引用本文： 劉陳美琪, 李海林. miR-584-5p通過下調MMP-14抑制乳腺癌細胞生物學行為. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(3): 302-308. doi: 10.7507/1007-9424.202210002 復制
乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一，也是導致全球癌癥相關死亡的第5大原因[1-2]。近年來，盡管乳腺癌治療取得了巨大進展，但乳腺癌患者的預后依舊很差，轉移仍然是乳腺癌患者死亡的最重要原因[3-4]。因此，更全面地了解進展和轉移的機制對于改善乳腺癌患者的預后具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA） 是內源性小非編碼RNA，其通過與信使RNA（messenger RNA，mRNA）靶標的3′ -非翻譯區相互作用來調節基因表達，導致翻譯抑制或mRNA降解[5]。微小RNA-584-5p（microRNA-584-5p，miR-584-5p）是位于染色體5q32上的小RNA，已有研究[6]報道，miR-584-5p在胃癌組織和細胞中低表達，過表達miR-584-5p可抑制胃癌細胞增殖，同時誘導細胞凋亡。而基質金屬蛋白酶-14（matrix metalloproteinase-14，MMP-14）是一種膜結合蛋白酶，能夠切割細胞外蛋白，已被證明對癌細胞的侵襲和轉移起了關鍵作用[7]。據文獻[8]報道，MMP-14在乳腺癌組織中高表達，其高表達與腫瘤直徑、臨床分期和淋巴結轉移呈正相關關系。但目前關于miR-584-5p及MMP-14對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響鮮有報道。因此，本研究主要探究miR-584-5p與MMP-14的靶向關系，以及它們對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，旨在為乳腺癌的治療提供新的靶點。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞
人正常乳腺上皮細胞MCF10A和乳腺癌細胞MDA-MB-231、SK-BR-3及MCF-7均購自上海莼試生物技術有限公司，批號分別為CK-1913L、CK-1738D、CK-2905D和CK-6307。
1.1.2 藥物與試劑
miR-584-5p模擬物（miR-584-5p mimic）及其陰性對照（mimic-negative control，mimic-NC）、過表達MMP-14的pcDNA3.1質粒（pcDNA3.1-MMP-14）及其陰性對照（pcDNA3.1）、RPMI 1640培養基、反轉錄試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號分別為 MX-37283、MX-23894、MX-20895、MX-12903、MX-28943、MX-90273和MX-25371）均購自上海美軒生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、LipofectamineTM2000轉染試劑盒、Trizol試劑和BCA試劑盒（批號分別為 32878、23948、23903和49032）均購自上海艾躍生物科技有限公司；PCR試劑盒（SYBR Green PCR Master Mix）、FuGENE轉染試劑、LightSwitch啟動子熒光素酶報告基因載體（LightSwitch Prom）、RIPA裂解緩沖液和ECL化學發光試劑盒（批號分別為 HM9024、HF2389、HF3820、HF3293及HF2392）均購自上海恒斐生物科技有限公司；MMP-14、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗、羊抗兔二抗、細胞計數試劑盒-8（CCK-8）和結晶紫染液（批號分別為SJ2323、SJ3244、SJ3423、SJ1325和SJ8014）均購自蘇州華麥生物科技有限公司。
1.1.3 儀器
CO2培養箱（型號BC190）及熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（型號TK-6000）購自北京普天新橋技術有限公司；凝膠成像系統（型號CSL-7100）和酶標儀（型號PT-3502C）購自北京斯沃德儀器設備有限公司；顯微鏡（型號Leica DMIL）購自上海奮業光電儀器設備有限公司；Transwell小室（型號3460）購自上海喬羽生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞分組及轉染
分別將MCF10A、MDA-MB-231、SK-BR-3和MCF-7細胞在補充有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640 培養基中培養，培養條件為37 ℃、5%CO2，每2天換1次培養液，進行常規的傳代培養，傳至第4代后，取對數生長期的細胞用于實驗。各細胞均設置6個重復。 經qRT-PCR實驗檢測各細胞中miR-584-5p表達水平后選擇MCF-7細胞進行后續實驗。 取對數生長期的MCF-7細胞1×105個/mL，應用LipofectamineTM 2000轉染試劑盒對其進行轉染，并分為7組：空白組（未轉染的MCF-7細胞）、mimic-NC組（轉染mimic-NC）、miR-584-5p mimic組（轉染miR-584-5p mimic）、pcDNA組 ［轉染過表達基質金屬蛋白酶-14（MMP-14）的pcDNA3.1質粒陰性對照（pcDNA3.1）］、MMP-14組 ［轉染過表達MMP-14的pcDNA3.1質粒（pcDNA3.1-MMP-14）］、mimic-NC+MMP-14組（共轉染mimic-NC和pcDNA3.1-MMP-14）及miR-584-5p mimic+MMP-14組（共轉染miR-584-5p mimic和pcDNA3.1-MMP-14），培養48 h用于后續實驗。各組均設置6個重復。
1.2.2 qRT-PCR檢測細胞中miR-584-5p 及MMP-14
mRNA表達水平 使用Trizol試劑分離以上MCF10A、MDA-MB-231、SK-BR-3和MCF-7細胞中以及各組MCF-7細胞中的總RNA，檢測其純度和濃度，逆轉錄得到cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix進行實時熒光定量PCR以檢測miR-584-5p及MMP-14 mRNA表達。以U6為內參標準化miR-584-5p表達，以GAPDH為內參標準化MMP-14 mRNA表達，最后通過2–△△Ct方法分析miR-584-5p及MMP-14 mRNA表達水平。引物由南通百奧邁科生物技術有限公司設計合成，所用引物見表1。
表1
qRT-PCR引物序列
1.2.3 蛋白印跡法檢測MCF-7細胞中MMP-14蛋白表達
使用預冷的RIPA裂解緩沖液提取各組MCF-7細胞中的總蛋白，并用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。電泳分離30 μg蛋白質，將分離的蛋白質轉移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，并與一抗MMP-14（1∶1 000）及GAPDH（1∶2 000）在4 ℃下孵育過夜。次日，將膜用TBST漂洗3次，每次15 min，然后加入山羊抗兔二抗（1∶7 000）在室溫下孵育1 h 。再用TBST洗滌膜3次，每次10 min。通過ECL化學發光試劑盒使免疫反應性蛋白質可視化，以GAPDH為內參，利用Image軟件分析蛋白的灰度值。
1.2.4 CCK-8法檢測MCF-7細胞增殖
將各組MCF-7細胞以1×104個/孔的密度接種在96孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下孵育。向每孔中加入10 μL 的CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后，使用酶標儀檢測MCF-7細胞在450 nm處的吸光度值（A值），并計算細胞增殖活力（細胞增殖活力=各轉染組A值/空白組A值×100%）。
1.2.5 劃痕實驗檢測MCF-7細胞遷移
將各組MCF-7細胞接種到6孔板中并孵育至匯合度達到100%。隨后，用無菌的200 μL槍頭尖端垂直水平劃線，通過用PBS洗滌去除漂浮的細胞并在無血清RPMI 1640培養基中孵育以避免細胞增殖。使用倒置顯微鏡在0和24 h時從同一位置觀察并拍照。計算劃痕愈合率（劃痕愈合率=［（1–24 h的劃痕面積/0 h時的劃痕面積）×100%］，劃痕愈合率數值越高表示細胞遷移能力越強。
1.2.6 Transwell實驗檢測MCF-7細胞侵襲
預先將基質膠涂在Transwell上腔室中，待其自然干燥后，將各組MCF-7細胞（5×104個）懸浮在200 μL?無血清RPMI 1640培養基中并接種到Transwell上腔室。將500 μL含有10% FBS的RPMI 1640培養液添加到Transwell下腔室作為化學引誘劑。在37 ℃下孵育24 h后，用棉簽小心擦除小室上表面的未侵襲的細胞，侵襲到下表面的細胞用甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，隨機選擇5個視野利用光學顯微鏡觀察并計數侵襲細胞數目。
1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-584-5p與MMP-14的靶向關系
miR-584-5p與MMP-14啟動子區的結合由miRWalk數據庫和全基因組Argonaute-chromosome交互分析數據（GSE40536）進行。將用miR-584-5p mimic或mimic-NC轉染的MCF-7細胞接種到96孔板（1×103個/孔）中，并在補充有10% FBS的 RPMI 1640培養基中培養24 h。合成MMP-14 3′ UTR 的野生型（wild type，WT）和突變型（mutant type，MUT）基因并插入到LightSwitch Prom載體上，分別命名為WT-MMP-14和MUT-MMP-14 。隨后，利用FuGENE 轉染試劑將WT-MMP-14和MUT-MMP-14分別與miR-584-5p mimic或mimic-NC共轉染于MCF-7細胞，分別記為mimic-NC+WT-MMP-14組、miR-584-5p mimic+WT-MMP-14組、mimic-NC+MUT-MMP-14組和miR-584-5p mimic+MUT-MMP-14組。轉染24 h后，通過LightSwitch熒光素酶系統檢測熒光素酶相對活性。
1.3 統計學方法
使用SPSS 26.0軟件進行統計分析。計量資料經Shapiro-Wilk檢驗均符合正態分布，并采用均數±標準差（
±s）表示，單因素方差分析用于多組間的差異比較，進一步2組間比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 各細胞中miR-584-5p表達水平檢測結果
與人正常乳腺上皮細胞MCF10A比較，乳腺癌細胞MDA-MB-231、SK-BR-3和MCF-7中miR-584-5p表達水平降低（P＜0.05），且MCF-7細胞中miR-584-5p表達水平最低，見表2。因此，選用MCF-7細胞進行后續研究。
表2
各細胞中miR-584-5p表達水平檢測結果（
，n=6）
2.2 各組MCF-7細胞的miR-584-5p和MMP-14 mRNA及其蛋白表達水平檢測結果
與空白組和mimic-NC組比較，miR-584-5p mimic組MCF-7細胞的miR-584-5p表達水平升高，MMP-14 mRNA和蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與空白組及pcDNA組比較，MMP-14組MCF-7細胞的MMP-14 mRNA和蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與MMP-14組及mimic-NC+MMP-14組比較，miR-584-5p mimic+MMP-14組MCF-7細胞的miR-584-5p表達水平升高，MMP-14 mRNA和蛋白表達水平降低（P＜0.05）；miR-584-5p mimic+MMP-14組MCF-7細胞的MMP-14 mRNA和蛋白表達水平高于miR-584-5p mimic組（P＜0.05）。見表3。
表3
各組MCF-7細胞miR-584-5p和MMP-14 mRNA及其蛋白表達水平檢測結果（
，n=6）
2.3 各組MCF-7細胞的增殖、遷移及侵襲能力檢測結果
與空白組和mimic-NC組比較，miR-584-5p mimic組MCF-7細胞的增殖活力、劃痕愈合率和侵襲細胞數降低或減少（P＜0.05）；與空白組及pcDNA組比較，MMP-14組MCF-7細胞的增殖活力、劃痕愈合率和侵襲細胞數增高或增多（P＜0.05）；與MMP-14組和mimic-NC+MMP-14組比較，miR-584-5p mimic+MMP-14組MCF-7細胞的增殖活力、劃痕愈合率及侵襲細胞數降低或減少（P＜0.05）；miR-584-5p mimic+MMP-14組MCF-7細胞的增殖活力、劃痕愈合率及侵襲細胞數高于或多于miR-584-5p mimic組（P＜0.05）。見表4和圖1。
表4
各組MCF-7細胞的增殖、遷移及侵襲能力檢測結果（
，n=6）
圖1
示各組MCF-7細胞的遷移及侵襲請情況
a： MCF-7細胞遷移情況（ ×100）；b：MCF-7細胞侵襲情況（結晶紫染色 ×200）；A：空白組；B：mimic-NC組；C：miR-584-5p mimic組；D：pcDNA組；E：MMP-14組；F：mimic-NC+MMP-14組；G：miR-584-5p mimic+MMP-14組
2.4 miR-584-5p靶向作用于MMP-14啟動子區
miR-584-5p與MMP-14啟動子區存在結合位點，見圖2。 與mimic-NC+WT-MMP-14組比較，miR-584-5p mimic+WT-MMP-14組MCF-7細胞的熒光素酶相對活性降低（P＜0.05）；mimic-NC+WT-MMP-14組、mimic-NC+MUT-MMP-14組和miR-584-5p mimic+MUT-MMP-14組間MCF-7細胞的熒光素酶相對活性比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。
圖2
miR-584-5p與MMP-14啟動子區結合位點示意圖
表5
雙熒光素酶報告基因驗證miR-584-5p與MMP-14的靶向關系（
，n=6）
3 討論
miRNA調節許多細胞過程，如細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、分化等，其異常表達在癌癥的發生和發展中起著至關重要的作用[9-10]。近年來，miR-584-5p被證明是在腫瘤中異常表達的miRNAs之一，與腫瘤細胞的生物學行為密切相關[11-12]。 據報道，miR-584-5p表達上調與鼻咽癌遠處轉移、不良預后密切相關[13]；miR-584-5p在非小細胞肺癌組織中低表達，過表達miR-584-5p可顯著抑制非小細胞肺癌細胞遷移與侵襲[14]；過表達miR-584-5p可抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡[15]；miR-584-5p在吸煙相關非小細胞肺癌中發揮腫瘤抑制作用，可抑制肺癌細胞的遷移和侵襲[16]。但關于miR-584-5p對乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響尚不可知。本研究結果顯示，乳腺癌MDA-MB-231、SK-BR-3和MCF- 7細胞中miR-584-5p表達水平低于人正常乳腺上皮細胞MCF10A，且MCF-7細胞中miR-584-5p表達量最低，因此選用MCF-7細胞進行后續轉染實驗。與空白組及mimic-NC組比較，miR-584-5p mimic組MCF-7細胞中miR-584-5p表達水平升高，提示細胞轉染成功；miR-584-5p mimic組MCF-7細胞增殖活力、劃痕愈合率和侵襲細胞數低于或少于空白組及mimic-NC組，表明過表達miR-584-5p可抑制MCF-7細胞的增殖、遷移與侵襲。以上結果提示miR-584-5p在乳腺癌中發揮著腫瘤抑制作用。
為進一步探究過表達miR-584-5p抑制MCF-7細胞增殖、遷移與侵襲的內部機制，本研究通過生物學預測miR-584-5p可與MMP-14啟動子區結合。據報道，MMP-14可介導細胞外基質降解，這是與不良臨床結果相關的癌細胞侵襲和轉移的關鍵步驟[17-18]；MMP-14水平升高與非小細胞肺癌患者Ⅳ期、發生肺外轉移和患者死亡有關[19]；沉默MMP-14能夠顯著抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖、侵襲和遷移能力[20]；miR-369-3p可通過沉默MMP-14進而抑制乳頭狀甲狀腺癌細胞的侵襲、遷移和上皮間質轉化[21]；MMP-14的高表達狀態與乳腺癌細胞分化、淋巴結轉移和遠處轉移密切相關[22]。以上研究表明MMP-14具有促進腫瘤進展的作用。本研究通過熒光素酶報告基因實驗證實miR-584-5p可靶向作用于MMP-14啟動子區。 過表達miR-584-5p可抑制MMP-14 mRNA及蛋白的表達，過表達MMP-14可促進MCF-7細胞的增殖、遷移與侵襲，推測過表達miR-584-5p對MCF-7細胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用可能與MMP-14有關。 為了驗證該推測，本研究設置了回復實驗，結果發現，與MMP-14組和mimic-NC+MMP-14組比較，miR-584-5p mimic+MMP-14組MCF-7細胞的增殖、遷移及侵襲能力降低，但都仍高于miR-584-5p mimic組，表明過表達miR-584-5p 通過下調MMP-14抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Xiang等[23]報道，miR-584-5p 通過下調MMP-14來抑制神經母細胞瘤細胞的生長、侵襲、轉移；Guo等[24]發現，過表達miR-584-5p通過下調MMP-14表達來抑制非小細胞肺癌的遷移與侵襲。本研究結果與Xiang等[23]和Guo等[24]的研究結果是一致的。 此外，相關研究顯示，沉默miR-584-5p可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase， ERK）通路促進肝癌細胞惡性表型[25]；抑制MAPK/ERK通路可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、侵襲和遷移[26]；激活MAPK/ERK通路可促進乳腺癌腫瘤生長[27]。以上研究表明，MAPK/ERK通路可能參與了乳腺癌的惡性進展。推測miR-584-5p通過靶向MMP-14抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的具體機制可能與調控MAPK/ERK通路有關，但本研究尚未對具體機制進行深入探究，這是本研究的不足之處，后期將會深入探究。
綜上所述，過表達miR-584-5p通過下調MMP-14抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。然而，本研究只是在體外水平上探究了miR-584-5p對乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響以及其作用機制，后續將開展體內實驗進行進一步深入探索。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們相互之間無競爭性利益關系。
作者貢獻聲明：劉陳美琪：設計研究方案、實施研究過程及論文撰寫；李海林：實施研究過程、分析實驗數據。
乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一，也是導致全球癌癥相關死亡的第5大原因[1-2]。近年來，盡管乳腺癌治療取得了巨大進展，但乳腺癌患者的預后依舊很差，轉移仍然是乳腺癌患者死亡的最重要原因[3-4]。因此，更全面地了解進展和轉移的機制對于改善乳腺癌患者的預后具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA） 是內源性小非編碼RNA，其通過與信使RNA（messenger RNA，mRNA）靶標的3′ -非翻譯區相互作用來調節基因表達，導致翻譯抑制或mRNA降解[5]。微小RNA-584-5p（microRNA-584-5p，miR-584-5p）是位于染色體5q32上的小RNA，已有研究[6]報道，miR-584-5p在胃癌組織和細胞中低表達，過表達miR-584-5p可抑制胃癌細胞增殖，同時誘導細胞凋亡。而基質金屬蛋白酶-14（matrix metalloproteinase-14，MMP-14）是一種膜結合蛋白酶，能夠切割細胞外蛋白，已被證明對癌細胞的侵襲和轉移起了關鍵作用[7]。據文獻[8]報道，MMP-14在乳腺癌組織中高表達，其高表達與腫瘤直徑、臨床分期和淋巴結轉移呈正相關關系。但目前關于miR-584-5p及MMP-14對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響鮮有報道。因此，本研究主要探究miR-584-5p與MMP-14的靶向關系，以及它們對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，旨在為乳腺癌的治療提供新的靶點。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞
人正常乳腺上皮細胞MCF10A和乳腺癌細胞MDA-MB-231、SK-BR-3及MCF-7均購自上海莼試生物技術有限公司，批號分別為CK-1913L、CK-1738D、CK-2905D和CK-6307。
1.1.2 藥物與試劑
miR-584-5p模擬物（miR-584-5p mimic）及其陰性對照（mimic-negative control，mimic-NC）、過表達MMP-14的pcDNA3.1質粒（pcDNA3.1-MMP-14）及其陰性對照（pcDNA3.1）、RPMI 1640培養基、反轉錄試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號分別為 MX-37283、MX-23894、MX-20895、MX-12903、MX-28943、MX-90273和MX-25371）均購自上海美軒生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、LipofectamineTM2000轉染試劑盒、Trizol試劑和BCA試劑盒（批號分別為 32878、23948、23903和49032）均購自上海艾躍生物科技有限公司；PCR試劑盒（SYBR Green PCR Master Mix）、FuGENE轉染試劑、LightSwitch啟動子熒光素酶報告基因載體（LightSwitch Prom）、RIPA裂解緩沖液和ECL化學發光試劑盒（批號分別為 HM9024、HF2389、HF3820、HF3293及HF2392）均購自上海恒斐生物科技有限公司；MMP-14、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗、羊抗兔二抗、細胞計數試劑盒-8（CCK-8）和結晶紫染液（批號分別為SJ2323、SJ3244、SJ3423、SJ1325和SJ8014）均購自蘇州華麥生物科技有限公司。
1.1.3 儀器
CO2培養箱（型號BC190）及熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（型號TK-6000）購自北京普天新橋技術有限公司；凝膠成像系統（型號CSL-7100）和酶標儀（型號PT-3502C）購自北京斯沃德儀器設備有限公司；顯微鏡（型號Leica DMIL）購自上海奮業光電儀器設備有限公司；Transwell小室（型號3460）購自上海喬羽生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞分組及轉染
分別將MCF10A、MDA-MB-231、SK-BR-3和MCF-7細胞在補充有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640 培養基中培養，培養條件為37 ℃、5%CO2，每2天換1次培養液，進行常規的傳代培養，傳至第4代后，取對數生長期的細胞用于實驗。各細胞均設置6個重復。 經qRT-PCR實驗檢測各細胞中miR-584-5p表達水平后選擇MCF-7細胞進行后續實驗。 取對數生長期的MCF-7細胞1×105個/mL，應用LipofectamineTM 2000轉染試劑盒對其進行轉染，并分為7組：空白組（未轉染的MCF-7細胞）、mimic-NC組（轉染mimic-NC）、miR-584-5p mimic組（轉染miR-584-5p mimic）、pcDNA組 ［轉染過表達基質金屬蛋白酶-14（MMP-14）的pcDNA3.1質粒陰性對照（pcDNA3.1）］、MMP-14組 ［轉染過表達MMP-14的pcDNA3.1質粒（pcDNA3.1-MMP-14）］、mimic-NC+MMP-14組（共轉染mimic-NC和pcDNA3.1-MMP-14）及miR-584-5p mimic+MMP-14組（共轉染miR-584-5p mimic和pcDNA3.1-MMP-14），培養48 h用于后續實驗。各組均設置6個重復。
1.2.2 qRT-PCR檢測細胞中miR-584-5p 及MMP-14
mRNA表達水平 使用Trizol試劑分離以上MCF10A、MDA-MB-231、SK-BR-3和MCF-7細胞中以及各組MCF-7細胞中的總RNA，檢測其純度和濃度，逆轉錄得到cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix進行實時熒光定量PCR以檢測miR-584-5p及MMP-14 mRNA表達。以U6為內參標準化miR-584-5p表達，以GAPDH為內參標準化MMP-14 mRNA表達，最后通過2–△△Ct方法分析miR-584-5p及MMP-14 mRNA表達水平。引物由南通百奧邁科生物技術有限公司設計合成，所用引物見表1。
表1
qRT-PCR引物序列
1.2.3 蛋白印跡法檢測MCF-7細胞中MMP-14蛋白表達
使用預冷的RIPA裂解緩沖液提取各組MCF-7細胞中的總蛋白，并用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。電泳分離30 μg蛋白質，將分離的蛋白質轉移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，并與一抗MMP-14（1∶1 000）及GAPDH（1∶2 000）在4 ℃下孵育過夜。次日，將膜用TBST漂洗3次，每次15 min，然后加入山羊抗兔二抗（1∶7 000）在室溫下孵育1 h 。再用TBST洗滌膜3次，每次10 min。通過ECL化學發光試劑盒使免疫反應性蛋白質可視化，以GAPDH為內參，利用Image軟件分析蛋白的灰度值。
1.2.4 CCK-8法檢測MCF-7細胞增殖
將各組MCF-7細胞以1×104個/孔的密度接種在96孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下孵育。向每孔中加入10 μL 的CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后，使用酶標儀檢測MCF-7細胞在450 nm處的吸光度值（A值），并計算細胞增殖活力（細胞增殖活力=各轉染組A值/空白組A值×100%）。
1.2.5 劃痕實驗檢測MCF-7細胞遷移
將各組MCF-7細胞接種到6孔板中并孵育至匯合度達到100%。隨后，用無菌的200 μL槍頭尖端垂直水平劃線，通過用PBS洗滌去除漂浮的細胞并在無血清RPMI 1640培養基中孵育以避免細胞增殖。使用倒置顯微鏡在0和24 h時從同一位置觀察并拍照。計算劃痕愈合率（劃痕愈合率=［（1–24 h的劃痕面積/0 h時的劃痕面積）×100%］，劃痕愈合率數值越高表示細胞遷移能力越強。
1.2.6 Transwell實驗檢測MCF-7細胞侵襲
預先將基質膠涂在Transwell上腔室中，待其自然干燥后，將各組MCF-7細胞（5×104個）懸浮在200 μL?無血清RPMI 1640培養基中并接種到Transwell上腔室。將500 μL含有10% FBS的RPMI 1640培養液添加到Transwell下腔室作為化學引誘劑。在37 ℃下孵育24 h后，用棉簽小心擦除小室上表面的未侵襲的細胞，侵襲到下表面的細胞用甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，隨機選擇5個視野利用光學顯微鏡觀察并計數侵襲細胞數目。
1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-584-5p與MMP-14的靶向關系
miR-584-5p與MMP-14啟動子區的結合由miRWalk數據庫和全基因組Argonaute-chromosome交互分析數據（GSE40536）進行。將用miR-584-5p mimic或mimic-NC轉染的MCF-7細胞接種到96孔板（1×103個/孔）中，并在補充有10% FBS的 RPMI 1640培養基中培養24 h。合成MMP-14 3′ UTR 的野生型（wild type，WT）和突變型（mutant type，MUT）基因并插入到LightSwitch Prom載體上，分別命名為WT-MMP-14和MUT-MMP-14 。隨后，利用FuGENE 轉染試劑將WT-MMP-14和MUT-MMP-14分別與miR-584-5p mimic或mimic-NC共轉染于MCF-7細胞，分別記為mimic-NC+WT-MMP-14組、miR-584-5p mimic+WT-MMP-14組、mimic-NC+MUT-MMP-14組和miR-584-5p mimic+MUT-MMP-14組。轉染24 h后，通過LightSwitch熒光素酶系統檢測熒光素酶相對活性。
1.3 統計學方法
使用SPSS 26.0軟件進行統計分析。計量資料經Shapiro-Wilk檢驗均符合正態分布，并采用均數±標準差（±s）表示，單因素方差分析用于多組間的差異比較，進一步2組間比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 各細胞中miR-584-5p表達水平檢測結果
與人正常乳腺上皮細胞MCF10A比較，乳腺癌細胞MDA-MB-231、SK-BR-3和MCF-7中miR-584-5p表達水平降低（P＜0.05），且MCF-7細胞中miR-584-5p表達水平最低，見表2。因此，選用MCF-7細胞進行后續研究。
表2
各細胞中miR-584-5p表達水平檢測結果（，n=6）
2.2 各組MCF-7細胞的miR-584-5p和MMP-14 mRNA及其蛋白表達水平檢測結果
與空白組和mimic-NC組比較，miR-584-5p mimic組MCF-7細胞的miR-584-5p表達水平升高，MMP-14 mRNA和蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與空白組及pcDNA組比較，MMP-14組MCF-7細胞的MMP-14 mRNA和蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與MMP-14組及mimic-NC+MMP-14組比較，miR-584-5p mimic+MMP-14組MCF-7細胞的miR-584-5p表達水平升高，MMP-14 mRNA和蛋白表達水平降低（P＜0.05）；miR-584-5p mimic+MMP-14組MCF-7細胞的MMP-14 mRNA和蛋白表達水平高于miR-584-5p mimic組（P＜0.05）。見表3。
表3
各組MCF-7細胞miR-584-5p和MMP-14 mRNA及其蛋白表達水平檢測結果（，n=6）
2.3 各組MCF-7細胞的增殖、遷移及侵襲能力檢測結果
與空白組和mimic-NC組比較，miR-584-5p mimic組MCF-7細胞的增殖活力、劃痕愈合率和侵襲細胞數降低或減少（P＜0.05）；與空白組及pcDNA組比較，MMP-14組MCF-7細胞的增殖活力、劃痕愈合率和侵襲細胞數增高或增多（P＜0.05）；與MMP-14組和mimic-NC+MMP-14組比較，miR-584-5p mimic+MMP-14組MCF-7細胞的增殖活力、劃痕愈合率及侵襲細胞數降低或減少（P＜0.05）；miR-584-5p mimic+MMP-14組MCF-7細胞的增殖活力、劃痕愈合率及侵襲細胞數高于或多于miR-584-5p mimic組（P＜0.05）。見表4和圖1。
表4
各組MCF-7細胞的增殖、遷移及侵襲能力檢測結果（，n=6）
圖1
示各組MCF-7細胞的遷移及侵襲請情況
a： MCF-7細胞遷移情況（ ×100）；b：MCF-7細胞侵襲情況（結晶紫染色 ×200）；A：空白組；B：mimic-NC組；C：miR-584-5p mimic組；D：pcDNA組；E：MMP-14組；F：mimic-NC+MMP-14組；G：miR-584-5p mimic+MMP-14組
2.4 miR-584-5p靶向作用于MMP-14啟動子區
miR-584-5p與MMP-14啟動子區存在結合位點，見圖2。 與mimic-NC+WT-MMP-14組比較，miR-584-5p mimic+WT-MMP-14組MCF-7細胞的熒光素酶相對活性降低（P＜0.05）；mimic-NC+WT-MMP-14組、mimic-NC+MUT-MMP-14組和miR-584-5p mimic+MUT-MMP-14組間MCF-7細胞的熒光素酶相對活性比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。
圖2
miR-584-5p與MMP-14啟動子區結合位點示意圖
表5
雙熒光素酶報告基因驗證miR-584-5p與MMP-14的靶向關系（，n=6）
3 討論
miRNA調節許多細胞過程，如細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、分化等，其異常表達在癌癥的發生和發展中起著至關重要的作用[9-10]。近年來，miR-584-5p被證明是在腫瘤中異常表達的miRNAs之一，與腫瘤細胞的生物學行為密切相關[11-12]。 據報道，miR-584-5p表達上調與鼻咽癌遠處轉移、不良預后密切相關[13]；miR-584-5p在非小細胞肺癌組織中低表達，過表達miR-584-5p可顯著抑制非小細胞肺癌細胞遷移與侵襲[14]；過表達miR-584-5p可抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡[15]；miR-584-5p在吸煙相關非小細胞肺癌中發揮腫瘤抑制作用，可抑制肺癌細胞的遷移和侵襲[16]。但關于miR-584-5p對乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響尚不可知。本研究結果顯示，乳腺癌MDA-MB-231、SK-BR-3和MCF- 7細胞中miR-584-5p表達水平低于人正常乳腺上皮細胞MCF10A，且MCF-7細胞中miR-584-5p表達量最低，因此選用MCF-7細胞進行后續轉染實驗。與空白組及mimic-NC組比較，miR-584-5p mimic組MCF-7細胞中miR-584-5p表達水平升高，提示細胞轉染成功；miR-584-5p mimic組MCF-7細胞增殖活力、劃痕愈合率和侵襲細胞數低于或少于空白組及mimic-NC組，表明過表達miR-584-5p可抑制MCF-7細胞的增殖、遷移與侵襲。以上結果提示miR-584-5p在乳腺癌中發揮著腫瘤抑制作用。
為進一步探究過表達miR-584-5p抑制MCF-7細胞增殖、遷移與侵襲的內部機制，本研究通過生物學預測miR-584-5p可與MMP-14啟動子區結合。據報道，MMP-14可介導細胞外基質降解，這是與不良臨床結果相關的癌細胞侵襲和轉移的關鍵步驟[17-18]；MMP-14水平升高與非小細胞肺癌患者Ⅳ期、發生肺外轉移和患者死亡有關[19]；沉默MMP-14能夠顯著抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖、侵襲和遷移能力[20]；miR-369-3p可通過沉默MMP-14進而抑制乳頭狀甲狀腺癌細胞的侵襲、遷移和上皮間質轉化[21]；MMP-14的高表達狀態與乳腺癌細胞分化、淋巴結轉移和遠處轉移密切相關[22]。以上研究表明MMP-14具有促進腫瘤進展的作用。本研究通過熒光素酶報告基因實驗證實miR-584-5p可靶向作用于MMP-14啟動子區。 過表達miR-584-5p可抑制MMP-14 mRNA及蛋白的表達，過表達MMP-14可促進MCF-7細胞的增殖、遷移與侵襲，推測過表達miR-584-5p對MCF-7細胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用可能與MMP-14有關。 為了驗證該推測，本研究設置了回復實驗，結果發現，與MMP-14組和mimic-NC+MMP-14組比較，miR-584-5p mimic+MMP-14組MCF-7細胞的增殖、遷移及侵襲能力降低，但都仍高于miR-584-5p mimic組，表明過表達miR-584-5p 通過下調MMP-14抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Xiang等[23]報道，miR-584-5p 通過下調MMP-14來抑制神經母細胞瘤細胞的生長、侵襲、轉移；Guo等[24]發現，過表達miR-584-5p通過下調MMP-14表達來抑制非小細胞肺癌的遷移與侵襲。本研究結果與Xiang等[23]和Guo等[24]的研究結果是一致的。 此外，相關研究顯示，沉默miR-584-5p可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase， ERK）通路促進肝癌細胞惡性表型[25]；抑制MAPK/ERK通路可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、侵襲和遷移[26]；激活MAPK/ERK通路可促進乳腺癌腫瘤生長[27]。以上研究表明，MAPK/ERK通路可能參與了乳腺癌的惡性進展。推測miR-584-5p通過靶向MMP-14抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的具體機制可能與調控MAPK/ERK通路有關，但本研究尚未對具體機制進行深入探究，這是本研究的不足之處，后期將會深入探究。
綜上所述，過表達miR-584-5p通過下調MMP-14抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。然而，本研究只是在體外水平上探究了miR-584-5p對乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響以及其作用機制，后續將開展體內實驗進行進一步深入探索。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們相互之間無競爭性利益關系。
作者貢獻聲明：劉陳美琪：設計研究方案、實施研究過程及論文撰寫；李海林：實施研究過程、分析實驗數據。
