持續性病毒感染、代謝異常、免疫紊亂、慢性中毒等導致全球每年有110多萬人死于終末期肝硬化，其中半數以上發生在中國^[1]。肝硬化還是原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）的獨立危險因素，約80% 的 PLC患者有不同程度的肝硬化^[2]。抑制甚至逆轉肝纖維化和硬化一直是肝病研究領域的熱點，迄今仍未取得顯著進展，肝移植幾乎是唯一有效的治療手段。抗纖維化治療主要包括去除病因、抑制細胞外基質（extracellular matrix，ECM）產生細胞 ［主要是肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）、肌纖維母細胞（myofibroblast，MFB）］ 的活化以及促進ECM的降解。針對病因的治療（例如抗病毒或戒酒）能在一定程度上減輕肝組織的炎癥和纖維化，但也并不能完全終止纖維化的進程^[3]。尼達尼布（Nintedanib）等廣譜受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）抑制劑可有效抑制炎性細胞和肺纖維母細胞相關細胞因子的分泌、通路的活化以及ECM分泌，對某些原因引起的肺纖維化具有良好的治療作用。然而，這類藥物只能延緩纖維化的進程，無法促進ECM的降解來逆轉纖維化^[4]。纖維化時不僅僅是ECM量的堆積，ECM中的100余種成分還不斷地進行著交聯反應（cross-link），交聯后的ECM很難被降解，抗交聯酶如賴氨酰氧化酶樣2（lysyl oxidase-like 2）單克隆抗體的臨床前試驗顯示出一定的應用前景，但當交聯已充分發展，纖維化將進入不可逆階段（point of no return）^[5-6]。事實上，臨床絕大部分患者就已經進入了這一階段，在藥物治療沒有明顯突破的情況下，包括間充質干細胞及其衍生品在內的生物治療手段被寄予厚望，但效果仍廣受爭議^[7-8]。

越來越多的研究表明，巨噬細胞在肝纖維化逆轉中有著至關重要的作用，巨噬細胞治療是目前研究最廣泛且被多數研究者認為具有發展前景的逆轉肝纖維化的方式。肝臟中的巨噬細胞有兩大來源，在穩定狀態下，卵黃囊來源的肝臟中常駐的Kupffer細胞構成了肝臟巨噬細胞的主要部分。在肝臟遭受損傷時，循環單核細胞向肝臟募集并分化成熟，是肝臟巨噬細胞的主要來源^[9]。肝臟巨噬細胞在肝纖維化過程中發揮雙重作用^[10]。纖維化早期，巨噬細胞通過分泌轉化生長因子-β（transforming growth factor- β，TGF-β）等生長因子，起促纖維化作用，還能通過分泌多種趨化因募集更多的炎癥細胞，加重組織損傷和纖維化，在這個階段抑制巨噬細胞活化能減輕纖維化程度。巨噬細胞在ECM降解中同樣發揮重要作用。在小鼠實驗中發現，外周血中進入肝臟的單核-巨噬細胞發生表型轉換，淋巴細胞抗原6復合物（lymphocyte antigen 6 complex，Ly-6C）高表達細胞（記為Ly-6C^hi）轉化為Ly-6C低表達細胞（記為Ly-6C^lo），后者高水平表達基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMP）9、13等纖維降解蛋白，顯著促ECM降解，也被稱為促修復性巨噬細胞（restorative macrophages）。在此時清除巨噬細胞將顯著抑制ECM的降解。Ly-6C^hi與Ly-6C^lo細胞與M1型和M2型巨噬細胞并非一一對應，更可能是介于二者之間的一種表型^[11]。

人體中沒有與小鼠Ly-6C對應的抗原，通常認為循環中的Ly-6C^lo細胞與人CD14⁺CD16⁺細胞最為吻合^{[3, 12]}。但人CD14⁺CD16⁺細胞在肝臟具有促炎活性，跟小鼠Ly-6C^lo細胞的作用相反。但同時，人CD14⁺CD16⁺細胞又表現出吞噬活性，能降解并清除ECM，這又與小鼠Ly-6C^lo細胞一致。無論如何，人體內肯定存在一群能逆轉纖維化的巨噬細胞，越來越多的證據表明這群細胞來自于骨髓單核細胞并且已完全分化成熟。近年，Moroni等^[13]分離肝硬化患者外周血單核細胞，在體外經巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor， M-CSF）誘導培養1周，磁珠分選CD45⁺CD14⁺25F9^hi細胞（10^7-9個）后經外周輸入患者體內，隨訪1年后，9例患者中有6例終末期肝病評估（model for end-stage liver disease，MELD）評分下降，反映肝纖維化的指標 ［瞬時彈性超聲、血清增強型肝纖維化（enhanced liver fibrosis，ELF）評分、膠原降解標志物Ⅲ型膠原前肽（N-terminal propeptide of type Ⅲ collagen，Pro-C3）、Ⅲ 型膠原蛋白降解產物（C3M）等］ 均有所下降，目前該研究已進入Ⅱ期臨床試驗。輸入未經誘導的外周血單核細胞則缺乏降解 ECM 的能。同樣，骨髓中的細胞（CD133⁺CD34⁺）經 G-CSF 刺激后，移植入患者體內也未見有改善纖維化的作用，其 Ⅱ期臨床試驗宣告失敗^[14]。

Moroni 等的研究成果為將自體外周血單核細胞用于抗肝纖維化治療展示了樂觀的應用前景。然而，由于輸細胞數量不足、非肝臟定點輸入或是不只一種細胞或細胞亞群參與了 ECM 的降解，其纖維的降解程度仍差強人意，也缺乏病理學證據。那么是否有促進單核細胞在肝臟募集并驅動其向促修復性巨噬細胞亞型分化的方法呢？近年的幾項研究也許能給我們帶來提示。通常認為，由于假小葉周邊纖維屏障的存在，肝細胞的擴增會受到限制，但在 CCl4小鼠肝硬化模型中，實施部分肝切除術（partial hepatectomy，PH）以誘導肝再生，再生結束后纖維組織被顯著降解，假小葉結構明顯消失。在PH后早期，我們通過單細胞測序的確鑒定出多個高水平表達不同MMPs的巨噬細胞亞群。臨床上，肝硬化背景的肝癌患者在接受手術切除后，殘肝能在短期內迅速增大，這種增大不可能單純依靠肝細胞的代償肥大，還有數量的顯著增加。在接受聯合肝臟分割和門靜脈結扎的分階段肝切除術（associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy，ALPPS）治療的患者，對比兩次手術中獲取的肝組織，我們同樣驚訝地發現僅僅半個月的時間間隔，肝組織中的纖維組織已被明顯吸收，炎癥反應也顯著改善。我們推測在PH后，生長因子和趨化因子被大量釋放，外周血單核細胞迅速向肝臟募集并分化成熟，在肝再生中發揮重要作用，其中就包括降解ECM。

不少基礎研究和臨床發現都證實肝纖維化甚至肝硬化是可逆的，是有可能人為實現的。骨髓來源的促修復性巨噬細胞在肝臟的大量募集并分泌MMPs等降解ECM，可能是逆轉肝纖維化的重要機制。先前所述的用于纖維化治療的CD14⁺25F9⁺細胞只是成熟巨噬細胞的一個亞群，其他細胞亞群是否有相似功能還有待揭示。我們也許可以通過PH等外科手段實現恢復性巨噬細胞向肝臟的募集與分化，也可通過介入手段將細胞輸入到肝臟局部，成倍地提高其在肝臟的富集。可以想象，未來通過譜系示蹤、單細胞測序以及新興的時空轉錄組測序等技術，鑒定促修復性巨噬細胞的亞群組成、明確其分化路徑和調控機制，在此基礎上實現體外的大量定向誘導擴增，將有望為肝硬化治療帶來新的希望。

重要聲明

利益沖突聲明：本研究中的全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。

作者貢獻聲明：舒于珂和彭偉整理資料與論文初稿撰寫；石毓君指導選題與論文修改；文天夫給予意見和指導。

持續性病毒感染、代謝異常、免疫紊亂、慢性中毒等導致全球每年有110多萬人死于終末期肝硬化，其中半數以上發生在中國^[1]。肝硬化還是原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）的獨立危險因素，約80% 的 PLC患者有不同程度的肝硬化^[2]。抑制甚至逆轉肝纖維化和硬化一直是肝病研究領域的熱點，迄今仍未取得顯著進展，肝移植幾乎是唯一有效的治療手段。抗纖維化治療主要包括去除病因、抑制細胞外基質（extracellular matrix，ECM）產生細胞 ［主要是肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）、肌纖維母細胞（myofibroblast，MFB）］ 的活化以及促進ECM的降解。針對病因的治療（例如抗病毒或戒酒）能在一定程度上減輕肝組織的炎癥和纖維化，但也并不能完全終止纖維化的進程^[3]。尼達尼布（Nintedanib）等廣譜受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）抑制劑可有效抑制炎性細胞和肺纖維母細胞相關細胞因子的分泌、通路的活化以及ECM分泌，對某些原因引起的肺纖維化具有良好的治療作用。然而，這類藥物只能延緩纖維化的進程，無法促進ECM的降解來逆轉纖維化^[4]。纖維化時不僅僅是ECM量的堆積，ECM中的100余種成分還不斷地進行著交聯反應（cross-link），交聯后的ECM很難被降解，抗交聯酶如賴氨酰氧化酶樣2（lysyl oxidase-like 2）單克隆抗體的臨床前試驗顯示出一定的應用前景，但當交聯已充分發展，纖維化將進入不可逆階段（point of no return）^[5-6]。事實上，臨床絕大部分患者就已經進入了這一階段，在藥物治療沒有明顯突破的情況下，包括間充質干細胞及其衍生品在內的生物治療手段被寄予厚望，但效果仍廣受爭議^[7-8]。

越來越多的研究表明，巨噬細胞在肝纖維化逆轉中有著至關重要的作用，巨噬細胞治療是目前研究最廣泛且被多數研究者認為具有發展前景的逆轉肝纖維化的方式。肝臟中的巨噬細胞有兩大來源，在穩定狀態下，卵黃囊來源的肝臟中常駐的Kupffer細胞構成了肝臟巨噬細胞的主要部分。在肝臟遭受損傷時，循環單核細胞向肝臟募集并分化成熟，是肝臟巨噬細胞的主要來源^[9]。肝臟巨噬細胞在肝纖維化過程中發揮雙重作用^[10]。纖維化早期，巨噬細胞通過分泌轉化生長因子-β（transforming growth factor- β，TGF-β）等生長因子，起促纖維化作用，還能通過分泌多種趨化因募集更多的炎癥細胞，加重組織損傷和纖維化，在這個階段抑制巨噬細胞活化能減輕纖維化程度。巨噬細胞在ECM降解中同樣發揮重要作用。在小鼠實驗中發現，外周血中進入肝臟的單核-巨噬細胞發生表型轉換，淋巴細胞抗原6復合物（lymphocyte antigen 6 complex，Ly-6C）高表達細胞（記為Ly-6C^hi）轉化為Ly-6C低表達細胞（記為Ly-6C^lo），后者高水平表達基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMP）9、13等纖維降解蛋白，顯著促ECM降解，也被稱為促修復性巨噬細胞（restorative macrophages）。在此時清除巨噬細胞將顯著抑制ECM的降解。Ly-6C^hi與Ly-6C^lo細胞與M1型和M2型巨噬細胞并非一一對應，更可能是介于二者之間的一種表型^[11]。

人體中沒有與小鼠Ly-6C對應的抗原，通常認為循環中的Ly-6C^lo細胞與人CD14⁺CD16⁺細胞最為吻合^{[3, 12]}。但人CD14⁺CD16⁺細胞在肝臟具有促炎活性，跟小鼠Ly-6C^lo細胞的作用相反。但同時，人CD14⁺CD16⁺細胞又表現出吞噬活性，能降解并清除ECM，這又與小鼠Ly-6C^lo細胞一致。無論如何，人體內肯定存在一群能逆轉纖維化的巨噬細胞，越來越多的證據表明這群細胞來自于骨髓單核細胞并且已完全分化成熟。近年，Moroni等^[13]分離肝硬化患者外周血單核細胞，在體外經巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor， M-CSF）誘導培養1周，磁珠分選CD45⁺CD14⁺25F9^hi細胞（10^7-9個）后經外周輸入患者體內，隨訪1年后，9例患者中有6例終末期肝病評估（model for end-stage liver disease，MELD）評分下降，反映肝纖維化的指標 ［瞬時彈性超聲、血清增強型肝纖維化（enhanced liver fibrosis，ELF）評分、膠原降解標志物Ⅲ型膠原前肽（N-terminal propeptide of type Ⅲ collagen，Pro-C3）、Ⅲ 型膠原蛋白降解產物（C3M）等］ 均有所下降，目前該研究已進入Ⅱ期臨床試驗。輸入未經誘導的外周血單核細胞則缺乏降解 ECM 的能。同樣，骨髓中的細胞（CD133⁺CD34⁺）經 G-CSF 刺激后，移植入患者體內也未見有改善纖維化的作用，其 Ⅱ期臨床試驗宣告失敗^[14]。

Moroni 等的研究成果為將自體外周血單核細胞用于抗肝纖維化治療展示了樂觀的應用前景。然而，由于輸細胞數量不足、非肝臟定點輸入或是不只一種細胞或細胞亞群參與了 ECM 的降解，其纖維的降解程度仍差強人意，也缺乏病理學證據。那么是否有促進單核細胞在肝臟募集并驅動其向促修復性巨噬細胞亞型分化的方法呢？近年的幾項研究也許能給我們帶來提示。通常認為，由于假小葉周邊纖維屏障的存在，肝細胞的擴增會受到限制，但在 CCl4小鼠肝硬化模型中，實施部分肝切除術（partial hepatectomy，PH）以誘導肝再生，再生結束后纖維組織被顯著降解，假小葉結構明顯消失。在PH后早期，我們通過單細胞測序的確鑒定出多個高水平表達不同MMPs的巨噬細胞亞群。臨床上，肝硬化背景的肝癌患者在接受手術切除后，殘肝能在短期內迅速增大，這種增大不可能單純依靠肝細胞的代償肥大，還有數量的顯著增加。在接受聯合肝臟分割和門靜脈結扎的分階段肝切除術（associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy，ALPPS）治療的患者，對比兩次手術中獲取的肝組織，我們同樣驚訝地發現僅僅半個月的時間間隔，肝組織中的纖維組織已被明顯吸收，炎癥反應也顯著改善。我們推測在PH后，生長因子和趨化因子被大量釋放，外周血單核細胞迅速向肝臟募集并分化成熟，在肝再生中發揮重要作用，其中就包括降解ECM。

不少基礎研究和臨床發現都證實肝纖維化甚至肝硬化是可逆的，是有可能人為實現的。骨髓來源的促修復性巨噬細胞在肝臟的大量募集并分泌MMPs等降解ECM，可能是逆轉肝纖維化的重要機制。先前所述的用于纖維化治療的CD14⁺25F9⁺細胞只是成熟巨噬細胞的一個亞群，其他細胞亞群是否有相似功能還有待揭示。我們也許可以通過PH等外科手段實現恢復性巨噬細胞向肝臟的募集與分化，也可通過介入手段將細胞輸入到肝臟局部，成倍地提高其在肝臟的富集。可以想象，未來通過譜系示蹤、單細胞測序以及新興的時空轉錄組測序等技術，鑒定促修復性巨噬細胞的亞群組成、明確其分化路徑和調控機制，在此基礎上實現體外的大量定向誘導擴增，將有望為肝硬化治療帶來新的希望。

重要聲明

利益沖突聲明：本研究中的全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。

作者貢獻聲明：舒于珂和彭偉整理資料與論文初稿撰寫；石毓君指導選題與論文修改；文天夫給予意見和指導。