引用本文： 王振順, 劉召波, 林棟棟, 李寧. 肝移植聯合腺病毒介導的單純皰疹病毒胸苷激酶/更昔洛韋治療肝細胞癌的研究探索. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(1): 53-59. doi: 10.7507/1007-9424.202208040 復制
肝移植（liver transplantation，LT）是肝細胞癌（下文簡稱“肝癌”）治療的有效手段，然而供體的短缺制約了其發展。目前許多國家或地區在米蘭標準基礎上通過總結臨床實踐提出了符合自身實際情況的肝癌LT受體選擇標準，為更多超米蘭標準的肝癌患者提供了LT手術的機會[1-2]。然而盲目地擴大LT入選標準也導致了術后復發率的增高[3-4]，無法保證LT患者得到長期生存。因此，亟需有效的肝癌LT后的輔助治療手段。腺病毒介導的單純皰疹病毒胸苷激酶（adenovirus-mediated delivery of herpes simplex virus thymidine kinase，ADV-TK）/更昔洛韋（ganciclovir，GCV）治療作為自殺基因療法的一種，能夠通過直接殺傷效應和旁觀者效應消滅腫瘤病灶。目前已有研究者[5-6]將ADV-TK/GCV應用于多種惡性腫瘤（包括肝癌）的輔助治療，其有效性和安全性得到了證實。本研究團隊也已于2007年開始將ADV-TK/GCV用于LT患者的治療，特別是對于那些超出米蘭標準[7]的肝癌患者。本研究通過分析本研究團隊前期進行的前瞻性研究的數據，評估LT聯合ADV-TK/GCV（LT+ADV-TK/GCV）治療肝癌患者的療效，同時分析影響肝癌LT患者術后長期總生存和無復發生存的高危因素，試著提出LT+ADV-TK/GCV治療的肝癌患者的選擇標準，以期能擴大目前臨床應用的肝癌LT標準，使更多患者通過LT+ADV-TK/GCV治療獲得長期生存。
1 資料與方法
1.1 研究隊列及入排標準
本研究團隊于2007年開始將ADV-TK/GCV用于LT患者的治療，研究遵照赫爾辛基宣言進行，基于“十一五” “十二五” “十三五”國家科技重大專項項目進行患者招募及臨床治療隨訪，研究方案經醫院倫理委員會批準，方法按照醫院倫理委員會批準的方案進行。所有患者在入選研究前均知情并簽署了書面知情同意書。本研究對此前進行的前瞻性隊列研究進行回顧性分析。納入從2007年至今于首都醫科大學附屬北京佑安醫院進行LT并在首都醫科大學宣武醫院及首都醫科大學附屬北京佑安醫院進行隨訪的216例肝癌LT患者。
LT患者的入組標準：① 經術前臨床放射影像學診斷肝癌；肝癌的數量、大小、位置不限，可伴血管侵犯但不能超過門靜脈主干上1/2，可伴區域淋巴結轉移但需無遠處轉移；② 年齡18～75歲；③ 性別不限；④ 意識清醒，無明顯認知障礙；⑤ 其他器官功能狀態符合LT手術條件；⑥ 自愿參加并簽署書面知情同意書。
排除標準：若患者符合以下任一標準則不能入組：① 伴有肝外臟器轉移病灶；② 伴有心、肺等其他臟器系統手術禁忌證；③ 嚴重凝血機制障礙、有出血傾向，凝血指標檢查異常（凝血酶原活動度≥50%）；④ 已知對腺病毒、GCV或同類制劑過敏；⑤ 入組后計劃其他抗腫瘤藥物治療或臨床試驗者；⑥ 人類免疫缺陷病毒感染者；⑦ 采用乙型肝炎表面抗原（+）或丙型肝炎抗體（+）的供體；⑧ 研究者判定不適合參加本研究者。
1.2 研究設計及治療流程
所有入組患者在排除LT手術禁忌后由同一手術團隊完成同種異體原位LT手術，并且規律口服標準的三聯免疫抑制劑方案（他克莫司或環孢菌素+嗎替麥考酚酯+類固醇激素）。LT+ADV-TK/GCV組在術中及術后接受2次1×1012 U病毒顆粒的ADV-TK（天達康公司，深圳，中國）的治療（藥物專利，專利號為ZL98124960.4），該藥的有效性和安全性已經得到了廣泛證實[8]。ADV-TK于關腹前局部注射，為保證ADV-TK達到最佳治療效果，用100 mL生理鹽水將1×1012 U病毒顆粒的ADV-TK溶解后，其中60 mL注射在肝周圍腹膜組織，40 mL經胃網膜右靜脈給藥。術后第36 h時開始靜脈輸入GCV（劑量為5 mg/kg，1次/12 h，連續輸入14 d）；第2次為術后第30天，ADV-TK（1×1012 U病毒顆粒的ADV-TK溶解于100 mL的生理鹽水）經股動脈穿刺腹腔干動脈內注射60 mL，腸系膜上動脈內注射 40 mL，ADV-TK注射后第36 h開始靜脈輸入GCV（劑量為 5 mg/kg，1 次/12 h，連續輸入14 d）。
1.3 隨訪及觀察指標
入組患者的隨訪在門診進行，術后3個月內每個月復查1次，然后每3個月復查1次，直到術后第3年；3年后至少每6個月復查1次，隨訪至術后第5年。記錄LT患者術后5年累積生存率、中位總生存時間、總生存率及無復發生存率。
1.4 統計學方法
采用SPSS統計軟件（Windows 22.0）對數據統計分析。符合正態分布的計量資料采用平均值±標準差（
±s）描述且用獨立樣本比較的t檢驗，不符合正態分布的計量資料采用中位數（median，M）和上下四分位數（P25，P75）描述且比較用Mann-Whitney U檢驗，計數資料采用率或構成比描述且比較用成組卡方檢驗。采用Kaplan-Meier方法繪制總體患者及亞組（符合米蘭標準及超米蘭標準患者）的生存曲線進行生存分析并采用log-rank檢驗或landmark檢驗。多因素分析采用Cox回歸模型，將單因素分析中有統計學意義的變量或基于專業知識判斷可能有臨床意義的因素納入多因素分析以篩選危險因素 ［年齡，性別，LT術前Child-Pugh分級、肝癌TNM分期（參照美國癌癥聯合委員會第8版分期）、最大腫瘤直徑、腫瘤數目、累積腫瘤直徑、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平、分化程度、是否伴隨血管侵犯，是否聯合ADV-TK/GCV治療］ 納入回歸方程，采用Cox回歸向后Wald方法進行檢驗，確定影響LT術后5年總生存率和無復發生存率的危險因素，結果用風險比（hazard ratio，HR）以及相應的95%置信區間（confidence interval，CI）描述。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 本研究納入患者的基本情況
本研究共納入216例患者，進行標準的治療和隨訪，隨訪時間1～60個月、（28.6±20.4）個月。其中單純LT組134例，LT+ADV-TK/GCV組82例，2組患者的一般情況及腫瘤相關基線數據見表1，2組患者的年齡、性別、術前肝功能、腫瘤分期等基線水平相近（P>0.05）。單純LT組中符合米蘭標準和超米蘭標準患者分別為33例和101例，而LT+ADV-TK/GCV組符合米蘭標準和超米蘭標準患者分別為21例和61例，符合和超米蘭標準肝癌患者的單純LT組和LT+ADV-TK/GCV組的基線資料比較差異均無統計學意義（P>0.05），見表2。所有患者在用藥過程中僅出現發熱和輕中度局部注射部位疼痛反應，未見其他藥物相關的Ⅱ度及以上不良反應。
表1
全部LT患者中單純LT組和LT+ADV-TK/GCV組的基本情況比較結果
表2
符合和超米蘭標準LT患者中單純LT組和LT+ADV-TK/GCV組的基本情況比較結果
2.2 單純LT組和LT+ADV-TK/GCV組肝癌患者的生存分析
對于所有肝癌患者，LT組和LT+ADV-TK/GCV組患者的5年累積總生存率分別為52.9%和48.5%，5年累積無復發生存率分別41.5%和44.5%，2組的總生存情況和無復發生存情況比較差異均未見有統計學意義（5年累積總生存率：log-rank檢驗，χ2=3.14，P=0.08；5年累積無復發生存率：landmark檢驗，術后27個月為界，P=0.91和P=0.56），見圖1a、1b。
圖1
示單純LT組與LT+ADV-TK組的總生存及無復發生存曲線
a、b：分別為總體肝癌患者的總生存（a）和無復發生存（b）曲線；c、d：分別為符合米蘭（c）和超米蘭（d）標準肝癌患者的總生存曲線；e、f：分別為符合米蘭（e）和超米蘭（f）標準肝癌患者的無復發生存曲線
對于符合米蘭標準的肝癌患者，LT組和LT+ADV-TK/GCV組患者的5年累積總生存率分別為86.9%和92.7%，2組的總生存情況比較差異無統計學意義（log-rank檢驗，χ2=1.53，P=0.22），見圖1c；超過米蘭標準的肝癌患者，LT組和LT+ADV-TK/GCV組患者的5年累積總生存率分別為35.0%和50.7%，LT+ADV-TK/GCV組的總生存情況優于LT組（log-rank檢驗，χ2=4.11，P=0.047），見圖1d。
隨著時間的推移，LT組和LT+ADV-TK/GCV組的無復發生存率差異增大，2條生存曲線發生交叉需進行landmark分析。對于符合米蘭標準的肝癌患者，以LT術后10個月為界進行landmark分析，0～10個月時及10～60個月時，2組的無復發生存情況比較差異均無統計學意義（P=0.82和P=0.60），見圖1e；對于超過米蘭標準的肝癌患者，以LT術后27個月為界進行landmark分析，0～27個月時及27～60個月時，2組的無復發生存情況比較差異均無統計學意義（P=0.46；P=0.06），見圖1f。
2.3 影響肝癌患者LT術后生存情況的危險因素結果
對所有肝癌患者的總生存率及無復發生存率進行單因素分析（表3）結果顯示，肝癌患者的年齡、TNM分期、最大腫瘤直徑、腫瘤分化程度、累積腫瘤直徑、有無血管癌栓、術前血清AFP水平及是否超米蘭標準與肝癌患者LT術后5年總生存率有關（P＜0.05），與肝癌患者LT術后5年無復發生存率有關的因素包括年齡、性別、TNM分期、最大腫瘤直徑、累積腫瘤直徑、腫瘤數目、有無血管癌栓、術前血清AFP水平及是否超米蘭標準（P＜0.05）。
表3
影響216例肝癌患者LT后5年總生存率和5年無復發生存率的單因素分析結果
以5年總生存率為目標的Cox回歸模型分析（表4）的結果顯示，隨著患者的累積腫瘤直徑變大及TNM分期越晚（≥Ⅲb 期），LT后死亡風險越高（P<0.05），并且術前血清AFP水平>400 μg/L的患者LT后死亡風險越高（P<0.05），同時發現聯合ADV-TK/GCV治療能降低LT患者術后死亡風險（P<0.05）。
表4
影響肝癌患者LT后5年總生存率和無復發生存率的Cox回歸多因素分析結果
以5年無復發生存率為目標的Cox回歸模型（表4）的結果顯示，隨著患者年齡增大、累積腫瘤直徑變大以及TNM分期越晚（Ⅲa、≥Ⅲb期）的患者，LT術后復發風險越高（P<0.05），而未發現聯合ADV-TK/GCV治療對肝癌LT后復發的影響（P>0.05）。
3 討論
近年來，為了保證LT的肝臟供體得到最合理的分配，必須制定合適的LT患者的入選標準。1996年針對早期肝癌患者的米蘭標準被提出用于篩選LT受者[9]。符合米蘭標準的LT患者5年生存率超過70%，但也因此大部分患者被排除在了LT之外，從而失去了治愈腫瘤的機會。國內學者[10-11]先后提出了杭州標準、復旦標準等，但盲目地擴大米蘭標準也導致了LT術后復發率明顯上升[12]。
影響LT術后肝癌復發和長期生存的因素很多[13]。本研究中采用Cox回歸多因素分析結果發現，患者的年齡、術前累積腫瘤直徑及腫瘤TNM分期影響LT術后肝癌復發，而影響肝癌患者LT術后長期總生存的危險因素包括患者的累積腫瘤直徑、術前TNM分期、術前血清AFP>400 μg/L以及是否聯合ADV-TK/GCV治療，其中聯合ADV-TK/GCV治療的患者LT術后長期生存可能性更大，而肝癌的累積直徑越大、TNM分期晚、術前血清AFP>400 μg/L的患者LT術后長期生存的可能性更小（P<0.05）。
肝癌LT術后復發的防控以全身抗腫瘤治療為主[14-15]，目前常用的輔助治療有哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑[16]、化學藥物治療、靶向藥物治療等[17-18]，對于超米蘭標準的肝癌LT患者一般推薦輔助化學藥物治療和靶向治療。但是全身化學藥物治療具有較大的毒副作用如骨髓抑制、肝腎毒性等，同時在早期病例的對照研究[19]中發現，對肝癌LT患者采用全劑量靶向治療藥物索拉非尼輔助治療，其耐受性較差，但當減量治療后可降低LT患者術后腫瘤復發率，提高1年無瘤生存率和總生存率。在實際臨床工作中，索拉非尼主要用于肝癌復發后的治療，以延長復發患者的總生存時間，然而LT患者往往無法耐受常規治療劑量，通常需要減量，但會因此達不到理想的治療效果[20]。新興的免疫治療目前仍處于臨床試驗階段，其作用機制和臨床評價仍需要進一步的研究證實[21-22]。因此，肝癌治療迫切需要一種有效的新型輔助腫瘤治療手段來降低肝癌LT術后復發轉移率。目前隨著現代分子醫學的進展，開拓了肝癌的基因治療新領域，通過在基因層面進行操作和干預，以達到治療疾病的目的。本研究團隊目前采用的自殺基因系統為ADV-TK/GCV，其作用原理是用腺病毒為載體，將胸苷激酶基因轉染到腫瘤細胞中，其表達產物可以將抗皰疹病毒前藥GCV轉化為具有細胞毒性的三磷酸核苷，并與腫瘤細胞內復制產生的DNA鏈結合干擾DNA合成，從而直接殺傷腫瘤細胞[23]，其病毒載體腺病毒在體內分布時具有明顯的噬肝性且能高效轉染肝細胞[24]；此外，ADV-TK還可發揮“旁觀者效應”，極大地增強殺傷腫瘤細胞的效能。目前ADV-TK/GCV治療及同類基因制劑已被廣泛應用于臨床惡性腫瘤的治療中，并且已經顯示了比較好的臨床療效。國內有研究者[25]將輔助性ADV-TK/GCV應用于肝癌LT領域的研究發現，在不伴有大血管侵犯的肝癌患者中，LT+ADV-TK/GCV組患者的生存情況優于單純LT組；同時有研究者[26]探索了加大ADV-TK/GCV治療劑量的效果，對不伴有大血管侵犯LT患者能明顯改善治療效果，而對于伴有門靜脈主要分支受侵的LT患者治療效果改變不明顯。提示，在合并血管侵犯（包括門靜脈主干及大分支、肝靜脈、下腔靜脈）的肝癌患者，ADV-TK并不能明顯改善預后。關于ADV-TK腫瘤局部注射后的主要不良反應表現為發熱（53%）和Ⅰ度流感樣反應（16%），其他不良反應發生率較低[5, 25]；而GCV連續使用后可導致輕度骨髓抑制、皮疹、消化道反應和肝功能的變化，臨床處理或不處理大多能在短期內緩解。在本研究中發現，對于超米蘭標準的LT患者，輔助ADV-TK/GCV的總生存情況優于單獨LT患者，并且未見其他藥物相關的Ⅱ度以上不良反應，但未發現它對無復發生存的影響，其原因有待進一步分析。
總之，從本研究結果及結合文獻報道結果看，LT聯合ADV-TK/GCV治療能夠改善超米蘭標準肝癌患者的預后，該治療手段的優勢在于：① LT能最大限度地減少腫瘤負荷，同時能夠治療基礎肝臟疾病；② ADV-TK/GCV治療通過直接殺傷作用和旁觀者效應能夠殺死微小轉移灶，從而減少肝癌的復發和轉移。盡管如此，本研究結論仍需要擴大樣本量來進一步進行臨床驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：李寧負責研究的設計及總體指導，林棟棟參與課題的設計、數據的匯總及文章審校工作，王振順負責數據的收集整理分析及文章撰寫，劉召波參與數據的收集、文章的修改。
倫理聲明：本研究通過了首都醫科大學宣武醫院（批文編號：KS2022080-1）及首都醫科大學附屬北京佑安醫院（批文編號：LL-2020-067-K）倫理委員會審批。
志謝：特別感謝首都醫科大學附屬北京佑安醫院普通外科中心及宣武醫院普通外科醫護人員，特別是李非、栗光明、劉東斌、武聚山、孫力波、李文磊、朱瑞東、曹柯等在患者入組、數據統計及患者隨訪過程中提供的支持和幫助。
肝移植（liver transplantation，LT）是肝細胞癌（下文簡稱“肝癌”）治療的有效手段，然而供體的短缺制約了其發展。目前許多國家或地區在米蘭標準基礎上通過總結臨床實踐提出了符合自身實際情況的肝癌LT受體選擇標準，為更多超米蘭標準的肝癌患者提供了LT手術的機會[1-2]。然而盲目地擴大LT入選標準也導致了術后復發率的增高[3-4]，無法保證LT患者得到長期生存。因此，亟需有效的肝癌LT后的輔助治療手段。腺病毒介導的單純皰疹病毒胸苷激酶（adenovirus-mediated delivery of herpes simplex virus thymidine kinase，ADV-TK）/更昔洛韋（ganciclovir，GCV）治療作為自殺基因療法的一種，能夠通過直接殺傷效應和旁觀者效應消滅腫瘤病灶。目前已有研究者[5-6]將ADV-TK/GCV應用于多種惡性腫瘤（包括肝癌）的輔助治療，其有效性和安全性得到了證實。本研究團隊也已于2007年開始將ADV-TK/GCV用于LT患者的治療，特別是對于那些超出米蘭標準[7]的肝癌患者。本研究通過分析本研究團隊前期進行的前瞻性研究的數據，評估LT聯合ADV-TK/GCV（LT+ADV-TK/GCV）治療肝癌患者的療效，同時分析影響肝癌LT患者術后長期總生存和無復發生存的高危因素，試著提出LT+ADV-TK/GCV治療的肝癌患者的選擇標準，以期能擴大目前臨床應用的肝癌LT標準，使更多患者通過LT+ADV-TK/GCV治療獲得長期生存。
1 資料與方法
1.1 研究隊列及入排標準
本研究團隊于2007年開始將ADV-TK/GCV用于LT患者的治療，研究遵照赫爾辛基宣言進行，基于“十一五” “十二五” “十三五”國家科技重大專項項目進行患者招募及臨床治療隨訪，研究方案經醫院倫理委員會批準，方法按照醫院倫理委員會批準的方案進行。所有患者在入選研究前均知情并簽署了書面知情同意書。本研究對此前進行的前瞻性隊列研究進行回顧性分析。納入從2007年至今于首都醫科大學附屬北京佑安醫院進行LT并在首都醫科大學宣武醫院及首都醫科大學附屬北京佑安醫院進行隨訪的216例肝癌LT患者。
LT患者的入組標準：① 經術前臨床放射影像學診斷肝癌；肝癌的數量、大小、位置不限，可伴血管侵犯但不能超過門靜脈主干上1/2，可伴區域淋巴結轉移但需無遠處轉移；② 年齡18～75歲；③ 性別不限；④ 意識清醒，無明顯認知障礙；⑤ 其他器官功能狀態符合LT手術條件；⑥ 自愿參加并簽署書面知情同意書。
排除標準：若患者符合以下任一標準則不能入組：① 伴有肝外臟器轉移病灶；② 伴有心、肺等其他臟器系統手術禁忌證；③ 嚴重凝血機制障礙、有出血傾向，凝血指標檢查異常（凝血酶原活動度≥50%）；④ 已知對腺病毒、GCV或同類制劑過敏；⑤ 入組后計劃其他抗腫瘤藥物治療或臨床試驗者；⑥ 人類免疫缺陷病毒感染者；⑦ 采用乙型肝炎表面抗原（+）或丙型肝炎抗體（+）的供體；⑧ 研究者判定不適合參加本研究者。
1.2 研究設計及治療流程
所有入組患者在排除LT手術禁忌后由同一手術團隊完成同種異體原位LT手術，并且規律口服標準的三聯免疫抑制劑方案（他克莫司或環孢菌素+嗎替麥考酚酯+類固醇激素）。LT+ADV-TK/GCV組在術中及術后接受2次1×1012 U病毒顆粒的ADV-TK（天達康公司，深圳，中國）的治療（藥物專利，專利號為ZL98124960.4），該藥的有效性和安全性已經得到了廣泛證實[8]。ADV-TK于關腹前局部注射，為保證ADV-TK達到最佳治療效果，用100 mL生理鹽水將1×1012 U病毒顆粒的ADV-TK溶解后，其中60 mL注射在肝周圍腹膜組織，40 mL經胃網膜右靜脈給藥。術后第36 h時開始靜脈輸入GCV（劑量為5 mg/kg，1次/12 h，連續輸入14 d）；第2次為術后第30天，ADV-TK（1×1012 U病毒顆粒的ADV-TK溶解于100 mL的生理鹽水）經股動脈穿刺腹腔干動脈內注射60 mL，腸系膜上動脈內注射 40 mL，ADV-TK注射后第36 h開始靜脈輸入GCV（劑量為 5 mg/kg，1 次/12 h，連續輸入14 d）。
1.3 隨訪及觀察指標
入組患者的隨訪在門診進行，術后3個月內每個月復查1次，然后每3個月復查1次，直到術后第3年；3年后至少每6個月復查1次，隨訪至術后第5年。記錄LT患者術后5年累積生存率、中位總生存時間、總生存率及無復發生存率。
1.4 統計學方法
采用SPSS統計軟件（Windows 22.0）對數據統計分析。符合正態分布的計量資料采用平均值±標準差（±s）描述且用獨立樣本比較的t檢驗，不符合正態分布的計量資料采用中位數（median，M）和上下四分位數（P25，P75）描述且比較用Mann-Whitney U檢驗，計數資料采用率或構成比描述且比較用成組卡方檢驗。采用Kaplan-Meier方法繪制總體患者及亞組（符合米蘭標準及超米蘭標準患者）的生存曲線進行生存分析并采用log-rank檢驗或landmark檢驗。多因素分析采用Cox回歸模型，將單因素分析中有統計學意義的變量或基于專業知識判斷可能有臨床意義的因素納入多因素分析以篩選危險因素 ［年齡，性別，LT術前Child-Pugh分級、肝癌TNM分期（參照美國癌癥聯合委員會第8版分期）、最大腫瘤直徑、腫瘤數目、累積腫瘤直徑、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平、分化程度、是否伴隨血管侵犯，是否聯合ADV-TK/GCV治療］ 納入回歸方程，采用Cox回歸向后Wald方法進行檢驗，確定影響LT術后5年總生存率和無復發生存率的危險因素，結果用風險比（hazard ratio，HR）以及相應的95%置信區間（confidence interval，CI）描述。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 本研究納入患者的基本情況
本研究共納入216例患者，進行標準的治療和隨訪，隨訪時間1～60個月、（28.6±20.4）個月。其中單純LT組134例，LT+ADV-TK/GCV組82例，2組患者的一般情況及腫瘤相關基線數據見表1，2組患者的年齡、性別、術前肝功能、腫瘤分期等基線水平相近（P>0.05）。單純LT組中符合米蘭標準和超米蘭標準患者分別為33例和101例，而LT+ADV-TK/GCV組符合米蘭標準和超米蘭標準患者分別為21例和61例，符合和超米蘭標準肝癌患者的單純LT組和LT+ADV-TK/GCV組的基線資料比較差異均無統計學意義（P>0.05），見表2。所有患者在用藥過程中僅出現發熱和輕中度局部注射部位疼痛反應，未見其他藥物相關的Ⅱ度及以上不良反應。
表1
全部LT患者中單純LT組和LT+ADV-TK/GCV組的基本情況比較結果
表2
符合和超米蘭標準LT患者中單純LT組和LT+ADV-TK/GCV組的基本情況比較結果
2.2 單純LT組和LT+ADV-TK/GCV組肝癌患者的生存分析
對于所有肝癌患者，LT組和LT+ADV-TK/GCV組患者的5年累積總生存率分別為52.9%和48.5%，5年累積無復發生存率分別41.5%和44.5%，2組的總生存情況和無復發生存情況比較差異均未見有統計學意義（5年累積總生存率：log-rank檢驗，χ2=3.14，P=0.08；5年累積無復發生存率：landmark檢驗，術后27個月為界，P=0.91和P=0.56），見圖1a、1b。
圖1
示單純LT組與LT+ADV-TK組的總生存及無復發生存曲線
a、b：分別為總體肝癌患者的總生存（a）和無復發生存（b）曲線；c、d：分別為符合米蘭（c）和超米蘭（d）標準肝癌患者的總生存曲線；e、f：分別為符合米蘭（e）和超米蘭（f）標準肝癌患者的無復發生存曲線
對于符合米蘭標準的肝癌患者，LT組和LT+ADV-TK/GCV組患者的5年累積總生存率分別為86.9%和92.7%，2組的總生存情況比較差異無統計學意義（log-rank檢驗，χ2=1.53，P=0.22），見圖1c；超過米蘭標準的肝癌患者，LT組和LT+ADV-TK/GCV組患者的5年累積總生存率分別為35.0%和50.7%，LT+ADV-TK/GCV組的總生存情況優于LT組（log-rank檢驗，χ2=4.11，P=0.047），見圖1d。
隨著時間的推移，LT組和LT+ADV-TK/GCV組的無復發生存率差異增大，2條生存曲線發生交叉需進行landmark分析。對于符合米蘭標準的肝癌患者，以LT術后10個月為界進行landmark分析，0～10個月時及10～60個月時，2組的無復發生存情況比較差異均無統計學意義（P=0.82和P=0.60），見圖1e；對于超過米蘭標準的肝癌患者，以LT術后27個月為界進行landmark分析，0～27個月時及27～60個月時，2組的無復發生存情況比較差異均無統計學意義（P=0.46；P=0.06），見圖1f。
2.3 影響肝癌患者LT術后生存情況的危險因素結果
對所有肝癌患者的總生存率及無復發生存率進行單因素分析（表3）結果顯示，肝癌患者的年齡、TNM分期、最大腫瘤直徑、腫瘤分化程度、累積腫瘤直徑、有無血管癌栓、術前血清AFP水平及是否超米蘭標準與肝癌患者LT術后5年總生存率有關（P＜0.05），與肝癌患者LT術后5年無復發生存率有關的因素包括年齡、性別、TNM分期、最大腫瘤直徑、累積腫瘤直徑、腫瘤數目、有無血管癌栓、術前血清AFP水平及是否超米蘭標準（P＜0.05）。
表3
影響216例肝癌患者LT后5年總生存率和5年無復發生存率的單因素分析結果
以5年總生存率為目標的Cox回歸模型分析（表4）的結果顯示，隨著患者的累積腫瘤直徑變大及TNM分期越晚（≥Ⅲb 期），LT后死亡風險越高（P<0.05），并且術前血清AFP水平>400 μg/L的患者LT后死亡風險越高（P<0.05），同時發現聯合ADV-TK/GCV治療能降低LT患者術后死亡風險（P<0.05）。
表4
影響肝癌患者LT后5年總生存率和無復發生存率的Cox回歸多因素分析結果
以5年無復發生存率為目標的Cox回歸模型（表4）的結果顯示，隨著患者年齡增大、累積腫瘤直徑變大以及TNM分期越晚（Ⅲa、≥Ⅲb期）的患者，LT術后復發風險越高（P<0.05），而未發現聯合ADV-TK/GCV治療對肝癌LT后復發的影響（P>0.05）。
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近年來，為了保證LT的肝臟供體得到最合理的分配，必須制定合適的LT患者的入選標準。1996年針對早期肝癌患者的米蘭標準被提出用于篩選LT受者[9]。符合米蘭標準的LT患者5年生存率超過70%，但也因此大部分患者被排除在了LT之外，從而失去了治愈腫瘤的機會。國內學者[10-11]先后提出了杭州標準、復旦標準等，但盲目地擴大米蘭標準也導致了LT術后復發率明顯上升[12]。
影響LT術后肝癌復發和長期生存的因素很多[13]。本研究中采用Cox回歸多因素分析結果發現，患者的年齡、術前累積腫瘤直徑及腫瘤TNM分期影響LT術后肝癌復發，而影響肝癌患者LT術后長期總生存的危險因素包括患者的累積腫瘤直徑、術前TNM分期、術前血清AFP>400 μg/L以及是否聯合ADV-TK/GCV治療，其中聯合ADV-TK/GCV治療的患者LT術后長期生存可能性更大，而肝癌的累積直徑越大、TNM分期晚、術前血清AFP>400 μg/L的患者LT術后長期生存的可能性更小（P<0.05）。
肝癌LT術后復發的防控以全身抗腫瘤治療為主[14-15]，目前常用的輔助治療有哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑[16]、化學藥物治療、靶向藥物治療等[17-18]，對于超米蘭標準的肝癌LT患者一般推薦輔助化學藥物治療和靶向治療。但是全身化學藥物治療具有較大的毒副作用如骨髓抑制、肝腎毒性等，同時在早期病例的對照研究[19]中發現，對肝癌LT患者采用全劑量靶向治療藥物索拉非尼輔助治療，其耐受性較差，但當減量治療后可降低LT患者術后腫瘤復發率，提高1年無瘤生存率和總生存率。在實際臨床工作中，索拉非尼主要用于肝癌復發后的治療，以延長復發患者的總生存時間，然而LT患者往往無法耐受常規治療劑量，通常需要減量，但會因此達不到理想的治療效果[20]。新興的免疫治療目前仍處于臨床試驗階段，其作用機制和臨床評價仍需要進一步的研究證實[21-22]。因此，肝癌治療迫切需要一種有效的新型輔助腫瘤治療手段來降低肝癌LT術后復發轉移率。目前隨著現代分子醫學的進展，開拓了肝癌的基因治療新領域，通過在基因層面進行操作和干預，以達到治療疾病的目的。本研究團隊目前采用的自殺基因系統為ADV-TK/GCV，其作用原理是用腺病毒為載體，將胸苷激酶基因轉染到腫瘤細胞中，其表達產物可以將抗皰疹病毒前藥GCV轉化為具有細胞毒性的三磷酸核苷，并與腫瘤細胞內復制產生的DNA鏈結合干擾DNA合成，從而直接殺傷腫瘤細胞[23]，其病毒載體腺病毒在體內分布時具有明顯的噬肝性且能高效轉染肝細胞[24]；此外，ADV-TK還可發揮“旁觀者效應”，極大地增強殺傷腫瘤細胞的效能。目前ADV-TK/GCV治療及同類基因制劑已被廣泛應用于臨床惡性腫瘤的治療中，并且已經顯示了比較好的臨床療效。國內有研究者[25]將輔助性ADV-TK/GCV應用于肝癌LT領域的研究發現，在不伴有大血管侵犯的肝癌患者中，LT+ADV-TK/GCV組患者的生存情況優于單純LT組；同時有研究者[26]探索了加大ADV-TK/GCV治療劑量的效果，對不伴有大血管侵犯LT患者能明顯改善治療效果，而對于伴有門靜脈主要分支受侵的LT患者治療效果改變不明顯。提示，在合并血管侵犯（包括門靜脈主干及大分支、肝靜脈、下腔靜脈）的肝癌患者，ADV-TK并不能明顯改善預后。關于ADV-TK腫瘤局部注射后的主要不良反應表現為發熱（53%）和Ⅰ度流感樣反應（16%），其他不良反應發生率較低[5, 25]；而GCV連續使用后可導致輕度骨髓抑制、皮疹、消化道反應和肝功能的變化，臨床處理或不處理大多能在短期內緩解。在本研究中發現，對于超米蘭標準的LT患者，輔助ADV-TK/GCV的總生存情況優于單獨LT患者，并且未見其他藥物相關的Ⅱ度以上不良反應，但未發現它對無復發生存的影響，其原因有待進一步分析。
總之，從本研究結果及結合文獻報道結果看，LT聯合ADV-TK/GCV治療能夠改善超米蘭標準肝癌患者的預后，該治療手段的優勢在于：① LT能最大限度地減少腫瘤負荷，同時能夠治療基礎肝臟疾病；② ADV-TK/GCV治療通過直接殺傷作用和旁觀者效應能夠殺死微小轉移灶，從而減少肝癌的復發和轉移。盡管如此，本研究結論仍需要擴大樣本量來進一步進行臨床驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：李寧負責研究的設計及總體指導，林棟棟參與課題的設計、數據的匯總及文章審校工作，王振順負責數據的收集整理分析及文章撰寫，劉召波參與數據的收集、文章的修改。
倫理聲明：本研究通過了首都醫科大學宣武醫院（批文編號：KS2022080-1）及首都醫科大學附屬北京佑安醫院（批文編號：LL-2020-067-K）倫理委員會審批。
志謝：特別感謝首都醫科大學附屬北京佑安醫院普通外科中心及宣武醫院普通外科醫護人員，特別是李非、栗光明、劉東斌、武聚山、孫力波、李文磊、朱瑞東、曹柯等在患者入組、數據統計及患者隨訪過程中提供的支持和幫助。
