引用本文： 楊曉晴, 王正寨, 林溪源, 鄭海濤. 自體熒光在甲狀旁腺研究中的進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(2): 236-241. doi: 10.7507/1007-9424.202208043 復制
近年來甲狀腺癌發病率逐漸增高，是增長速度最快的惡性腫瘤[1]，甲狀旁腺的損傷仍是一項難題，據報道術后暫時性及永久性甲狀旁腺功能減退（簡稱甲旁減）的發生率分別為19%～38%和0.0%～3%[2]。術中甲狀旁腺不易與脂肪組織、淋巴結和異位胸腺相區別；此外，隨著解剖程度的增加，醫源性甲狀旁腺損傷和意外切除發生率也隨之增高[3-4]。目前，術中識別甲狀旁腺的方法包括肉眼識別、亞甲藍正顯影、納米碳負顯影、術中快速冰凍病理檢查、甲狀旁腺穿刺洗脫液、免疫膠體金等，但術中無法對甲狀旁腺進行實時定位。甲狀旁腺近紅外熒光成像（near-infrared fluorescence，NIRF）技術包括外源性熒光成像技術和近紅外自體熒光成像（near-infrared autofluorescence imaging，NIRAF）技術。在外源性熒光成像技術中應用于熒光顯像的外源性熒光物質是5-氨基乙酰丙酸和吲哚菁綠（indocyanine green，ICG），該方法識別甲狀旁腺的敏感度不高，且存在ICG過敏風險，因此術中使用受限。而NIRAF是在不使用外源性熒光物質的情況下應用近紅外光照射組織，激發組織內固有的內源性熒光團產生區別于甲狀腺等其他組織的更強的熒光。 近年來NIRAF較多用于術中識別甲狀旁腺，筆者現就NIRAF相關內容綜述如下。
1 NIRAF的發展歷程
Das等[5]于2006年首次描述甲狀旁腺在830 nm近紅外光照射下可出現自體熒光；Paras等[6]于2011年證實了甲狀旁腺的這種特性。2013年McWade等[7]證實了其定位甲狀旁腺的可靠性，通過NIRAF方法在45例患者中甲狀旁腺檢出率達100%。Hyun等[8]隨后也發現近紅外熒光在豬和鼠中識別甲狀旁腺的高度特異性。自2011年相關商業設備不斷開發，2018年美國食品和藥物管理局批準了兩種實時甲狀旁腺識別系統，其中一種是Fluobeam影像系統（法國），透明滅菌材料包裹，非接觸式提供圖像，但需關閉手術室燈光[9-10]。另一種是PTeye（美國），其在探頭接觸組織時提供數值（類似于神經監測），但不提供圖像，這是近期批準的設備，該設備是甲狀旁腺眼（parathyroid eye）的縮寫，是基于探針NIRAF檢測系統作為無標記術中識別甲狀旁腺的輔助工具。有研究者[11]發現，基于探針的檢測準確性高于基于圖像的檢測，但目前對其研究較少[12-13]。
2 NIRAF顯像機制
甲狀腺及甲狀旁腺在822 nm處僅顯示1個發射峰，表明自體熒光是甲狀腺和甲狀旁腺中均存在的單一天然熒光團。熒光團的特性目前尚不清楚，結構分析表明此熒光團主要存在于細胞質細胞器中，熒光團的分子量約為15×103，相對耐熱和具有抗蛋白酶活性[14]。研究[15-17]認為，熒光團可能在甲狀旁腺中高度表達，在甲狀腺中低表達而在周圍組織中不存在，甲狀旁腺的近紅外自體熒光可能與鈣敏感受體或維生素D受體有關。鈣敏感受體表達在甲狀旁腺細胞中最高，甲狀腺C細胞最少，而在肌肉、脂肪或頸部淋巴結中沒有表達，這解釋了自體熒光在甲狀旁腺及甲狀腺中熒光強度存在的原因[7]。此外還發現，鈣敏感受體或維生素D受體在原發性甲狀旁腺功能亢進（簡稱甲旁亢）中較正常甲狀旁腺有輕微減少，而在繼發性甲旁亢中則顯著減少[15, 17]。McWade等[16]同樣證實鈣敏感受體表達在甲旁亢患者中下調，這與其較低熒光強度是一致的；同時研究者還對人體高表達鈣敏感受體的腎臟和結腸進行了近紅外熒光測量，發現結腸和腎臟在822 nm處發出具有相同峰值的熒光且熒光強度與甲狀旁腺信號的強度相同。此外，對于在甲狀旁腺中存在的其他物質如分泌顆粒、卟啉衍生物的前體或副產物等是否可能造成甲狀旁腺的自體熒光，同樣也不應被忽視。
2016年McWade團隊[17]提出自體熒光還可能與甲狀旁腺細胞密度差異、脂肪組織含量、主細胞和嗜酸細胞不同比例及增生模式有關，對繼發性甲旁亢患者高低熒光信號甲狀旁腺行組織病理學分析發現：低熒光強度的甲狀旁腺顯示彌漫性主細胞增生伴小葉擴張、纖維化，脂肪占比少；較高熒光強度甲狀旁腺的彌漫性增生主細胞顯示出水樣透明細胞和嗜酸性細胞；同時該團隊認為甲狀旁腺及甲狀腺中存在的假膠體及其脂肪含量的差異也可能在自體熒光中起作用。 Ladurner等[18]發現，高身體質量指數（body mass index， BMI）患者中基質脂肪的增加可能是熒光信號變弱的原因；而Falco等[19]通過組織學檢查發現正常甲狀旁腺脂肪與細胞占比分別為61%和39%，甲狀旁腺腺瘤脂肪和細胞占比分別為37%和63%，甲狀旁腺腺瘤的高強度熒光可能與病理性腺體的細胞數量增加和脂肪占比減少有關。
目前關于鈣敏感受體和維生素D受體在NIRAF中的作用被多數人接受，但具體機制不詳，仍是未來究熱點方向；其余因素尚無統一定論，需進一步探討。
3 NIRAF強度影響因素
據報道甲狀旁腺的熒光強度是甲狀腺的1.2～29倍不等，關于NIRAF能否區分正常及病理甲狀旁腺，目前尚無共識[6-7, 20]。有研究[16-17, 21-23]認為，甲狀旁腺的疾病狀態對于熒光強度有顯著影響，正常甲狀旁腺熒光強度高于原發性甲旁亢，繼發性甲旁亢熒光強度最弱，甲狀腺顯示出微弱的熒光強度；但少數研究者[19, 24]認為，原發性甲旁亢的甲狀旁腺熒光強度顯著高于正常甲狀旁腺；也有研究者[6-7, 18, 25-26]認為自體熒光強度與甲狀旁腺病理狀態無關。此外，將甲狀旁腺整塊切除并用甲醛固定后仍檢測到熒光持續存在，甚至甲狀旁腺體外自體熒光的平均值顯著高于原位自體熒光，推測自體熒光強度不受其他因素影響且與血供無關[19, 25, 27]。
McWade等[17]認為，高BMI、甲旁亢、低維生素D和高鈣水平患者其甲狀旁腺自體熒光強度較低，與年齡、性別、種族和甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）水平無關。Falco等[24]發現，甲狀旁腺熒光強度僅取決于暴露的組織，與年齡、性別、組織病理學診斷、BMI、甲狀旁腺大小及位置無關。殷德濤團隊[28]發現，甲狀旁腺自體熒光強度僅與疾病類型相關。Ladurner等[18]認為，甲狀旁腺由于嵌入脂肪組織，可致自體熒光強度降低。但有研究者[29]提出相反的觀點，當上甲狀旁腺被脂肪或結締組織覆蓋顯示為高強度熒光；當下甲狀旁腺被血管覆蓋顯示低強度熒光，這種自體熒光強度的差異可能是血液中某些成分（如血紅蛋白）在780 nm波長范圍內對激活光能的吸收較脂肪或結締組織更高所致。此外，探針接觸壓力、探頭與手術場距離與甲狀旁腺熒光強度呈反比[16-17, 30]。甲狀旁腺自體熒光強度還易受到環境光、背景光、熒光團局部濃度、局部照明強度、光程、組織的幾何形狀等的影響[10, 30]。Squires等[27]還發現原位甲狀旁腺與甲狀腺自體熒光的比值及差值均與甲狀旁腺的質量和體積增加相關，與術前血清PTH無關。
目前關于影響甲狀旁腺熒光強度相關因素尚無統一結論，未來需加大臨床樣本量來進一步驗證和明確。
4 NIRAF國內外研究現狀
近年來隨著NIRAF這一技術的出現，其更多地被應用于甲狀腺及甲狀旁腺相關手術中。McWade等[16]發現，無論疾病狀態如何，在6例患者中通過NIRAF技術檢測出100%的甲狀旁腺。隨后該團隊[17]于2016年對137例患者的264個甲狀旁腺研究發現，NIRAF技術對良性甲狀腺疾病、原發性及三發性甲旁亢患者的甲狀旁腺檢測的準確率均為100%，分化型甲狀腺癌準確率為98%，對于同時患有甲狀旁腺和甲狀腺疾病的準確率為94%，然而對腎性繼發性甲旁亢檢測的準確率降至54%，可能與繼發性甲旁亢細胞增生的模式及脂肪含量有關。Kim 等[29]收集8例甲狀腺乳頭狀癌患者的16個正常甲狀旁腺，所有甲狀旁腺都被檢測到，被結締組織或血管覆蓋的甲狀旁腺也可檢測到熒光。 Falco等[19]對28例手術患者應用NIRAF 技術，所有甲狀旁腺均被識別且均未發生術后低鈣血癥或其他手術并發癥。 隨后Falco等[24]再次對74例患有不同的甲狀腺和甲狀旁腺疾病患者展開研究，應用NIRAF識別的甲狀旁腺數量明顯增加且與年齡、性別或組織病理學類型無關；對于甲狀腺炎患者NIRAF識別甲狀旁腺相較于白光識別作用尤其顯著，但不足是缺乏對組織的病理活檢。Ladurner等[14]研究發現，NIRAF識別甲狀旁腺的敏感度為90%（37/41），其中在2例患者中，應用NIRAF技術有助于在中央淋巴結清掃過程中識別和保存尾側甲狀旁腺。在原發性甲旁亢患者的手術中，術者肉眼識別到類似甲狀旁腺腺瘤的結構，但NIRAF沒有自體熒光，經組織學檢查證實為甲狀腺組織[18]，對于存疑的甲狀旁腺，NIRAF表現出一定的可靠性。
Kose等[31]發現，術中98%的甲狀旁腺存在自體熒光，23%的甲狀旁腺在術者視覺識別前使用了NIRAF技術予以識別；而在甲狀旁腺疾病和術前定位陰性的患者中，21%的異常腺體在視覺識別之前通過NIRAF技術予以識別。NIRAF技術預測甲狀旁腺的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為98.5%、97.2%、95.1%和99.1%。Kim等[11]對1 198例患者的meta分析發現，NIRAF的敏感度、特異度、陰性預測值和陽性預測值分別為0.969 3、0.924 8、0.951 7和0.948 8。De Leeuw等[25]在28例患者體外樣本研究中發現，NIRAF的敏感度和特異度分別為 94.1%和80%，同時對35例患者的術中甲狀旁腺樣本檢出的敏感度為98.8%；在14例術中存疑的病例中，使用NIRAF后甲狀旁腺得以確認；在最初肉眼無法識別甲狀旁腺的5例患者中，這些甲狀旁腺后來在近紅外成像的幫助下被發現且均經病理學檢查予以證實。 Kahramangil等[32]發現，在210例患者中46%的甲狀旁腺肉眼識別困難，但應用NIRAF可輕松發現甲狀旁腺且無需解剖。Benmiloud等[33]也有同樣的發現：68%患者的甲狀旁腺在肉眼識別之前可通過NIRAF得以識別，且術后低鈣血癥發生率從20.9%下降到5.2%。Dip等[34]對170例患者的隨機對照研究發現，從白光肉眼到NIRAF的轉換使甲狀旁腺的探查數量從2.6個增加到3.5個； 67.1%的患者從白光肉眼轉換到NIRAF可發現多于1個的額外甲狀旁腺，并明顯降低術后嚴重低鈣血癥發生率。Kim等[35]將自體熒光探查細化分為P1、P2和P3 3個階段：P1階段是術者未分離進行甲狀旁腺自體熒光探查，P2階段是分離及肉眼識別后進行探查，當在P1或P2階段未檢測到甲狀旁腺時，從切除的手術標本中進行P3階段的探查。 92.8%（64/69）的甲狀旁腺在P1階段得以定位，5.8%（4/69）在P2階段得以定位，P3階段為 1.4%（1/69）；在進行解剖暴露后，P1階段5個陰性甲狀旁腺中有4個甲狀旁腺被識別，可能由于甲狀旁腺所在位置深度超出近紅外光穿透深度所致。在該研究中，只有1例（1.4%）甲狀旁腺被意外摘除且在P3階段發現。總之P1、P2和P3階段甲狀旁腺定位的敏感度、特異度和準確性均為100%。
盡管Paras等[6]的最初工作是針對甲狀腺手術，但此技術也可用于甲旁亢手術，有助于術中甲狀旁腺的定位。Squires等[27]對59例原發性甲旁亢患者使用NIRAF并應用Image J軟件量化熒光強度。該方法檢測甲狀旁腺的敏感度為87%，術中甲狀旁腺識別平均值從4.1個提高到4.4個。Wolf等[36]發現NIRAF在原發性甲旁亢的敏感度和陽性預測值分別為90%和93%，在繼發性甲旁亢的敏感度和陽性預測值分別為83%和100%。目前國內外研究顯示出NIRAF在甲狀腺及甲狀旁腺手術中的優越性，更利于術中甲狀旁腺識別，并在一定程度上可降低術后并發癥的發生率。
5 NIRAF的優點
術前甲狀旁腺的定位方法如核素顯像、超聲等僅在甲狀旁腺功能高度活躍時有效，對于正常甲狀旁腺作用甚微[6]。術中冰凍切片準確性高但有致血運受損的風險；術中細針穿刺洗脫液PTH測定具有侵襲性；近期發現甲狀旁腺術中懸浮組織標本的天冬氨酸轉氨酶與乳酸脫氫酶的比率對甲狀旁腺組織具有很高的敏感度和特異度[37]，但以上3種方法均需時間等待且無法實時定位甲狀旁腺，而術中實時可視化甲狀旁腺的方法如ICG熒光成像，但該技術需要注入染料，存在致敏風險。相比之下，NIRAF作為一種非侵入性、實時、無需切除組織、不依賴任何靜脈染料的新興技術，其檢測甲狀旁腺的敏感度和特異度高于所有其他方法[7]，以上是其中的優點之一。 優點二，此技術可以消除術者判斷的模糊性，對于肉眼遺漏的甲狀旁腺起到輔助識別作用[25]。 在切除側葉后使用此技術檢查氣管旁區域可能有助于在解剖的早期階段識別位置異常的甲狀旁腺[29]。優點三，對于二次手術或者甲狀腺炎的患者，由于手術瘢痕及慢性炎癥使得肉眼識別甲狀旁腺更加困難，術中NIRAF技術的使用可事先識別甲狀旁腺，尋找其潛在的血液供應來源，并更仔細地解剖以便將其留在原位[27]。Thomas等[13]于2019年提出“PTeye”設備，PTeye是一種手持光纖探針實時識別甲狀旁腺設備，使用時無需關閉手術室燈光，可識別98%的甲狀旁腺。該團隊認為由于近紅外光下觀察到的解剖結構傳輸到顯示器上存在一定誤差，提出一種疊加組織成像系統（overlay tissue imaging system，OTIS）。該系統收集組織NIRAF信號，并將圖像直接投影到手術野上，無需顯示器，從而為甲狀旁腺的信號提供真實的空間背景，減少術者將遠程顯示器上的NIRAF圖像與真實手術視野相關聯的繁瑣步驟。PTeye手持式探頭可以輕松定位并進行NIRAF測量，但PTeye不能提供甲狀旁腺周圍結構的空間信息是其缺陷，目前該設備仍處于開發階段。Kiernan等[12]發現，PTeye的準確率、陽性預測值和陰性預測值分別為 94.3%、 93.0%及100%。
此外，甲狀旁腺受損致低鈣血癥臨床上并不少見。Benmiloud等[38]研究發現，NIRAF 組術后暫時性低鈣血癥發生率為 9.1%（11/121），對照組為 21.7%（26/120）；永久性低鈣血癥發生率NIRAF組為 0.0%，對照組為 1.6% （2/120）。使用 NIRAF可減少術中意外切除的甲狀旁腺數量、降低甲狀旁腺自體移植概率，降低術后低鈣血癥的風險。
6 NIRAF的缺點
盡管許多研究證實NIRAF對于術中甲狀旁腺的識別有較高的準確率和敏感度，但還存在以下不足。缺點一：NIRAF要求術中反復關閉手術室燈光[6, 16, 23]，盡管有研究者提出新型設備使用時無需關閉手術室燈光，但尚在研發中，未廣泛開展使用[13]。缺點二：對于操作者來說，圖像捕捉時間長短不一且熒光強度受到探針壓力、操作距離及其他組織覆蓋等情況的影響，個體操作差異性大[7,16, 34]。但有研究者認為，甲狀旁腺在被氣管旁結締組織或血管脂肪組織遮蓋的情況下，當肉眼無法檢測到腺體時，仍然可以通過NIRAF檢測甲狀旁腺，其敏感度為92.75%[29, 35]。此外，同一個甲狀旁腺的單獨測量值可能會有所不同，每個甲狀旁腺至少需要測量3次，多次測量可減少術中各種因素所致的誤差[32]。缺點三：近紅外波長穿透深度約2～3 mm，由于穿透深度限制，不應將其作為“導航工具”，更不能替代術者的仔細分離，NIRAF在組織穿透能力方面有待進一步提高[25, 31, 39]。缺點四：NIRAF無法評估甲狀旁腺的血液灌注是其另一大弊端[19, 32-33]，目前較多采用ICG血管造影判斷甲狀旁腺血供，多數研究[40-42]證實了其可行性。 Kahramangil等[43]對NIRAF與ICG進行比較發現，82%的患者使用NIRAF檢測甲狀旁腺的時間早于肉眼，而使用ICG僅有14%檢測甲狀旁腺的時間早于肉眼。Noltes 等[44]近年提出集成標準化和量化的ICG血管造影工作流模型來客觀評估組織灌注，可極大地避免術者的主觀性，并在預測甲狀旁腺功能損害方面有一定可行性，但此方法非術中實時監測是其缺陷。NIRAF可以識別甲狀旁腺，而激光散斑對比成像可以評估甲狀旁腺的血供，有學者提出了將兩技術結合的成像設備即甲狀旁腺散斑和自體熒光成像儀（the parathyroid speckle and autofluorescence imager，ParaSPAI），可取長補短，但需要更大的臨床樣本驗證其可行性[45]。缺點五：NIRAF存在假陽性及假陰性可能，假陽性可能與甲狀腺膠質結節和棕色脂肪有關。De Leeuw等[25]在近紅外光下觀察到3例甲狀腺組織中存在亮點的假陽性結節，經組織學檢查證實為膠體結節；然而唯一1例假陰性結節是自體熒光較差的甲狀旁腺。
此外，由于60%的標本甲狀旁腺組織與非甲狀旁腺組織的亮度強度存在重疊，有研究者[10]認為，NIRAF似乎不能完全替代術中冰凍切片。對于NIAFR能否區分正常與病理的甲狀旁腺，這一結論未達成統一，還需進一步探討。
7 小結及未來展望
NIRAF在早期定位甲狀旁腺可減少不必要的解剖，在較好地保護其血運的同時降低喉返神經損傷的風險，提高手術安全性。對于正常與病理狀態下的甲狀旁腺，多數研究指出NIRAF技術可能做出一定區分；同時可在甲狀腺切除標本上識別誤切的甲狀旁腺，以減少甲狀旁腺被意外切除丟失的發生率。但組織穿透深度較淺、使用時需關閉手術室燈光、無法判斷血運是其存在缺陷。對于術者來說將NIRAF與肉眼觀察相結合，可更好地幫助對甲狀旁腺的識別。
綜上所述，NIRAF作為新興技術顯示出了巨大的潛力，未來仍需關于甲狀旁腺自體熒光的機制研究及相關設備改進如改為頭戴式以解放雙手、廣泛應用于腔鏡手術等，以更好地應用于甲狀腺及甲狀旁腺相關手術。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明： 楊曉晴整理文獻并撰寫文章，鄭海濤教授進行論文起草撰寫指導，王正寨和林溪源收集相關文獻并進行整理。
近年來甲狀腺癌發病率逐漸增高，是增長速度最快的惡性腫瘤[1]，甲狀旁腺的損傷仍是一項難題，據報道術后暫時性及永久性甲狀旁腺功能減退（簡稱甲旁減）的發生率分別為19%～38%和0.0%～3%[2]。術中甲狀旁腺不易與脂肪組織、淋巴結和異位胸腺相區別；此外，隨著解剖程度的增加，醫源性甲狀旁腺損傷和意外切除發生率也隨之增高[3-4]。目前，術中識別甲狀旁腺的方法包括肉眼識別、亞甲藍正顯影、納米碳負顯影、術中快速冰凍病理檢查、甲狀旁腺穿刺洗脫液、免疫膠體金等，但術中無法對甲狀旁腺進行實時定位。甲狀旁腺近紅外熒光成像（near-infrared fluorescence，NIRF）技術包括外源性熒光成像技術和近紅外自體熒光成像（near-infrared autofluorescence imaging，NIRAF）技術。在外源性熒光成像技術中應用于熒光顯像的外源性熒光物質是5-氨基乙酰丙酸和吲哚菁綠（indocyanine green，ICG），該方法識別甲狀旁腺的敏感度不高，且存在ICG過敏風險，因此術中使用受限。而NIRAF是在不使用外源性熒光物質的情況下應用近紅外光照射組織，激發組織內固有的內源性熒光團產生區別于甲狀腺等其他組織的更強的熒光。 近年來NIRAF較多用于術中識別甲狀旁腺，筆者現就NIRAF相關內容綜述如下。
1 NIRAF的發展歷程
Das等[5]于2006年首次描述甲狀旁腺在830 nm近紅外光照射下可出現自體熒光；Paras等[6]于2011年證實了甲狀旁腺的這種特性。2013年McWade等[7]證實了其定位甲狀旁腺的可靠性，通過NIRAF方法在45例患者中甲狀旁腺檢出率達100%。Hyun等[8]隨后也發現近紅外熒光在豬和鼠中識別甲狀旁腺的高度特異性。自2011年相關商業設備不斷開發，2018年美國食品和藥物管理局批準了兩種實時甲狀旁腺識別系統，其中一種是Fluobeam影像系統（法國），透明滅菌材料包裹，非接觸式提供圖像，但需關閉手術室燈光[9-10]。另一種是PTeye（美國），其在探頭接觸組織時提供數值（類似于神經監測），但不提供圖像，這是近期批準的設備，該設備是甲狀旁腺眼（parathyroid eye）的縮寫，是基于探針NIRAF檢測系統作為無標記術中識別甲狀旁腺的輔助工具。有研究者[11]發現，基于探針的檢測準確性高于基于圖像的檢測，但目前對其研究較少[12-13]。
2 NIRAF顯像機制
甲狀腺及甲狀旁腺在822 nm處僅顯示1個發射峰，表明自體熒光是甲狀腺和甲狀旁腺中均存在的單一天然熒光團。熒光團的特性目前尚不清楚，結構分析表明此熒光團主要存在于細胞質細胞器中，熒光團的分子量約為15×103，相對耐熱和具有抗蛋白酶活性[14]。研究[15-17]認為，熒光團可能在甲狀旁腺中高度表達，在甲狀腺中低表達而在周圍組織中不存在，甲狀旁腺的近紅外自體熒光可能與鈣敏感受體或維生素D受體有關。鈣敏感受體表達在甲狀旁腺細胞中最高，甲狀腺C細胞最少，而在肌肉、脂肪或頸部淋巴結中沒有表達，這解釋了自體熒光在甲狀旁腺及甲狀腺中熒光強度存在的原因[7]。此外還發現，鈣敏感受體或維生素D受體在原發性甲狀旁腺功能亢進（簡稱甲旁亢）中較正常甲狀旁腺有輕微減少，而在繼發性甲旁亢中則顯著減少[15, 17]。McWade等[16]同樣證實鈣敏感受體表達在甲旁亢患者中下調，這與其較低熒光強度是一致的；同時研究者還對人體高表達鈣敏感受體的腎臟和結腸進行了近紅外熒光測量，發現結腸和腎臟在822 nm處發出具有相同峰值的熒光且熒光強度與甲狀旁腺信號的強度相同。此外，對于在甲狀旁腺中存在的其他物質如分泌顆粒、卟啉衍生物的前體或副產物等是否可能造成甲狀旁腺的自體熒光，同樣也不應被忽視。
2016年McWade團隊[17]提出自體熒光還可能與甲狀旁腺細胞密度差異、脂肪組織含量、主細胞和嗜酸細胞不同比例及增生模式有關，對繼發性甲旁亢患者高低熒光信號甲狀旁腺行組織病理學分析發現：低熒光強度的甲狀旁腺顯示彌漫性主細胞增生伴小葉擴張、纖維化，脂肪占比少；較高熒光強度甲狀旁腺的彌漫性增生主細胞顯示出水樣透明細胞和嗜酸性細胞；同時該團隊認為甲狀旁腺及甲狀腺中存在的假膠體及其脂肪含量的差異也可能在自體熒光中起作用。 Ladurner等[18]發現，高身體質量指數（body mass index， BMI）患者中基質脂肪的增加可能是熒光信號變弱的原因；而Falco等[19]通過組織學檢查發現正常甲狀旁腺脂肪與細胞占比分別為61%和39%，甲狀旁腺腺瘤脂肪和細胞占比分別為37%和63%，甲狀旁腺腺瘤的高強度熒光可能與病理性腺體的細胞數量增加和脂肪占比減少有關。
目前關于鈣敏感受體和維生素D受體在NIRAF中的作用被多數人接受，但具體機制不詳，仍是未來究熱點方向；其余因素尚無統一定論，需進一步探討。
3 NIRAF強度影響因素
據報道甲狀旁腺的熒光強度是甲狀腺的1.2～29倍不等，關于NIRAF能否區分正常及病理甲狀旁腺，目前尚無共識[6-7, 20]。有研究[16-17, 21-23]認為，甲狀旁腺的疾病狀態對于熒光強度有顯著影響，正常甲狀旁腺熒光強度高于原發性甲旁亢，繼發性甲旁亢熒光強度最弱，甲狀腺顯示出微弱的熒光強度；但少數研究者[19, 24]認為，原發性甲旁亢的甲狀旁腺熒光強度顯著高于正常甲狀旁腺；也有研究者[6-7, 18, 25-26]認為自體熒光強度與甲狀旁腺病理狀態無關。此外，將甲狀旁腺整塊切除并用甲醛固定后仍檢測到熒光持續存在，甚至甲狀旁腺體外自體熒光的平均值顯著高于原位自體熒光，推測自體熒光強度不受其他因素影響且與血供無關[19, 25, 27]。
McWade等[17]認為，高BMI、甲旁亢、低維生素D和高鈣水平患者其甲狀旁腺自體熒光強度較低，與年齡、性別、種族和甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）水平無關。Falco等[24]發現，甲狀旁腺熒光強度僅取決于暴露的組織，與年齡、性別、組織病理學診斷、BMI、甲狀旁腺大小及位置無關。殷德濤團隊[28]發現，甲狀旁腺自體熒光強度僅與疾病類型相關。Ladurner等[18]認為，甲狀旁腺由于嵌入脂肪組織，可致自體熒光強度降低。但有研究者[29]提出相反的觀點，當上甲狀旁腺被脂肪或結締組織覆蓋顯示為高強度熒光；當下甲狀旁腺被血管覆蓋顯示低強度熒光，這種自體熒光強度的差異可能是血液中某些成分（如血紅蛋白）在780 nm波長范圍內對激活光能的吸收較脂肪或結締組織更高所致。此外，探針接觸壓力、探頭與手術場距離與甲狀旁腺熒光強度呈反比[16-17, 30]。甲狀旁腺自體熒光強度還易受到環境光、背景光、熒光團局部濃度、局部照明強度、光程、組織的幾何形狀等的影響[10, 30]。Squires等[27]還發現原位甲狀旁腺與甲狀腺自體熒光的比值及差值均與甲狀旁腺的質量和體積增加相關，與術前血清PTH無關。
目前關于影響甲狀旁腺熒光強度相關因素尚無統一結論，未來需加大臨床樣本量來進一步驗證和明確。
4 NIRAF國內外研究現狀
近年來隨著NIRAF這一技術的出現，其更多地被應用于甲狀腺及甲狀旁腺相關手術中。McWade等[16]發現，無論疾病狀態如何，在6例患者中通過NIRAF技術檢測出100%的甲狀旁腺。隨后該團隊[17]于2016年對137例患者的264個甲狀旁腺研究發現，NIRAF技術對良性甲狀腺疾病、原發性及三發性甲旁亢患者的甲狀旁腺檢測的準確率均為100%，分化型甲狀腺癌準確率為98%，對于同時患有甲狀旁腺和甲狀腺疾病的準確率為94%，然而對腎性繼發性甲旁亢檢測的準確率降至54%，可能與繼發性甲旁亢細胞增生的模式及脂肪含量有關。Kim 等[29]收集8例甲狀腺乳頭狀癌患者的16個正常甲狀旁腺，所有甲狀旁腺都被檢測到，被結締組織或血管覆蓋的甲狀旁腺也可檢測到熒光。 Falco等[19]對28例手術患者應用NIRAF 技術，所有甲狀旁腺均被識別且均未發生術后低鈣血癥或其他手術并發癥。 隨后Falco等[24]再次對74例患有不同的甲狀腺和甲狀旁腺疾病患者展開研究，應用NIRAF識別的甲狀旁腺數量明顯增加且與年齡、性別或組織病理學類型無關；對于甲狀腺炎患者NIRAF識別甲狀旁腺相較于白光識別作用尤其顯著，但不足是缺乏對組織的病理活檢。Ladurner等[14]研究發現，NIRAF識別甲狀旁腺的敏感度為90%（37/41），其中在2例患者中，應用NIRAF技術有助于在中央淋巴結清掃過程中識別和保存尾側甲狀旁腺。在原發性甲旁亢患者的手術中，術者肉眼識別到類似甲狀旁腺腺瘤的結構，但NIRAF沒有自體熒光，經組織學檢查證實為甲狀腺組織[18]，對于存疑的甲狀旁腺，NIRAF表現出一定的可靠性。
Kose等[31]發現，術中98%的甲狀旁腺存在自體熒光，23%的甲狀旁腺在術者視覺識別前使用了NIRAF技術予以識別；而在甲狀旁腺疾病和術前定位陰性的患者中，21%的異常腺體在視覺識別之前通過NIRAF技術予以識別。NIRAF技術預測甲狀旁腺的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為98.5%、97.2%、95.1%和99.1%。Kim等[11]對1 198例患者的meta分析發現，NIRAF的敏感度、特異度、陰性預測值和陽性預測值分別為0.969 3、0.924 8、0.951 7和0.948 8。De Leeuw等[25]在28例患者體外樣本研究中發現，NIRAF的敏感度和特異度分別為 94.1%和80%，同時對35例患者的術中甲狀旁腺樣本檢出的敏感度為98.8%；在14例術中存疑的病例中，使用NIRAF后甲狀旁腺得以確認；在最初肉眼無法識別甲狀旁腺的5例患者中，這些甲狀旁腺后來在近紅外成像的幫助下被發現且均經病理學檢查予以證實。 Kahramangil等[32]發現，在210例患者中46%的甲狀旁腺肉眼識別困難，但應用NIRAF可輕松發現甲狀旁腺且無需解剖。Benmiloud等[33]也有同樣的發現：68%患者的甲狀旁腺在肉眼識別之前可通過NIRAF得以識別，且術后低鈣血癥發生率從20.9%下降到5.2%。Dip等[34]對170例患者的隨機對照研究發現，從白光肉眼到NIRAF的轉換使甲狀旁腺的探查數量從2.6個增加到3.5個； 67.1%的患者從白光肉眼轉換到NIRAF可發現多于1個的額外甲狀旁腺，并明顯降低術后嚴重低鈣血癥發生率。Kim等[35]將自體熒光探查細化分為P1、P2和P3 3個階段：P1階段是術者未分離進行甲狀旁腺自體熒光探查，P2階段是分離及肉眼識別后進行探查，當在P1或P2階段未檢測到甲狀旁腺時，從切除的手術標本中進行P3階段的探查。 92.8%（64/69）的甲狀旁腺在P1階段得以定位，5.8%（4/69）在P2階段得以定位，P3階段為 1.4%（1/69）；在進行解剖暴露后，P1階段5個陰性甲狀旁腺中有4個甲狀旁腺被識別，可能由于甲狀旁腺所在位置深度超出近紅外光穿透深度所致。在該研究中，只有1例（1.4%）甲狀旁腺被意外摘除且在P3階段發現。總之P1、P2和P3階段甲狀旁腺定位的敏感度、特異度和準確性均為100%。
盡管Paras等[6]的最初工作是針對甲狀腺手術，但此技術也可用于甲旁亢手術，有助于術中甲狀旁腺的定位。Squires等[27]對59例原發性甲旁亢患者使用NIRAF并應用Image J軟件量化熒光強度。該方法檢測甲狀旁腺的敏感度為87%，術中甲狀旁腺識別平均值從4.1個提高到4.4個。Wolf等[36]發現NIRAF在原發性甲旁亢的敏感度和陽性預測值分別為90%和93%，在繼發性甲旁亢的敏感度和陽性預測值分別為83%和100%。目前國內外研究顯示出NIRAF在甲狀腺及甲狀旁腺手術中的優越性，更利于術中甲狀旁腺識別，并在一定程度上可降低術后并發癥的發生率。
5 NIRAF的優點
術前甲狀旁腺的定位方法如核素顯像、超聲等僅在甲狀旁腺功能高度活躍時有效，對于正常甲狀旁腺作用甚微[6]。術中冰凍切片準確性高但有致血運受損的風險；術中細針穿刺洗脫液PTH測定具有侵襲性；近期發現甲狀旁腺術中懸浮組織標本的天冬氨酸轉氨酶與乳酸脫氫酶的比率對甲狀旁腺組織具有很高的敏感度和特異度[37]，但以上3種方法均需時間等待且無法實時定位甲狀旁腺，而術中實時可視化甲狀旁腺的方法如ICG熒光成像，但該技術需要注入染料，存在致敏風險。相比之下，NIRAF作為一種非侵入性、實時、無需切除組織、不依賴任何靜脈染料的新興技術，其檢測甲狀旁腺的敏感度和特異度高于所有其他方法[7]，以上是其中的優點之一。 優點二，此技術可以消除術者判斷的模糊性，對于肉眼遺漏的甲狀旁腺起到輔助識別作用[25]。 在切除側葉后使用此技術檢查氣管旁區域可能有助于在解剖的早期階段識別位置異常的甲狀旁腺[29]。優點三，對于二次手術或者甲狀腺炎的患者，由于手術瘢痕及慢性炎癥使得肉眼識別甲狀旁腺更加困難，術中NIRAF技術的使用可事先識別甲狀旁腺，尋找其潛在的血液供應來源，并更仔細地解剖以便將其留在原位[27]。Thomas等[13]于2019年提出“PTeye”設備，PTeye是一種手持光纖探針實時識別甲狀旁腺設備，使用時無需關閉手術室燈光，可識別98%的甲狀旁腺。該團隊認為由于近紅外光下觀察到的解剖結構傳輸到顯示器上存在一定誤差，提出一種疊加組織成像系統（overlay tissue imaging system，OTIS）。該系統收集組織NIRAF信號，并將圖像直接投影到手術野上，無需顯示器，從而為甲狀旁腺的信號提供真實的空間背景，減少術者將遠程顯示器上的NIRAF圖像與真實手術視野相關聯的繁瑣步驟。PTeye手持式探頭可以輕松定位并進行NIRAF測量，但PTeye不能提供甲狀旁腺周圍結構的空間信息是其缺陷，目前該設備仍處于開發階段。Kiernan等[12]發現，PTeye的準確率、陽性預測值和陰性預測值分別為 94.3%、 93.0%及100%。
此外，甲狀旁腺受損致低鈣血癥臨床上并不少見。Benmiloud等[38]研究發現，NIRAF 組術后暫時性低鈣血癥發生率為 9.1%（11/121），對照組為 21.7%（26/120）；永久性低鈣血癥發生率NIRAF組為 0.0%，對照組為 1.6% （2/120）。使用 NIRAF可減少術中意外切除的甲狀旁腺數量、降低甲狀旁腺自體移植概率，降低術后低鈣血癥的風險。
6 NIRAF的缺點
盡管許多研究證實NIRAF對于術中甲狀旁腺的識別有較高的準確率和敏感度，但還存在以下不足。缺點一：NIRAF要求術中反復關閉手術室燈光[6, 16, 23]，盡管有研究者提出新型設備使用時無需關閉手術室燈光，但尚在研發中，未廣泛開展使用[13]。缺點二：對于操作者來說，圖像捕捉時間長短不一且熒光強度受到探針壓力、操作距離及其他組織覆蓋等情況的影響，個體操作差異性大[7,16, 34]。但有研究者認為，甲狀旁腺在被氣管旁結締組織或血管脂肪組織遮蓋的情況下，當肉眼無法檢測到腺體時，仍然可以通過NIRAF檢測甲狀旁腺，其敏感度為92.75%[29, 35]。此外，同一個甲狀旁腺的單獨測量值可能會有所不同，每個甲狀旁腺至少需要測量3次，多次測量可減少術中各種因素所致的誤差[32]。缺點三：近紅外波長穿透深度約2～3 mm，由于穿透深度限制，不應將其作為“導航工具”，更不能替代術者的仔細分離，NIRAF在組織穿透能力方面有待進一步提高[25, 31, 39]。缺點四：NIRAF無法評估甲狀旁腺的血液灌注是其另一大弊端[19, 32-33]，目前較多采用ICG血管造影判斷甲狀旁腺血供，多數研究[40-42]證實了其可行性。 Kahramangil等[43]對NIRAF與ICG進行比較發現，82%的患者使用NIRAF檢測甲狀旁腺的時間早于肉眼，而使用ICG僅有14%檢測甲狀旁腺的時間早于肉眼。Noltes 等[44]近年提出集成標準化和量化的ICG血管造影工作流模型來客觀評估組織灌注，可極大地避免術者的主觀性，并在預測甲狀旁腺功能損害方面有一定可行性，但此方法非術中實時監測是其缺陷。NIRAF可以識別甲狀旁腺，而激光散斑對比成像可以評估甲狀旁腺的血供，有學者提出了將兩技術結合的成像設備即甲狀旁腺散斑和自體熒光成像儀（the parathyroid speckle and autofluorescence imager，ParaSPAI），可取長補短，但需要更大的臨床樣本驗證其可行性[45]。缺點五：NIRAF存在假陽性及假陰性可能，假陽性可能與甲狀腺膠質結節和棕色脂肪有關。De Leeuw等[25]在近紅外光下觀察到3例甲狀腺組織中存在亮點的假陽性結節，經組織學檢查證實為膠體結節；然而唯一1例假陰性結節是自體熒光較差的甲狀旁腺。
此外，由于60%的標本甲狀旁腺組織與非甲狀旁腺組織的亮度強度存在重疊，有研究者[10]認為，NIRAF似乎不能完全替代術中冰凍切片。對于NIAFR能否區分正常與病理的甲狀旁腺，這一結論未達成統一，還需進一步探討。
7 小結及未來展望
NIRAF在早期定位甲狀旁腺可減少不必要的解剖，在較好地保護其血運的同時降低喉返神經損傷的風險，提高手術安全性。對于正常與病理狀態下的甲狀旁腺，多數研究指出NIRAF技術可能做出一定區分；同時可在甲狀腺切除標本上識別誤切的甲狀旁腺，以減少甲狀旁腺被意外切除丟失的發生率。但組織穿透深度較淺、使用時需關閉手術室燈光、無法判斷血運是其存在缺陷。對于術者來說將NIRAF與肉眼觀察相結合，可更好地幫助對甲狀旁腺的識別。
綜上所述，NIRAF作為新興技術顯示出了巨大的潛力，未來仍需關于甲狀旁腺自體熒光的機制研究及相關設備改進如改為頭戴式以解放雙手、廣泛應用于腔鏡手術等，以更好地應用于甲狀腺及甲狀旁腺相關手術。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明： 楊曉晴整理文獻并撰寫文章，鄭海濤教授進行論文起草撰寫指導，王正寨和林溪源收集相關文獻并進行整理。