引用本文： 劉小倩, 冉鳳英, 武倫, 袁方均, 陳琴華, 胡洪生. 膽汁外泌體中miRNA-21對膽管癌的診斷價值. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(1): 48-52. doi: 10.7507/1007-9424.202208061 復制
目前，膽管癌的最佳治療方法仍以根治性切除為主，但由于缺乏敏感的早期診斷指標和特異性的臨床癥狀，許多膽管癌患者初診時已處于中晚期，失去了手術治療時機。因此，尋找一種高效能的早期診斷標志物對疾病的預后可能具有一定的臨床意義。對于膽管癌，除了主要依靠影像學檢查診斷，當前研究較多的循環標志物外泌體顯示出較好的診斷潛能。外泌體是一類直徑為30～150 nm的囊泡結構，普遍存在于各種體液中，參與細胞間及細胞與周圍環境的信息交流[1-2]，介導腫瘤的發生、發展、微環境改變等過程[3-5]，在各種惡性腫瘤的早期診斷及治療中發揮重要作用[6]。隨著研究的深入，發現外泌體中含有大量穩定的微小RNA（microRNA，miRNA）分子，并且外泌體中的miRNA與全血中的miRNA表達譜有差異。此外，miRNA也存在于其他各種體液中[7]，包括膽汁、尿液等。由于膽汁與各種肝膽疾病息息相關，膽汁外泌體的液體活檢對腫瘤的診斷及治療具有較高的臨床價值。miRNA-21是一種與腫瘤密切相關的miRNA分子，在多種疾病中均高度表達且在對腫瘤的早期診斷中顯現出重要意義。因此，本研究初步探討膽汁外泌體中miRNA-21對膽管癌的臨床診斷價值，以期找到可靠的膽管癌早期診斷標志物。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2019年8月至2021年12月期間國藥東風總醫院就診的符合納入標準的膽管癌患者。患者納入標準：① 年齡18～85歲；② 無嚴重心、肺及凝血功能障礙；③ 術前根據臨床癥狀、影像學檢查結果等初步診斷為膽管癌并且經術后病理確診；④ 此次就診前未行放射治療、 化學藥物治療等。選取同期就診的膽管良性疾病（膽總管結石或膽管良性狹窄）患者作為對照，納入標準：① 年齡18～85歲；② 無嚴重心、肺及凝血功能障礙；③ 根據臨床癥狀、影像學檢查結果等初步診斷為膽總管結石或膽管良性狹窄，術后隨訪1年尚無膽管癌征象；④ 需行經內鏡逆行胰膽管造影術取出結石或解除膽管梗阻。排除標準：合并其他部位的原發惡性腫瘤或患者正處于急性感染期。所有參與本研究的對象及其家屬均于術前簽署知情同意書，并且本研究經國藥東風總醫院倫理委員會審核并批準。
1.2 方法
1.2.1 標本收集
收集國藥東風總醫院肝膽外科符合納入標準的膽管癌患者及膽管良性疾病患者的膽汁標本。所有患者術前均空腹8 h及以上，手術均由同一名具有相應資質的副主任醫師實施。手術時腫瘤切除前或經內鏡逆行胰膽管造影術前抽取膽汁約10 mL。膽汁標本裝入抗凝管并儲存于–80 ℃冰箱。
1.2.2 主要試劑與儀器
超速離心機及與之適配的50 mL超速離心管（Eppendorf，德國），0.45 μm針頭式濾過器（Merck Millipore，美國），透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM，Hitachi，日本），粒徑檢測儀器（Particle Metrix’ zeta View，德國），實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）儀（Corbett Research，澳大利亞），分光光度計（Hitachi，日本）。ExoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit購自德國Qiagen公司（77023）；一步法qRT-PCR試劑盒購自Tiangen公司（FP313）；抗體CD81、腫瘤易感基因101（tumor suppressor gene 101，TSG101）、CD63、熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）購自美國Abcam公司（ab79559、ab125011、ab134045、ab2787）；引物于上海生工公司合成；Trizol試劑購自美國Thermo Scientific公司（10296010）。
1.2.3 膽汁外泌體的分離及鑒定
采用超高速差速離心法提取膽汁外泌體，具體步驟如下：① 室溫溶解膽汁，加入相同體積的磷酸鹽緩沖液稀釋，４℃、500×g離心10 min；② 取離心后的上清液，4 ℃、2 000×g離心20 min；③ 取離心后的上清液，用0.45 μm針頭式濾過器進行過濾；④ 過濾得到的溶液進行4 ℃、100 000×g超速離心70 min，得到外泌體沉淀；⑤ 再加適量磷酸鹽緩沖液在4 ℃、100 000×g超速離心60 min進行洗滌，洗滌后的外泌體沉淀加200 μL磷酸鹽緩沖液重懸得到最終外泌體樣本。用3種常用方法對分離出的外泌體進行鑒定：① 通過TEM觀察外泌體形態；② 納米徑粒技術檢測外泌體的粒徑分布、運動和濃度；③ 采用Western blot法檢測膽汁外泌體表面標志蛋白HSP70、TSG101、CD63及CD81的表達，內參蛋白選用β-actin，根據半定量結果灰度值高低判斷表達水平。
1.2.4 膽汁外泌體中miRNA提取及濃度測定
在膽汁外泌體樣品中加1 mL Trizol，使它充分裂解20 min，用試劑盒按說明書操作提取外泌體中miRNA，全程均在冰上操作且嚴格防止RNA酶污染。應用紫外分光光度計測定樣品RNA純度及濃度，260 nm與280 nm波長吸光度比值為1.8～2.1時的樣品為合格樣品，用于后續實驗。
1.2.5 用qRT-PCR法檢測膽汁外泌體中miRNA-21的表達
具體步驟參照試劑盒說明書。以U6作為內參基因，U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′，下游引物為5′-TTGCGTGTCATCCTTGCG-3′，擴增片段長度為141 bp；miRNA-21上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGATG-3′，下游引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′，擴增片段長度為154 bp。半定量結果以2–ΔCt進行分析。
1.3 統計學方法
本研究中的數據用SPSS 26.0軟件進行統計分析，定性資料比較采用成組χ2檢驗；連續變量滿足正態性分布時以均數描述并采用獨立樣本比較的t檢驗。采用受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線并計算ROC曲線下面積（area under the ROC curve，AUC），同時計算它所對應的特異度和敏感度。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 納入患者的基本情況
本研究納入45例膽管癌患者、35例膽管良性疾病患者，2組患者的性別分布及年齡差異無統計學意義（P>0.05），見表1。
表1
2組患者的基本情況比較
2.2 膽汁外泌體的鑒定結果
通過TEM觀察到膽管癌和膽管良性疾病患者中所提取的膽汁外泌體為類圓形囊泡結構，直徑約為90 nm（圖1a）；利用納米徑粒技術檢測外泌體粒徑分布、濃度及其布朗運動的結果顯示，膽汁外泌體的粒徑為119.4～245.4 nm，平均粒徑為140.2 nm，膽管癌患者膽汁外泌體的總濃度為7.6×1010顆粒/mL，見圖1b；Western blot法檢測膽管癌和膽管良性疾病患者的膽汁外泌體中均表達標志性蛋白HSP70、CD63、TSG101、CD81（圖1c），半定量結果顯示膽管癌患者的膽汁外泌體中標志性蛋白灰度值均高于膽管良性疾病患者，其中CD63（t=–39.328，P＜0.001）和TSG101（t=–26.155，P＜0.001）表達差異比較明顯（圖1d）。
圖1
示膽汁外泌體的鑒定結果、miRNA-21在不同組織中的相對表達量以及它診斷膽管癌的ROC曲線
a：外泌體形態（TEM ×30 000）；b：外泌體粒徑分布；c、d：Western blot法檢測膽管癌和膽管良性疾病患者外泌體特異性蛋白表達的定性（c）和半定量（d）結果（與膽管良性疾病患者比較，*
2.3 膽管癌和膽管良性疾病患者的膽汁外泌體中miRNA-21表達水平及它對膽管癌的診斷價值評估
qRT-PCR法檢測膽管癌和膽管良性疾病患者的膽汁外泌體中miRNA-21表達水平見圖1e，膽管癌患者的miRNA-21相對表達量均值高于膽管良性疾病患者（59.45比25.41，t=3.445，P<0.001）。膽汁外泌體中miRNA-21診斷膽管癌的ROC曲線見圖1f，AUC為0.715 ［95%CI（0.602，0.827），P=0.001］，診斷膽管癌的敏感度為75.6%，特異度為62.9%。
3 討論
miRNA是一類內源性非編碼RNA小分子，參與細胞增殖、分化、凋亡等過程[8]，大多數都能以非常穩定的形式存在于血漿和血清中[9]。近年來，國內外關于血液及組織中的miRNA在膽管癌中的研究越來越多，Nakaoka等[10]發現，腫瘤抑制基因和miRNA的DNA甲基化可能是膽管癌診斷和治療的強有力的生物標志物。miRNA-21作為一種重要的miRNA分子，在乳腺癌、肺癌、結直腸癌和其他腫瘤中均高度表達，對腫瘤的早期診斷顯現出重要意義。miRNA-21在膽管癌發生過程中的作用也陸續被報道。在一項隊列研究[11]中發現，肝內膽管癌組與健康對照組相比，血清中miRNA-221和miRNA-21的水平顯著升高；另一項研究[12]也證實，miRNA-21的循環水平能夠區分膽管癌患者、健康對照組（AUC=0.93）以及非惡性膽管疾病患者（AUC=0.83），并在腫瘤切除后降低。
外泌體中包含大量的miRNA、DNA、長鏈非編碼RNA等遺傳信息分子[13]。由于外泌體的磷脂雙分子層的保護作用，它能以非常穩定的形式存在于體液中，具有內容物多樣、容易富集、可實時檢測等優點，外泌體在腫瘤疾病的基礎研究、早期診斷、靶向藥物治療、復發監測等領域展現出巨大潛力[14-16]。隨著人們對外泌體研究的不斷加深，外泌體miRNA在腫瘤中的作用及臨床價值也被陸續報道并詳細闡述[17]，外泌體miRNA作為一種新型腫瘤早期生物標志物已被廣泛認可[17-19]。
有研究[20]表明，膽汁外泌體濃度檢測可區分膽管狹窄的良惡性且準確度可達100%，高于血清外泌體濃度對它診斷的準確性；另一項研究[21]也表明，膽管癌患者可以膽汁外泌體中miRNA組合作為診斷標志物，它對膽管癌診斷的特異度可達96%，靈敏度為67%，高于血清CA19-9檢測對膽管癌的診斷價值。相對于其他體液，膽汁作為膽管上皮細胞生存的微環境和肝膽系疾病有直接關系，但目前關于膽汁外泌體的研究尚較少，膽汁外泌體中所含遺傳信息及它在細胞間信號傳遞的具體機制也有待進一步深入研究。因此本研究收取膽汁中的外泌體進行研究，由于臨床獲得正常膽汁不符合倫理要求，所以本研究選取具有膽管良性疾病患者的膽汁作為對照。膽汁中含膽鹽、膽色素、膽固醇、蛋白等多種成分，且多伴有泥沙樣結石、感染等，所以膽汁外泌體的提取和過濾具有一定的困難，且獲得的產量及純度較低。目前提取外泌體的方法主要包括超速離心法、聚合沉淀法、密度梯度離心法、磁珠免疫捕獲法、超濾法等[22]。本研究采用超速離心法進行外泌體的提取，然后用3種不同方法對外泌體進行鑒定，證明膽汁中存在大量穩定的外泌體。隨后通過對45例膽管癌患者和35例膽管良性疾病患者的膽汁外泌體行qRT-PCR檢測發現，在膽管癌患者膽汁外泌體中miRNA-21的表達水平明顯高于膽管良性疾病患者，提示膽汁外泌體中miRNA-21表達可能與膽管癌的發生有關。根據miRNA-21相對表達量繪制ROC曲線，膽汁外泌體中miRNA-21表達診斷膽管癌的AUC為0.715（P=0.001），其敏感度和特異度分別為75.6%和62.9%，結果提示，膽汁外泌體中miRNA-21表達對膽管癌有一定的診斷價值。
盡管本研究初步證明了膽管癌患者膽汁外泌體中miRNA-21的表達相對較高，對膽管癌具有一定的診斷效能，但仍具有一定局限性，如由于經內鏡逆行胰膽管造影術中獲得的膽汁量有限，而且膽汁成分復雜，外泌體分離程序繁雜，獲得產量較低，未對膽汁外泌體中miRNA-21參與膽管癌的發生及發展的機制進行研究，并且樣本量也較少。因此，需要進一步系統研究膽汁外泌體中miRNA-21與膽管癌的發生、發展及轉移的分子機制，后續將增加樣本量進一步研究膽汁外泌體中多種miRNA在膽管癌中表達的臨床意義，使它成為膽管癌的早期診斷標志物有更充分的理論依據。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉小倩參與設計本研究、參與實驗操作、收集并分析數據、撰寫文章；冉鳳英和武倫參與設計本研究、指導實驗操作、收集數據；袁方均和陳琴華參與設計本研究、對文章進行審閱；胡洪生參與設計本研究、分析數據、實施手術及文章審閱。
倫理聲明：本研究通過了國藥東風總醫院倫理委員會審批通過（批文編號：LW-2022-003）。
目前，膽管癌的最佳治療方法仍以根治性切除為主，但由于缺乏敏感的早期診斷指標和特異性的臨床癥狀，許多膽管癌患者初診時已處于中晚期，失去了手術治療時機。因此，尋找一種高效能的早期診斷標志物對疾病的預后可能具有一定的臨床意義。對于膽管癌，除了主要依靠影像學檢查診斷，當前研究較多的循環標志物外泌體顯示出較好的診斷潛能。外泌體是一類直徑為30～150 nm的囊泡結構，普遍存在于各種體液中，參與細胞間及細胞與周圍環境的信息交流[1-2]，介導腫瘤的發生、發展、微環境改變等過程[3-5]，在各種惡性腫瘤的早期診斷及治療中發揮重要作用[6]。隨著研究的深入，發現外泌體中含有大量穩定的微小RNA（microRNA，miRNA）分子，并且外泌體中的miRNA與全血中的miRNA表達譜有差異。此外，miRNA也存在于其他各種體液中[7]，包括膽汁、尿液等。由于膽汁與各種肝膽疾病息息相關，膽汁外泌體的液體活檢對腫瘤的診斷及治療具有較高的臨床價值。miRNA-21是一種與腫瘤密切相關的miRNA分子，在多種疾病中均高度表達且在對腫瘤的早期診斷中顯現出重要意義。因此，本研究初步探討膽汁外泌體中miRNA-21對膽管癌的臨床診斷價值，以期找到可靠的膽管癌早期診斷標志物。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2019年8月至2021年12月期間國藥東風總醫院就診的符合納入標準的膽管癌患者。患者納入標準：① 年齡18～85歲；② 無嚴重心、肺及凝血功能障礙；③ 術前根據臨床癥狀、影像學檢查結果等初步診斷為膽管癌并且經術后病理確診；④ 此次就診前未行放射治療、 化學藥物治療等。選取同期就診的膽管良性疾病（膽總管結石或膽管良性狹窄）患者作為對照，納入標準：① 年齡18～85歲；② 無嚴重心、肺及凝血功能障礙；③ 根據臨床癥狀、影像學檢查結果等初步診斷為膽總管結石或膽管良性狹窄，術后隨訪1年尚無膽管癌征象；④ 需行經內鏡逆行胰膽管造影術取出結石或解除膽管梗阻。排除標準：合并其他部位的原發惡性腫瘤或患者正處于急性感染期。所有參與本研究的對象及其家屬均于術前簽署知情同意書，并且本研究經國藥東風總醫院倫理委員會審核并批準。
1.2 方法
1.2.1 標本收集
收集國藥東風總醫院肝膽外科符合納入標準的膽管癌患者及膽管良性疾病患者的膽汁標本。所有患者術前均空腹8 h及以上，手術均由同一名具有相應資質的副主任醫師實施。手術時腫瘤切除前或經內鏡逆行胰膽管造影術前抽取膽汁約10 mL。膽汁標本裝入抗凝管并儲存于–80 ℃冰箱。
1.2.2 主要試劑與儀器
超速離心機及與之適配的50 mL超速離心管（Eppendorf，德國），0.45 μm針頭式濾過器（Merck Millipore，美國），透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM，Hitachi，日本），粒徑檢測儀器（Particle Metrix’ zeta View，德國），實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）儀（Corbett Research，澳大利亞），分光光度計（Hitachi，日本）。ExoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit購自德國Qiagen公司（77023）；一步法qRT-PCR試劑盒購自Tiangen公司（FP313）；抗體CD81、腫瘤易感基因101（tumor suppressor gene 101，TSG101）、CD63、熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）購自美國Abcam公司（ab79559、ab125011、ab134045、ab2787）；引物于上海生工公司合成；Trizol試劑購自美國Thermo Scientific公司（10296010）。
1.2.3 膽汁外泌體的分離及鑒定
采用超高速差速離心法提取膽汁外泌體，具體步驟如下：① 室溫溶解膽汁，加入相同體積的磷酸鹽緩沖液稀釋，４℃、500×g離心10 min；② 取離心后的上清液，4 ℃、2 000×g離心20 min；③ 取離心后的上清液，用0.45 μm針頭式濾過器進行過濾；④ 過濾得到的溶液進行4 ℃、100 000×g超速離心70 min，得到外泌體沉淀；⑤ 再加適量磷酸鹽緩沖液在4 ℃、100 000×g超速離心60 min進行洗滌，洗滌后的外泌體沉淀加200 μL磷酸鹽緩沖液重懸得到最終外泌體樣本。用3種常用方法對分離出的外泌體進行鑒定：① 通過TEM觀察外泌體形態；② 納米徑粒技術檢測外泌體的粒徑分布、運動和濃度；③ 采用Western blot法檢測膽汁外泌體表面標志蛋白HSP70、TSG101、CD63及CD81的表達，內參蛋白選用β-actin，根據半定量結果灰度值高低判斷表達水平。
1.2.4 膽汁外泌體中miRNA提取及濃度測定
在膽汁外泌體樣品中加1 mL Trizol，使它充分裂解20 min，用試劑盒按說明書操作提取外泌體中miRNA，全程均在冰上操作且嚴格防止RNA酶污染。應用紫外分光光度計測定樣品RNA純度及濃度，260 nm與280 nm波長吸光度比值為1.8～2.1時的樣品為合格樣品，用于后續實驗。
1.2.5 用qRT-PCR法檢測膽汁外泌體中miRNA-21的表達
具體步驟參照試劑盒說明書。以U6作為內參基因，U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′，下游引物為5′-TTGCGTGTCATCCTTGCG-3′，擴增片段長度為141 bp；miRNA-21上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGATG-3′，下游引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′，擴增片段長度為154 bp。半定量結果以2–ΔCt進行分析。
1.3 統計學方法
本研究中的數據用SPSS 26.0軟件進行統計分析，定性資料比較采用成組χ2檢驗；連續變量滿足正態性分布時以均數描述并采用獨立樣本比較的t檢驗。采用受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線并計算ROC曲線下面積（area under the ROC curve，AUC），同時計算它所對應的特異度和敏感度。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 納入患者的基本情況
本研究納入45例膽管癌患者、35例膽管良性疾病患者，2組患者的性別分布及年齡差異無統計學意義（P>0.05），見表1。
表1
2組患者的基本情況比較
2.2 膽汁外泌體的鑒定結果
通過TEM觀察到膽管癌和膽管良性疾病患者中所提取的膽汁外泌體為類圓形囊泡結構，直徑約為90 nm（圖1a）；利用納米徑粒技術檢測外泌體粒徑分布、濃度及其布朗運動的結果顯示，膽汁外泌體的粒徑為119.4～245.4 nm，平均粒徑為140.2 nm，膽管癌患者膽汁外泌體的總濃度為7.6×1010顆粒/mL，見圖1b；Western blot法檢測膽管癌和膽管良性疾病患者的膽汁外泌體中均表達標志性蛋白HSP70、CD63、TSG101、CD81（圖1c），半定量結果顯示膽管癌患者的膽汁外泌體中標志性蛋白灰度值均高于膽管良性疾病患者，其中CD63（t=–39.328，P＜0.001）和TSG101（t=–26.155，P＜0.001）表達差異比較明顯（圖1d）。
圖1
示膽汁外泌體的鑒定結果、miRNA-21在不同組織中的相對表達量以及它診斷膽管癌的ROC曲線
a：外泌體形態（TEM ×30 000）；b：外泌體粒徑分布；c、d：Western blot法檢測膽管癌和膽管良性疾病患者外泌體特異性蛋白表達的定性（c）和半定量（d）結果（與膽管良性疾病患者比較，*
2.3 膽管癌和膽管良性疾病患者的膽汁外泌體中miRNA-21表達水平及它對膽管癌的診斷價值評估
qRT-PCR法檢測膽管癌和膽管良性疾病患者的膽汁外泌體中miRNA-21表達水平見圖1e，膽管癌患者的miRNA-21相對表達量均值高于膽管良性疾病患者（59.45比25.41，t=3.445，P<0.001）。膽汁外泌體中miRNA-21診斷膽管癌的ROC曲線見圖1f，AUC為0.715 ［95%CI（0.602，0.827），P=0.001］，診斷膽管癌的敏感度為75.6%，特異度為62.9%。
3 討論
miRNA是一類內源性非編碼RNA小分子，參與細胞增殖、分化、凋亡等過程[8]，大多數都能以非常穩定的形式存在于血漿和血清中[9]。近年來，國內外關于血液及組織中的miRNA在膽管癌中的研究越來越多，Nakaoka等[10]發現，腫瘤抑制基因和miRNA的DNA甲基化可能是膽管癌診斷和治療的強有力的生物標志物。miRNA-21作為一種重要的miRNA分子，在乳腺癌、肺癌、結直腸癌和其他腫瘤中均高度表達，對腫瘤的早期診斷顯現出重要意義。miRNA-21在膽管癌發生過程中的作用也陸續被報道。在一項隊列研究[11]中發現，肝內膽管癌組與健康對照組相比，血清中miRNA-221和miRNA-21的水平顯著升高；另一項研究[12]也證實，miRNA-21的循環水平能夠區分膽管癌患者、健康對照組（AUC=0.93）以及非惡性膽管疾病患者（AUC=0.83），并在腫瘤切除后降低。
外泌體中包含大量的miRNA、DNA、長鏈非編碼RNA等遺傳信息分子[13]。由于外泌體的磷脂雙分子層的保護作用，它能以非常穩定的形式存在于體液中，具有內容物多樣、容易富集、可實時檢測等優點，外泌體在腫瘤疾病的基礎研究、早期診斷、靶向藥物治療、復發監測等領域展現出巨大潛力[14-16]。隨著人們對外泌體研究的不斷加深，外泌體miRNA在腫瘤中的作用及臨床價值也被陸續報道并詳細闡述[17]，外泌體miRNA作為一種新型腫瘤早期生物標志物已被廣泛認可[17-19]。
有研究[20]表明，膽汁外泌體濃度檢測可區分膽管狹窄的良惡性且準確度可達100%，高于血清外泌體濃度對它診斷的準確性；另一項研究[21]也表明，膽管癌患者可以膽汁外泌體中miRNA組合作為診斷標志物，它對膽管癌診斷的特異度可達96%，靈敏度為67%，高于血清CA19-9檢測對膽管癌的診斷價值。相對于其他體液，膽汁作為膽管上皮細胞生存的微環境和肝膽系疾病有直接關系，但目前關于膽汁外泌體的研究尚較少，膽汁外泌體中所含遺傳信息及它在細胞間信號傳遞的具體機制也有待進一步深入研究。因此本研究收取膽汁中的外泌體進行研究，由于臨床獲得正常膽汁不符合倫理要求，所以本研究選取具有膽管良性疾病患者的膽汁作為對照。膽汁中含膽鹽、膽色素、膽固醇、蛋白等多種成分，且多伴有泥沙樣結石、感染等，所以膽汁外泌體的提取和過濾具有一定的困難，且獲得的產量及純度較低。目前提取外泌體的方法主要包括超速離心法、聚合沉淀法、密度梯度離心法、磁珠免疫捕獲法、超濾法等[22]。本研究采用超速離心法進行外泌體的提取，然后用3種不同方法對外泌體進行鑒定，證明膽汁中存在大量穩定的外泌體。隨后通過對45例膽管癌患者和35例膽管良性疾病患者的膽汁外泌體行qRT-PCR檢測發現，在膽管癌患者膽汁外泌體中miRNA-21的表達水平明顯高于膽管良性疾病患者，提示膽汁外泌體中miRNA-21表達可能與膽管癌的發生有關。根據miRNA-21相對表達量繪制ROC曲線，膽汁外泌體中miRNA-21表達診斷膽管癌的AUC為0.715（P=0.001），其敏感度和特異度分別為75.6%和62.9%，結果提示，膽汁外泌體中miRNA-21表達對膽管癌有一定的診斷價值。
盡管本研究初步證明了膽管癌患者膽汁外泌體中miRNA-21的表達相對較高，對膽管癌具有一定的診斷效能，但仍具有一定局限性，如由于經內鏡逆行胰膽管造影術中獲得的膽汁量有限，而且膽汁成分復雜，外泌體分離程序繁雜，獲得產量較低，未對膽汁外泌體中miRNA-21參與膽管癌的發生及發展的機制進行研究，并且樣本量也較少。因此，需要進一步系統研究膽汁外泌體中miRNA-21與膽管癌的發生、發展及轉移的分子機制，后續將增加樣本量進一步研究膽汁外泌體中多種miRNA在膽管癌中表達的臨床意義，使它成為膽管癌的早期診斷標志物有更充分的理論依據。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉小倩參與設計本研究、參與實驗操作、收集并分析數據、撰寫文章；冉鳳英和武倫參與設計本研究、指導實驗操作、收集數據；袁方均和陳琴華參與設計本研究、對文章進行審閱；胡洪生參與設計本研究、分析數據、實施手術及文章審閱。
倫理聲明：本研究通過了國藥東風總醫院倫理委員會審批通過（批文編號：LW-2022-003）。
