量炎癥細胞浸潤；c：輸液器滴灌組移植24 h后肝臟組織中炎癥細胞大量浸潤，膽道上皮細胞水腫；d：微量泵灌注組移植24 h后肝臟組織中有少量炎癥細胞，中央靜脈接近完好，并未觀察到膽道上皮細胞水腫等變化
2.3 2種不同吻合方法受體大鼠的肝上下腔靜脈吻合時間和無肝期時間比較
與連續吻合組比較，減張力半針吻合組大鼠的肝上下腔靜脈吻合時間和無肝期時間較短，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。
表2
2種不同吻合方法受體大鼠的肝上下腔靜脈吻合時間和無肝期時間比較（，min）
2.4 2種不同吻合方法受體大鼠的術后并發癥比較
與連續吻合組比較，減張力半針吻合組大鼠術后吻合口出血和供肝灌注不全發生率較低（P＜0.05）；減張力半針吻合組的大鼠存活數量多于連續吻合組，見表3。
表3
2種不同吻合方法受體大鼠的術后并發癥比較（只）
3 討論
大鼠肝移植模型為肝移植在臨床上的進展提供了研究基礎。1973年，大鼠肝移植模型由Lee等[10]率先報道。由于該模型操作過程時間長且復雜，較難推廣，之后不斷有報道對大鼠肝移植模型進行改進。1975年，Lee等[11]對大鼠肝移植模型進行了簡化，省略了門靜脈分流和肝臟動脈化步驟，但仍未解決難題。1983年，Kamada等[8]提出了“二袖套法”，即肝下下腔靜脈與門靜脈采用套管形式重建，“二袖套法”的應用使得操作步驟更加簡化，同時縮短無肝期時間，提高了大鼠存活率，因此這一模型成為現在應用最為廣泛的大鼠肝移植模型。筆者在經過前期的摸索與訓練后，認為此模型的難點在于肝上下腔靜脈的吻合與穩定的套管過程。基于“二袖套法”建立大鼠肝移植模型，并結合其他學者對大鼠肝移植模型提出的改進方法[12-16]，本研究聚焦于不同速度對供肝灌注后質量的影響，以及不同吻合方式對肝上下腔靜脈吻合口出血的影響，為大鼠肝移植模型的建立提供一定的參考。
供肝灌注的方式有經腹主動脈、經門靜脈、經升主動脈或者腹主動脈與門靜脈同時灌注，已有學者[17]比較了不同灌注方式對供肝的影響，而對于灌注速度和壓力其他學者并沒有作過多要求，認為獲得優質供肝在于是否可以均勻地灌注。本研究就灌注速度進行了進一步的比較。以1滴/s的速度對供肝進行20 mL灌注液的灌注時，平均時間長達6 min，肝臟熱缺血時間延長；且將供肝置于4 ℃生理鹽水中、等待移植時，觀察到供肝表面出現白斑，在開放門靜脈結束無肝期時，肝臟呈現不均一復流，顏色呈暗紅色，需要較長時間才能恢復色澤與復流面積。而在以6 mL/min的速度對供肝進行灌注后，獲取的供肝與滴灌法獲取的供肝相比，在相同等待移植時間的過程中，并沒有出現白斑，復流時，觀察到肝臟迅速恢復血供且顏色鮮紅。取不同速度灌注后與移植24 h后的肝臟組織做病理學檢查，結果顯示1滴/s灌注后的肝臟發生肝細胞水腫、大片狀壞死、并有大量炎癥細胞的浸潤；而6 mL/min速度灌注后的肝臟則只出現點狀壞死，并無其他明顯炎癥現象，提示灌注時間過長容易對肝臟的質量造成影響，無法獲得優質供肝。與腹主動脈輸液器滴灌法相比，微量泵灌注法的時間縮短將近1倍；對比供肝獲取時間，微量泵灌注法獲取供肝的時間比腹主動脈輸液器滴灌法縮短約3 min；考慮到供肝越早植入效果越好，因此，縮短的3 min將降低供肝在體外破壞的程度。通過組織病理學檢查也證明了微量泵灌注法要優于腹主動脈輸液器滴灌法。
肝上下腔靜脈的吻合是大鼠肝移植模型成功建立的一個關鍵。大鼠體積小、視野暴露不良、血管脆弱導致術者在吻合時較為困難。有研究[18]報道，大鼠肝移植術后24 h腹腔滲血多是由于肝上下腔靜脈的出血造成的。本研究在先前學者研究的基礎上，提出減張力半針吻合法，認為在吻合肝上下腔靜脈時，半針吻合較為妥當。半針吻合是指用顯微鑷先牽拉一側血管壁，持針穿過這一側壁后拉緊即為半針，隨后再去牽拉對應位置的另一血管壁，持針穿過后再拉緊。減張力意在顯微鑷牽拉血管壁，方便吻合針穿過血管壁，并非增加吻合張力。如此吻合，不會造成滲血或者漏針致術后發生出血等情況，同時也利于提高大鼠存活率。本研究結果表明，與連續吻合組相比，減張力半針吻合組的吻合時間縮短，且減張力半針吻合組的無肝期時間比連續吻合組縮短約2 min，吻合時間的縮短也縮短了大鼠處于無肝期的時間。研究[19]報道，大鼠無肝期需控制在 26 min之內，否則無法存活。因此，盡量縮短無肝期也是提高大鼠存活率的重要因素。對于大鼠術后并發癥的發生率和存活率，筆者認為實驗中存在一些不可控因素，比如大鼠的體質量、環境的無菌程度等，這些或多或少都會影響到大鼠術后的存活情況。因此，考慮血栓等并發癥在2種方法下沒有差別，可能與上述不可控因素有關。
總之，大鼠肝移植模型是一項手術操作難度極高的實驗技術，不僅需要大量的練習，還需要在每一次操作過程中不斷總結經驗。對于大鼠肝移植存活率的提高，顯微操作技術的掌握是一方面，極大的耐心和細心也是重要的一個因素。本研究的目的都是聚焦于操作過程中的細節，旨在為大鼠肝移植存活率的提高提供參考。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：趙姣姣，負責實驗操作、數據整理和論文撰寫；李立，研究指導；張升寧，實驗設計和研究指導；莽源祎，研究指導；高楊，實驗操作和數據整理。
倫理聲明：本研究已通過昆明醫科大學動物實驗倫理審查委員會的審批（批文編號：kmmu20211208）。
