免疫療法的發展徹底改變了腫瘤治療的格局。個體化新抗原疫苗是一種具有吸引力的全身性免疫療法，可觸發針對具有高度特異性新抗原的T 細胞反應，誘導輔助性和細胞毒性 T 淋巴細胞的活化以增強抗腫瘤免疫。基于生物信息學的快速發展和測序技術的不斷更新，新抗原疫苗得到了快速地發展，研究者們得以在不同的瘤種中進行新抗原疫苗單獨或者聯合治療價值的探索。本文概述了制備個體新抗原疫苗的復雜過程，討論了在腫瘤患者中進行個體化新抗原疫苗的臨床研究的現狀，對這種新穎的、個體化的免疫治療方法的未來進行了展望。
引用本文： 吳秋吉, 李秋. 個體化新抗原疫苗的臨床研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(8): 1006-1017. doi: 10.7507/1007-9424.202206045 復制
癌癥免疫治療被定義為通過免疫系統來識別和摧毀癌細胞。在過去的十年中，各種免疫療法在治療腫瘤方面取得了飛速發展，而在已被批準的免疫治療藥物中，治療性癌癥疫苗具有誘導針對腫瘤抗原特異性免疫反應的優勢。癌癥疫苗通常包括選定的腫瘤抗原、結合激活樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）的佐劑，或者DCs本身。治療性癌癥疫苗的目的是激活患者針對特定腫瘤抗原的適應性免疫系統，以控制腫瘤生長、誘導腫瘤消退并根除微小的殘留病灶。但治療性癌癥疫苗的有效性受到多種因素的影響，包括靶抗原的選擇、佐劑的使用以及癌癥疫苗在高度免疫抑制的腫瘤微環境中誘導抗腫瘤T細胞反應的能力[1-2]。其中抗原特異性治療性疫苗的效力在很大程度上取決于疫苗中抗原的性質。
盡管腫瘤相關抗原（tumor-associated antigen，TAA）具有在腫瘤中異常表達或過度表達的特點，但是由于TAA特異性T細胞受到中樞和（或）外周耐受的影響，其難以成功產生臨床有效的抗腫瘤免疫反應。最近，人們的注意力轉向了“新抗原”（neoantigen），它主要來源于腫瘤細胞突變而產生的獨特的自身抗原表位。因此，新抗原是腫瘤特異性的，被適應性免疫系統識別為外來表位。腫瘤新抗原可以激活不受免疫耐受影響的高活性細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte，CTL），并且可以防止對非惡性組織的“脫靶”損傷。此外，研究表明，這些疫苗誘導新抗原特異性 T 細胞反應增強且持續存在，并具有治療后免疫記憶的潛力，因而具有免于或推遲疾病復發的長期保護的可能性[3]。近年來，已有越來越多的研究證實新抗原是各個疫苗平臺的理想靶抗原。
因此，我們在既往研究的基礎上，對新抗原及新抗原疫苗的研究進展進行了闡述，總結了疫苗接種策略及相關臨床研究。最后，我們討論了個體化新抗原疫苗應用的障礙及可能有效的相關解決方案。
1 腫瘤新抗原形成及分類
腫瘤新抗原形成于腫瘤細胞中發生的突變，具有腫瘤細胞特有表達、且正常細胞不表達的特點。而在更廣泛的定義上，還包括人類內源性逆轉錄病毒（human endogenous retroviruses，HERVs）通過 DNA去甲基化在腫瘤中表達、翻譯后修飾[4-5]等。在此，本文僅涉及與突變相關的腫瘤新抗原。
1.1 單核苷酸變異（single-nucleotide variations，SNVs）
SNVs是腫瘤中最常見的基因組水平突變類型，由非同義突變編碼的蛋白質產生的變異肽可能通過主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）分子呈遞到腫瘤細胞表面，形成腫瘤抗原[6]。大多數SNVs通過單一氨基酸替代產生新的抗原。SNVs是臨床試驗中新抗原預測工作的重點。SNVs衍生的新抗原及抗原肽已成功在多個瘤種中篩選及制備，包括具有高突變負荷的黑色素瘤和肺癌，以及具有中低突變負荷的肝癌和膠質母細胞瘤[7-12]。最近的研究報道，在接受免疫檢查點抑制劑（immune checkpoints inhibitor，ICIs）治療的患者中，基于SNVs的新抗原負荷與ICIs臨床獲益相關[13-14]。但由于其與非突變的肽段本身相似，因此大部分SNVs衍生的新抗原并沒有免疫原性，需要進一步進行嚴格地篩選。而由于發生的隨機性質，體細胞癌癥突變是高度個體化的，由SNVs產生的新抗原極少在不同患者之間共享，限制了基于共有腫瘤新抗原的有效通用癌癥疫苗的開發。
1.2 核苷酸的插入或缺失（insertions or deletions of nucleotides，Indels）
腫瘤新抗原另外一種重要的來源為Indels。外顯子區域Indels的突變會導致密碼子的變化，形成新的開放閱讀框，并可能產生大量與自身高度不同的新抗原，多出現于高度微衛星不穩定的腫瘤[15]以及腎乳頭、嫌色或透明細胞腫瘤中[16]。Turajlic等[16]通過腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫分析了涉及19種腫瘤的5 777個實體瘤樣本的全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）數據，結果顯示，盡管Indels的發生頻率相較于SNVs較低，但Indels產生的新抗原比SNVs的更具免疫原性，這可能是因為移碼插入序列產生與已知序列無關的序列串，具有更強的異質性[15]。同樣，在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中，發現Indels衍生的預測新抗原的MHC- Ⅰ 結合親和力比SNVs高3.9倍[17]。另外，基于Indels的新抗原與黑色素瘤患者的抗程序性死亡受體 1（programmed cell death protein1，PD-1）或抗細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA4）的ICIs治療反應顯著相關[16]。
1.3 融合基因
融合基因可能來源于染色體內或染色體間的重排而導致的兩個無關基因的結合[18]。早期融合基因主要在血液腫瘤和滑膜肉瘤中被發現，如典型的BCR-ABL融合基因[19-20]。隨著二代測序技術的發展，在各類腫瘤中發現了大量新的融合基因，包括前列腺腫瘤、頭頸腫瘤等[21-22]。而研究結果表明，基因融合衍生的腫瘤新抗原具有良好的免疫原性[22-23]。Wei等[24]從6 552 個TCGA 樣本中預測了總共67 502個融合新抗原。與 SNVs和Indels 相比，融合基因可以產生高達6 倍的候選新抗原和高達11倍的特異性候選新抗原[24]。并且，研究者還發現，在TCGA 中5.8%的融合新抗原在患者之間共享[24]。但總體而言，融合基因是相對罕見的事件[25]，融合基因衍生的新抗原用于治療性疫苗仍需進一步的研究。
1.4 剪接變異體
剪接變異產生的大量轉錄物可以產生新的抗原，包括mRNA 剪接點突變、內含子保留或腫瘤細胞中剪接體機制失調等[26-29]。因此剪接變異衍生的新抗原是治療性新抗原疫苗擴展到其他具有顯著可變剪接的低突變腫瘤的方式之一。Kahles等[30]分析了來自TCGA 的8 705 例患者和 670名匹配的正常對照的WES和轉錄組測序（RNA Sequencing，RNA-seq）數據，證明了腫瘤特異性的外顯子-外顯子連接產生的多肽具有結合MHC- Ⅰ的潛力并可能充當新抗原。而Jayasinghe等[26]也同樣發現剪接位點產生突變誘導的新抗原的數量可能比錯義突變高幾倍，并且在部分剪接變異腫瘤中觀察到PD-1和程序性死亡-配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）的高表達，表明腫瘤中具有剪接突變的患者可能從ICIs治療中獲益。
2 新抗原的預測與鑒定
現在的新抗原預測一般需要經過樣本獲取、測序、人類白細胞抗原分型 ［（human leukocyte antigen，HLA）typing］、突變肽段的推測、預測HLA結合和抗原遞呈、選擇候選新抗原、排序等過程。
2.1 樣本選擇
高質量的腫瘤標本的獲取是執行新抗原預測和篩選的第一步。新鮮腫瘤組織的DNA完整性好，既可以用于DNA提取，也可以用于RNA提取。但是目前大多數已完成或者正在進行的研究主要集中于晚期腫瘤患者，通常需要在經病理確診之后進行額外的有創性操作以獲取腫瘤組織。而局部活檢穿刺獲取的樣本，因受限于實體腫瘤復雜的異質性，不能很好地代表腫瘤整體[31]，例如病變中支持腫瘤的間質細胞和血管系統，以及小塊壞死組織，在取樣操作前很難評估，可能會限制獲得用于測序的腫瘤DNA和RNA的質量和純度。因此，對于晚期患者，有研究探索了通過循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）以及胸水樣本進行新抗原篩選，分別從ctDNA和胸腹水測序突變中篩選了9條及12條具有高親和力的新抗原肽[32]，但僅有1條多肽能被自體T細胞所識別。用于新抗原鑒定的另一種常見組織選擇是甲醛固定的石蠟包埋（formalin-fixed, paraffinembedded，FFPE）樣本[10, 32]。FFPE樣本具有在臨床環境中常規收集的明顯優勢，但手術保留的FFPE標本可能間隔時間較久，而不能很好反映當前的腫瘤突變狀況。FFPE標本與新鮮標本的匹配結果顯示，FFPE樣本的變異數量是配對的新鮮冷凍樣本的5倍[33]。目前提出的可能解決方法包括FFPE樣本特定的DNA提取試劑盒以及選擇一種以上的工具對細胞變異進行篩選，取其共同變異部分，已有研究表明可提高與新鮮樣本的一致性[34]。但其局限性在于特異性尚可而敏感性不足，因為可能忽略了具有潛在臨床意義的變異。
2.2 突變識別
從患者身上獲取腫瘤活檢標本和非惡性組織樣本（通常是外周血單核細胞）提取DNA后，需進行WES，以比較腫瘤和胚系DNA[35-36]。通常需要額外的RNA測序以提供突變基因表達的信息用于進一步確認[27, 37-38]。許多現有的軟件工具用于實現突變識別。常用工具包括MuTect/MuTect2、Strelka/Strelka2、VarScan2、SomaticSniper、GATK等，它們在檢測不同的突變類別（如SNVs或Indels）、處理腫瘤異質性的同時保持可接受的準確度的能力各不相同[39-44]。如MuTect2和Strelka在檢測等位基因比例較低的SNVs時具有較高的敏感性，可以準確地檢測亞克隆變異。VarScan2和SomaticSniper通常在等位基因比例較高的情況下具有優勢，并且在區分生殖系變異和腫瘤變異方面具有更好的性能。目前還沒有統一的完美解決方案，通常的方法是針對不同的突變使用不同工具或者聯合使用[45]。
2.3 HLA結合
新抗原發現過程中最復雜的步驟是從通過測序手段鑒定的突變中進行抗原的計算和預測[46-47]。在患者中，已知存在16 000多個不同等位基因的經典人類白細胞抗原Ⅰ類分子（HLA-A/B/C）和8 000個Ⅱ類（HLA-DP/-DQ/-DR）分子[48-49]。突變肽具有與患者的至少一個MHC等位基因結合的能力，是形成 T 細胞識別的最基本要求。目前尚缺乏一致的方法來進行新抗原的預測。最近的研究通常使用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線作為性能指標來評估人類MHC- Ⅰ結合和呈遞的預測工具或小鼠T細胞反應的預測工具[50-51]。主要的預測算法包括基于人工神經網絡方法的NetMHC4[52]、基于泛特定方法的NetMHCpan[53]、基于位置特異性評分矩陣的PSSMHCpan[54]、免疫表位數據庫（Immune Epitope DataBase，IEDB）[55]等。最近的研究發現親和力以外的一些指標如MHC- Ⅰ結合穩定性、基因表達豐度和多肽異質性可以用來改善Ⅰ類新抗原預測的性能[56]。其中新抗原肽-MHC復合體的穩定性被認為比結合親和力更重要，因為更高的穩定性可能會增加該復合體被T細胞識別的可能性[57]。
到目前為止，表位預測方法主要集中在MHC- Ⅰ結合表位上，而MHC- Ⅱ結合表位預測的研究相對較少。抗原特異性CD4+和CD8+T細胞的協作對于有效的抗腫瘤免疫至關重要[58]。僅表達一種MHC- Ⅰ 新抗原是不夠的，腫瘤小鼠模型中有意義的抗腫瘤免疫至少需要一種額外的MHC- Ⅱ類新抗原[59]。事實上，已經在幾個臨床試驗中觀察到在接種疫苗后，優先誘導CD4+T細胞反應而不是CD8+T細胞反應[7-10, 60]。因此，個體化新抗原疫苗應包含預計與患者的MHC- Ⅰ和MHC- Ⅱ等位基因結合的新表位。MHC- Ⅰ型結合槽具有封閉的兩端，結合8～11個氨基酸長度的多肽，以便呈遞給CD8+T細胞。相比之下，MHC- Ⅱ肽結合槽有開放的兩端，這使得它能夠結合和呈現更長的肽。另外，MHC-Ⅱ分子核心結合部分兩側的肽區域可以影響肽的結合[61]。綜上所述，MHC- Ⅱ多肽結合的這些特征使免疫原性MHC- Ⅱ表位的鑒定變得復雜。Abelin等[62]開發了一種稱為MAPTAC（mono-allelic profiling technology）的分析技術，并在此基礎上訓練了結合預測算法neonmhc2。另外，Racle等[63]從23個不同的組織樣本中篩選了將近80 000個獨特的肽進行分析，開發了一種表位預測算法MixMHC2pred。另外，一種多模態遞歸神經網絡MARIA（具有遞歸集成架構的MHC分析）被開發用于預測HLA- Ⅱ復合物呈遞肽的可能性，并且其ROC達到了0.89～0.92[64]。而以往根據IEDB中的肽結合親和力數據開發的MHC- Ⅱ結合表位預測算法NetMHCIIpan也在2020年進行了更新，具有更好的預測水平[65]。
3 疫苗接種策略
3.1 直接注射抗原
合成肽疫苗是一種使用較多的個體化新抗原疫苗平臺。在研究早期，基于多肽的癌癥疫苗通常由MHC- Ⅰ結合短肽組成。盡管這些疫苗產生了相應的T 細胞反應，但其中大多數表達MHC- Ⅰ分子的細胞不專門用于抗原呈遞，從而導致T細胞啟動或耐受性不佳[66-67]。相比之下，合成長肽疫苗（synthetic long-peptide，SLP）接種必須在疫苗引流淋巴結中通過專業抗原遞呈細胞（如DCs）進行攝取和加工才能完成遞呈和T細胞活化。經DCs內化后,一部分SLP通過胞內體途徑降解并加載到MHC- Ⅱ分子上，允許CD4+T輔助細胞識別[68]。另一部分內吞SLP進入胞質，并由 MHC- Ⅰ分子交叉呈遞，激活 CD8+ CTL[69-70]。這種通過加工SLP從而產生抗原特異性CD8+ T 細胞反應的方式可以避免可能的CTL耐受機制[71]。另外SLP新抗原疫苗提供了潛在的MHC- Ⅱ類表位，從而涉及CD4+和 CD8+T細胞反應[72-73]。近年來，多項臨床試驗測試了SLP新抗原疫苗的功效。Ott等[7]為ⅢB/C期或Ⅳ期（M1a/b）的高危黑色素瘤患者設計并制備了包含20多種新抗原的個體化肽疫苗，并配合佐劑聚肌苷酸-聚胞苷酸（polyinosinic-Polycytidylic acid，Poly-ICLC）一起皮下注射，結果表明4例Ⅲ期黑色素瘤患者接受疫苗治療后32個月未見腫瘤復發，2例Ⅳ期黑色素瘤患者雖然在接受疫苗后仍發生腫瘤進展，但是在接受PD-1抑制劑后出現了完全的腫瘤消退。而更值得關注的是，55 個月的隨訪結果顯示，所有8例患者都還存活，6例患者沒有表現出活動性疾病的跡象。而且在接種新抗原個體化肽疫苗后，新抗原特異性 T 細胞反應在黑色素瘤患者中持續存在數年，并且持續存在記憶表型的新抗原特異性 T 細胞[3]。
DNA 疫苗可以通過將感興趣的基因插入細菌質粒來產生[74]。所有類型的表位都可以通過DNA格式進行編碼。DNA疫苗可以快速合成，在常規條件下保存，并可以通過皮下、肌內、皮內和黏膜注射方便地給藥[75]。新抗原DNA疫苗已在臨床前及臨床研究中被證明其能夠誘導針對腫瘤的有效免疫反應并且具有良好的安全性。最近，一種使用電穿孔介導的多種新抗原DNA疫苗被證明能在小鼠腫瘤模型中誘導與抗腫瘤免疫相關的CD8+T細胞反應[76]。Yang等[77]建立了一個基于DNA的多種新抗原疫苗平臺，證明了新抗原DNA疫苗能被DCs有效攝取并誘導針對小鼠黑色素瘤的有效免疫反應，從而顯著抑制黑色素瘤的生長。Aurisicchio等[78]通過結合電穿孔的新抗原DNA疫苗誘導了特異的免疫反應，并抑制了人源腫瘤組織來源的移植瘤模型的腫瘤生長。2022年美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology，ASCO）報告了一項基于新抗原DNA疫苗聯合白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）和 Pembrolizumab的1/2期臨床研究，研究結果顯示誘導了新抗原特異性的CD8+ 細胞，并報道1例患者獲得了部分緩解（partial response，PR）的療效[79]。
與DNA新抗原疫苗比較，RNA新抗原疫苗的制造相對簡單，并且具有內置的佐劑[80]。目前RNA疫苗主要直接注射到淋巴結內，在Ⅲ期和Ⅳ期黑色素瘤患者的Ⅰ期臨床試驗中，研究者為13例可評估的黑色素瘤患者設計了包含 20個患者特異性突變的新抗原RNA疫苗，研究結果表明新抗原RNA疫苗誘導了針對多種疫苗新表位的CD4+ 和CD8+T細胞反應，觀察到了客觀反應，并且通過接種疫苗顯著降低了累積復發率，從而誘導了持續的無進展生存獲益[8]。而脂質體運載（lipoplexes，LPX）技術以及脂質納米粒（lipid nanoparticle，LNP）遞送技術的發展[81-82]，為新抗原RNA疫苗提供了更多的給藥方式。最近在4例胃腸癌患者中進行的Ⅰ期臨床試驗的數據表明，用LNP進行新抗原RNA疫苗肌肉接種是安全的，并且可以誘導突變特異性T細胞反應[83]。
與多肽疫苗相比，核酸疫苗有助于抗原的持續有效表達和免疫刺激。重要的是，基于核酸的疫苗可使細胞自身合成抗原肽，避免了昂貴且困難的蛋白質純化，并為蛋白質配備了天然的翻譯后修飾。核酸疫苗在功效、縮短設計和制造時間以及生產可擴展性和可靠性方面具有優勢[84]。而比較DNA和RNA疫苗兩者，DNA攜帶遺傳信息，需要進入細胞核才能表達抗原，而mRNA在不進入細胞核的情況下以更好和集中的方式指導抗原的產生。此外，鑒于其固有的免疫原性特征，mRNA可以用作佐劑，并且僅需要較低的劑量來引發最佳的免疫反應，使其成為新抗原疫苗的安全和有前途的平臺[85]。但與多肽疫苗相比，核酸新抗原疫苗呈遞到DCs之前需要更多的加工步驟。
3.2 新抗原DCs疫苗
多肽及核酸新抗原疫苗均需面對如何被人體的抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APC）有效地攝取和呈遞的問題。而新抗原DCs疫苗可以通過與新抗原對應的肽進行共培養負載肽后，重新通過皮內、皮下或者靜脈注射等方式回輸至患者體內，從而避免體內抗原捕獲、處理、呈遞和DCs成熟的過程[86-87]。基于DCs的新抗原疫苗已在幾項臨床研究中進行了探索，包括高突變負荷的黑色素瘤[88-89]、NSCLC[90]、中低突變負荷的肝細胞癌[12]等。Carreno等[88]證明在Ⅲ期黑色素瘤患者中，新抗原DCs疫苗誘導的新抗原特異性T細胞的廣度和多樣性顯著增加。本課題組前期報道的一項研究中納入了12例無標準治療方案的晚期NSCLC患者，后續均接種了新抗原DCs疫苗，結果顯示該疫苗具有良好的安全性，可以誘導特定的 T 細胞免疫，顯示出25%的客觀應答率[90]；并且1例全身播散性轉移的晚期患者在接受5劑個體化DCs疫苗治療后，總體腫瘤病變減少了29%[90]。該試驗首次證明了基于新抗原的DCs疫苗對腫瘤患者的療效。
筆者團隊目前正在進行一項Ⅰ期臨床試驗，以探索在肝細胞癌中篩選新抗原肽的可行性，并在此基礎上確定負載新抗原DCs疫苗在具有高危復發風險的肝癌患者中的安全性及有效性（NCT04147078）。目前初步的研究結果證實，在肝細胞癌患者中進行新抗原DCs疫苗輔助治療是可行的，并且可以誘導新抗原特異性反應，而且具有良好的安全性。
目前，多數臨床試驗通過體外分化培養的單核細胞來源的DCs進行疫苗接種，主要是因為目前還不能獲得足夠數量的其他更相關的DCs亞群用于疫苗接種。然而，單核細胞來源的DCs并不具備其他DCs亞群所具有的完整的共刺激分子和抗原交叉遞呈機制[67]。傳統的1型DCs（cDC1）亞集已被證明在交叉呈遞和CD8+T細胞激活方面更優越，而cDC2亞集被認為可啟動CD4+T細胞[91]。此外DCs培養方案的改進將為大量獲取不同的DCs亞型提供了可能[92]，這將有助于確定DCs疫苗在誘導治療性抗腫瘤反應方面的真正生理潛力。
3.3 新型抗原遞送平臺
核酸或者基于多肽的新抗原疫苗往往可能面臨無法有效地前往或者靶向淋巴結DCs的情況，而納米顆粒（nanoparticles，NPs）長期以來一直是一種改善疫苗遞送的有吸引力的策略[93]。通過納米疫苗遞送系統，納米疫苗可以有效地輸送到二級淋巴組織并保留在淋巴結中相對較長的時間。其次，納米疫苗可以將多種協同佐劑和抗原共同遞送到淋巴結和APC[94-96]。并且通過共同封裝佐劑和抗原，納米疫苗可以改善其藥物有效載荷的藥代動力學特性，從而進一步增強由此產生的免疫調節作用[97]。Wang等[98]設計了一種基于腫瘤微酸性/近紅外光敏感的新抗原刺激性DCs納米疫苗，通過響應腫瘤微酸性信號，可控釋放卡托普利藥物用以降低N2型腫瘤相關中性粒細胞的免疫抑制作用；通過響應外源近紅外光信號產生的活性氧自由基用以提高原位腫瘤免疫原性；在H22荷瘤小鼠中實現83%的腫瘤完全消退并延長了存活時間。最近，Baharom等[99]報告了一種由自組裝納米顆粒疫苗平臺制備的新抗原多肽疫苗，與皮下免疫相比，靜脈內疫苗接種誘導了更高比例的T細胞特異性轉錄因子1（T-cell specific transcription factor 1，TCF1）陽性的CD8+PD-1+T細胞，并且在檢查點阻斷后，由靜脈回輸產生的干細胞樣細胞增殖并分化為效應細胞，與治療模型中的皮下回輸相比，產生了更好的抗腫瘤反應。基于新抗原多肽疫苗可能更主要引起CD4相關的免疫反應，Arbelaez等[100]設計了針對KRAS G12D突變相應新抗原多肽的陽離子脂質復合物（SLP-LPX），SLP-LPX免疫后可以刺激CD4+ 和 CD8+T 細胞，并以 CD8+T 細胞依賴性方式抑制腫瘤生長；另外還發現，SLP-LPX 疫苗與ICIs組合可以明顯抑制腫瘤的生長。同時，另外基于納米疫苗的兩項研究中也發現了類似的同時激活CD4+和CD8+T 細胞的現象[101-102]。以上結果均證明了使用納米遞送系統在新抗原疫苗中具有良好的前景。
4 新抗原疫苗發展中的常見障礙
盡管隨著測序技術以及各種算法的進一步發展，新抗原疫苗的發展已經有了長足的進步，但目前仍有許多挑戰需要解決。首先是需要再次強調的是惡性腫瘤異質性的本質，同一腫瘤病灶的多次活檢可能會發現不同的分子特征[103-104]，并且在患者的不同轉移灶或原發腫瘤中的候選新抗原不同[105]。基于當前的臨床實踐，許多新抗原疫苗方案都基于單個活檢樣本，這些樣本既不能完全捕獲所探測的單個腫瘤病變的異質性，也不能在寡轉移或多轉移疾病的情況下具有代表性[106]。因此，由此產生的復合新抗原疫苗可能只代表患者病變中目標的一小部分。
新抗原呈遞的復雜機制決定了新抗原預測的困境。對于腫瘤新抗原預測算法，必須考慮各種參數，例如抗原肽長度、抗原加工相關轉運體結合、MHC親和力、抗原肽結合的主要組織相容性復合物（peptide major histocompatibility complex，pMHC）的穩定性和腫瘤新抗原來源[107]。因此，基于機器學習和人工智能技術的預測算法仍必須通過驗證數據集進行不斷更新[108]。
另外，T 細胞耗竭是抗腫瘤免疫療法的主要挑戰之一。同樣，在新抗原疫苗的臨床研究中發現了誘導CD4+T細胞和CD8+T 細胞表達的多種抑制性受體 [7-10]，并導致細胞因子產生受損 ［腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNFα）、干擾素γ（interferon-gamma，IFN-γ）和IL-2］和T細胞增殖減少[109-112]。
針對腫瘤新抗原的各種免疫治療策略的最終目的是誘導和（或）放大腫瘤特異性T細胞反應。由于疫苗生產周期和患者病情進展的限制，許多針對腫瘤新抗原的臨床研究往往缺乏必要的時間來驗證預測的候選腫瘤新抗原的免疫學性質。在目前的研究中，酶聯免疫斑點試驗（enzyme-linked immunospot assay，ELISpot assay）常常用于評估新抗原特異性 T 細胞反應[113-114]，但其并不能用于確定抗原特異性 T 細胞反應的絕對數量。MHC多聚體技術也常用來檢測新抗原特異性T細胞。另外，腫瘤特異性T細胞反應也可以通過表征免疫治療前后患者T細胞受體池的變化來進行分析。這些工具共同提供了高度特異性檢測方式，但是真正實現臨床應用仍然存在較多障礙[115]。
如前所述，新抗原疫苗的制備通常需要經過標本獲取、DNA/RNA的提取、測序及分析、新抗原的預測和合成等一系列步驟，往往需要較長的制備周期。如Ott團隊[7]關于未經治療的高危黑色素瘤的臨床研究中，患者需經過3個月左右的時間才能接種新抗原疫苗；另外一Ⅰ b期膠質母細胞瘤臨床研究中，患者雖然在術后接受了放射治療，但平均約需要4個月時間才接種新抗原疫苗[10]。最近，Cai等[11]進行的臨床研究中，從肝切除到第一次接種疫苗的中位持續時間為86 d，范圍為59～159 d。對于腫瘤患者，縮短治療等待時間對預防疾病的進展十分關鍵。另外，目前新抗原疫苗的設計大多來自于SNVs，往往具有高度的個體特異性，而很少具有共享的新抗原。因此，每例患者均需要進行個體化的定制，從而導致高昂的治療成本。FDA批準的首款DCs的自體前列腺癌疫苗Sipuleucel-T（Provenge）3次治療的費用高達10萬美元，遠遠超過一般家庭的承受能力[116]。
5 針對新抗原有希望的免疫治療策略
5.1 提高新抗原預測的準確性
通過多點取樣并測序來預測腫瘤的新抗原需要額外的侵入性操作，可行性較差，很難在實際臨床上應用和推廣。計算算法的發展可以在一定程度上通過單點取樣估算患者整體的異質性。近期，Fang等[117]通過獲取69 例 NSCLC 患者的腫瘤WES數據，通過新的算法計算了單點取樣與多點取樣的腫瘤異質性，結果顯示新算法預測的單點取樣的異質性與整體具有高度相關性（r=0.96）；并且，研究發現在NSCLC患者中，腫瘤內異質低的患者克隆新抗原比例更高，且新抗原和 MHC 親和力能力得分更高。
隨著液體活檢技術的發展和成熟，患者血液中的ctDNA可以更容易進行收集及分析，并且ctDNA可以更全面地體現多部位疾病的特征，在既往研究中進行了嘗試。但ctDNA 樣本中突變的等位基因頻率通常很低，并且目前的技術僅限于檢測一組預定的突變，從而限制了其在新抗原預測中的價值，而需要進一步的技術突破。
5.2 聯合療法方案
癌癥疫苗研究領域的一項主要挑戰是我們如何提高T細胞的反應，特別是最大限度地誘導CD8+T 細胞的激活和擴增。為了實現這一目標，可能需要促進APC功能和T細胞最佳啟動的聯合療法。有可能實現這一目標的治療藥物包括ICIs、共刺激受體激動劑（如 CD40）、TOLL樣受體（toll-like receptors，TLR）激動劑等。另外，抗原疫苗安全且耐受性良好，與其他藥物結合使用增加毒性的風險較低。Knuschke及同事[118]的研究結果表明，在小鼠逆轉錄病毒模型中，治療性疫苗聯合ICIs療法可以誘導初始T細胞活化，并增強耗竭T 細胞的效應功能。近日，研究報道了在小鼠的MC38腫瘤模型中，新抗原疫苗和ICIs聯合治療有效地抑制了耗竭CD8+T 細胞和Treg細胞的增殖能力，增加了Th1-like CD4+T細胞和效應T細胞的比例，并且誘導抗原特異性 CD8+T 細胞群具有活躍的趨化因子信號傳導（Cxcr3+/Ccl5+）、較低的共抑制受體表達（Lag3–/Havcr2–）和更高的細胞毒性（Fasl+/Gzma+）。另外，在黑色素瘤的臨床研究中，2例患有復發性腫瘤的患者在接受Pembrolizumab 治療后腫瘤完全消退[7]，而在另外一項新抗原疫苗和ICIs聯合治療黑色素瘤、NSCLC和膀胱癌的臨床研中，聯合治療誘導了持久的新抗原特異性 T 細胞反應性，具有細胞毒性的新抗原特異性T細胞能夠遷移到腫瘤并且形成了表位擴散[89]。上述研究結果表明，新抗原疫苗接種和 ICIs 治療相結合可以通過各種機制增強T細胞反應并克服T細胞耗竭。截止至2022年6月，以“neoantigen vaccine”為檢索詞在國際臨床試驗注冊平臺（http://www. clinicaltrials.gov）中檢索到涉及新抗原疫苗聯合ICIs治療實體瘤的注冊臨床試驗共24項（表1），其中有7項研究聯合了雙免疫療法。在疫苗類型方面，包括DNA疫苗4項，RNA疫苗6項，DCs疫苗1項，其余均為多肽疫苗。
表1
個體化新抗原疫苗聯合ICIs的臨床試驗
5.3 新型免疫佐劑的應用
作為多肽疫苗的重要組成部分，在肽疫苗中添加免疫佐劑對于誘導有效的免疫反應至關重要[119]。傳統佐劑如弗氏不完全佐劑（incomplete Freund’s adjuvant，IFA）和鋁鹽在短肽疫苗相關研究中被發現可能會誘導 T 細胞滯留、衰竭、缺失等缺陷[120]。共刺激分子CD40 信號傳導介導 DCs 的活化，導致 MHC 分子、共刺激標志物的上調和促炎細胞因子釋放[121-122]。這提高了DCs啟動CD4+和 CD8+T細胞的能力。此外，通過CD40激活DCs可刺激有效的交叉呈遞，這對于誘導CD8+T細胞對腫瘤抗原的反應至關重要[123-125]。在一項針對GL261和NSCL61神經膠質瘤模型的研究中，研究者通過將FGK45（一種 CD40 的激動性抗體）添加到腫瘤裂解物疫苗中以探索CD40 激動性抗體在疫苗中的作用。結果證明，添加FGK45后可以在腫瘤模型中誘導更加明顯的免疫反應且延長了兩種腫瘤模型小鼠的存活。另一項涉及晚期前列腺癌的Ⅰ期試驗中，研究者制備了靶向前列腺特異性膜抗原的自體抗原提呈細胞疫苗，在部分患者中檢測到了CD8+T 細胞反應，并伴有高水平的外周血IFN-γ產生，但并沒有生存相關的療效獲益[126]。另外，TLR3 激動劑Poly-ICLC在新抗原疫苗中得到了廣泛地應用，在已報道的涉及黑色素瘤和膠質瘤的新抗原疫苗臨床研究中，添加了Poly-ICLC的新抗原疫苗可以有效地誘導特異性T細胞反應[7, 9-10]。近期，有研究者開發了一種具有載體和免疫佐劑雙重功能的低毒性膽固醇修飾的抗菌肽-DP7，它能夠通過TLR2-MyD88-NF-κB通路誘導DCs成熟和促炎細胞因子釋放，有效提高抗原呈遞效率，為提高疫苗療效提供了一種新的方案[127]。
5.4 通用型疫苗的探索
縮短疫苗的制備周期以及生產成本是新抗原疫苗進一步臨床應用需實現的目標之一。因此，眾多研究者將目標投向通用型新抗原疫苗。前期研究結果發現，神經膠質瘤中最常見的IDH1突變影響密碼132并編碼 IDH1（R132H），該 IDH1（R132H）具有一個共享的克隆新表位，并且主要與MHC-Ⅱ類分子結合[128-129]。一系列臨床前研究結果發現，IDH1（R132H）特異性肽疫苗在同源 MHC人源化小鼠中可以誘導特異性治療性 T 輔助細胞反應，有效對抗IDH1（R132H）+ 腫瘤[128, 130-132]。近期，德國海德堡大學附屬醫院的Michael Platten研究組[133]研制出了一種針對IDH1基因突變的腫瘤疫苗（IDH-vac），并開展了一項多中心、單臂、開放標簽、Ⅰ期臨床試驗，共入組了33例新診斷的WHO 3或4級IDH1（R132H）+ 星形膠質細胞瘤患者。在接受疫苗治療的32例患者中，總體反應率為84.4%（27例）；在可評價免疫反應的30例患者中，93.3%（28例）患者引起了免疫反應，3年無進展生存率和總生存率分別為0.63 ［95%CI（0.44，0.77）］和0.84 ［95%CI（0.67，0.93）］；2例免疫未應答的患者2年內出現病情進展，顯示出IDH新抗原疫苗具有良好的免疫反應及臨床療效。而突變占比更高的TP53、KRAS、PIK3CA等也得到了研究者的關注，并且在臨床前研究及臨床試驗中發現共享的突變基因來源的新抗原肽誘導了特異性的免疫反應[83, 134-137]。
6 結論和未來展望
近年來，隨著基因組學和蛋白質組學技術的進步以及生物信息學工具的發展，對腫瘤新抗原的篩選能力有所加強。另外，廣泛的基因組數據和計算機算法加速了腫瘤表位的預測，從而實現了新抗原表位的大規模篩選。但目前來說，新抗原疫苗仍然面臨著如何優化疫苗中包含的抗原類型和數量、如何識別和遞呈抗原等問題。同樣關鍵的因素是持續的免疫抑制對疫苗功效的影響，特別是T細胞的啟動和衰竭。隨著研究者對人體免疫系統及各種免疫療法的進一步探索，特別是免疫檢查點以及腫瘤微環境研究的深化，將有助于新抗原疫苗療法的進一步突破，有望為腫瘤患者帶來一種真正安全且有效的治療方式。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：吳秋吉整理資料與論文初稿撰寫；李秋指導選題與論文修改。
癌癥免疫治療被定義為通過免疫系統來識別和摧毀癌細胞。在過去的十年中，各種免疫療法在治療腫瘤方面取得了飛速發展，而在已被批準的免疫治療藥物中，治療性癌癥疫苗具有誘導針對腫瘤抗原特異性免疫反應的優勢。癌癥疫苗通常包括選定的腫瘤抗原、結合激活樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）的佐劑，或者DCs本身。治療性癌癥疫苗的目的是激活患者針對特定腫瘤抗原的適應性免疫系統，以控制腫瘤生長、誘導腫瘤消退并根除微小的殘留病灶。但治療性癌癥疫苗的有效性受到多種因素的影響，包括靶抗原的選擇、佐劑的使用以及癌癥疫苗在高度免疫抑制的腫瘤微環境中誘導抗腫瘤T細胞反應的能力[1-2]。其中抗原特異性治療性疫苗的效力在很大程度上取決于疫苗中抗原的性質。
盡管腫瘤相關抗原（tumor-associated antigen，TAA）具有在腫瘤中異常表達或過度表達的特點，但是由于TAA特異性T細胞受到中樞和（或）外周耐受的影響，其難以成功產生臨床有效的抗腫瘤免疫反應。最近，人們的注意力轉向了“新抗原”（neoantigen），它主要來源于腫瘤細胞突變而產生的獨特的自身抗原表位。因此，新抗原是腫瘤特異性的，被適應性免疫系統識別為外來表位。腫瘤新抗原可以激活不受免疫耐受影響的高活性細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte，CTL），并且可以防止對非惡性組織的“脫靶”損傷。此外，研究表明，這些疫苗誘導新抗原特異性 T 細胞反應增強且持續存在，并具有治療后免疫記憶的潛力，因而具有免于或推遲疾病復發的長期保護的可能性[3]。近年來，已有越來越多的研究證實新抗原是各個疫苗平臺的理想靶抗原。
因此，我們在既往研究的基礎上，對新抗原及新抗原疫苗的研究進展進行了闡述，總結了疫苗接種策略及相關臨床研究。最后，我們討論了個體化新抗原疫苗應用的障礙及可能有效的相關解決方案。
1 腫瘤新抗原形成及分類
腫瘤新抗原形成于腫瘤細胞中發生的突變，具有腫瘤細胞特有表達、且正常細胞不表達的特點。而在更廣泛的定義上，還包括人類內源性逆轉錄病毒（human endogenous retroviruses，HERVs）通過 DNA去甲基化在腫瘤中表達、翻譯后修飾[4-5]等。在此，本文僅涉及與突變相關的腫瘤新抗原。
1.1 單核苷酸變異（single-nucleotide variations，SNVs）
SNVs是腫瘤中最常見的基因組水平突變類型，由非同義突變編碼的蛋白質產生的變異肽可能通過主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）分子呈遞到腫瘤細胞表面，形成腫瘤抗原[6]。大多數SNVs通過單一氨基酸替代產生新的抗原。SNVs是臨床試驗中新抗原預測工作的重點。SNVs衍生的新抗原及抗原肽已成功在多個瘤種中篩選及制備，包括具有高突變負荷的黑色素瘤和肺癌，以及具有中低突變負荷的肝癌和膠質母細胞瘤[7-12]。最近的研究報道，在接受免疫檢查點抑制劑（immune checkpoints inhibitor，ICIs）治療的患者中，基于SNVs的新抗原負荷與ICIs臨床獲益相關[13-14]。但由于其與非突變的肽段本身相似，因此大部分SNVs衍生的新抗原并沒有免疫原性，需要進一步進行嚴格地篩選。而由于發生的隨機性質，體細胞癌癥突變是高度個體化的，由SNVs產生的新抗原極少在不同患者之間共享，限制了基于共有腫瘤新抗原的有效通用癌癥疫苗的開發。
1.2 核苷酸的插入或缺失（insertions or deletions of nucleotides，Indels）
腫瘤新抗原另外一種重要的來源為Indels。外顯子區域Indels的突變會導致密碼子的變化，形成新的開放閱讀框，并可能產生大量與自身高度不同的新抗原，多出現于高度微衛星不穩定的腫瘤[15]以及腎乳頭、嫌色或透明細胞腫瘤中[16]。Turajlic等[16]通過腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫分析了涉及19種腫瘤的5 777個實體瘤樣本的全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）數據，結果顯示，盡管Indels的發生頻率相較于SNVs較低，但Indels產生的新抗原比SNVs的更具免疫原性，這可能是因為移碼插入序列產生與已知序列無關的序列串，具有更強的異質性[15]。同樣，在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中，發現Indels衍生的預測新抗原的MHC- Ⅰ 結合親和力比SNVs高3.9倍[17]。另外，基于Indels的新抗原與黑色素瘤患者的抗程序性死亡受體 1（programmed cell death protein1，PD-1）或抗細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA4）的ICIs治療反應顯著相關[16]。
1.3 融合基因
融合基因可能來源于染色體內或染色體間的重排而導致的兩個無關基因的結合[18]。早期融合基因主要在血液腫瘤和滑膜肉瘤中被發現，如典型的BCR-ABL融合基因[19-20]。隨著二代測序技術的發展，在各類腫瘤中發現了大量新的融合基因，包括前列腺腫瘤、頭頸腫瘤等[21-22]。而研究結果表明，基因融合衍生的腫瘤新抗原具有良好的免疫原性[22-23]。Wei等[24]從6 552 個TCGA 樣本中預測了總共67 502個融合新抗原。與 SNVs和Indels 相比，融合基因可以產生高達6 倍的候選新抗原和高達11倍的特異性候選新抗原[24]。并且，研究者還發現，在TCGA 中5.8%的融合新抗原在患者之間共享[24]。但總體而言，融合基因是相對罕見的事件[25]，融合基因衍生的新抗原用于治療性疫苗仍需進一步的研究。
1.4 剪接變異體
剪接變異產生的大量轉錄物可以產生新的抗原，包括mRNA 剪接點突變、內含子保留或腫瘤細胞中剪接體機制失調等[26-29]。因此剪接變異衍生的新抗原是治療性新抗原疫苗擴展到其他具有顯著可變剪接的低突變腫瘤的方式之一。Kahles等[30]分析了來自TCGA 的8 705 例患者和 670名匹配的正常對照的WES和轉錄組測序（RNA Sequencing，RNA-seq）數據，證明了腫瘤特異性的外顯子-外顯子連接產生的多肽具有結合MHC- Ⅰ的潛力并可能充當新抗原。而Jayasinghe等[26]也同樣發現剪接位點產生突變誘導的新抗原的數量可能比錯義突變高幾倍，并且在部分剪接變異腫瘤中觀察到PD-1和程序性死亡-配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）的高表達，表明腫瘤中具有剪接突變的患者可能從ICIs治療中獲益。
2 新抗原的預測與鑒定
現在的新抗原預測一般需要經過樣本獲取、測序、人類白細胞抗原分型 ［（human leukocyte antigen，HLA）typing］、突變肽段的推測、預測HLA結合和抗原遞呈、選擇候選新抗原、排序等過程。
2.1 樣本選擇
高質量的腫瘤標本的獲取是執行新抗原預測和篩選的第一步。新鮮腫瘤組織的DNA完整性好，既可以用于DNA提取，也可以用于RNA提取。但是目前大多數已完成或者正在進行的研究主要集中于晚期腫瘤患者，通常需要在經病理確診之后進行額外的有創性操作以獲取腫瘤組織。而局部活檢穿刺獲取的樣本，因受限于實體腫瘤復雜的異質性，不能很好地代表腫瘤整體[31]，例如病變中支持腫瘤的間質細胞和血管系統，以及小塊壞死組織，在取樣操作前很難評估，可能會限制獲得用于測序的腫瘤DNA和RNA的質量和純度。因此，對于晚期患者，有研究探索了通過循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）以及胸水樣本進行新抗原篩選，分別從ctDNA和胸腹水測序突變中篩選了9條及12條具有高親和力的新抗原肽[32]，但僅有1條多肽能被自體T細胞所識別。用于新抗原鑒定的另一種常見組織選擇是甲醛固定的石蠟包埋（formalin-fixed, paraffinembedded，FFPE）樣本[10, 32]。FFPE樣本具有在臨床環境中常規收集的明顯優勢，但手術保留的FFPE標本可能間隔時間較久，而不能很好反映當前的腫瘤突變狀況。FFPE標本與新鮮標本的匹配結果顯示，FFPE樣本的變異數量是配對的新鮮冷凍樣本的5倍[33]。目前提出的可能解決方法包括FFPE樣本特定的DNA提取試劑盒以及選擇一種以上的工具對細胞變異進行篩選，取其共同變異部分，已有研究表明可提高與新鮮樣本的一致性[34]。但其局限性在于特異性尚可而敏感性不足，因為可能忽略了具有潛在臨床意義的變異。
2.2 突變識別
從患者身上獲取腫瘤活檢標本和非惡性組織樣本（通常是外周血單核細胞）提取DNA后，需進行WES，以比較腫瘤和胚系DNA[35-36]。通常需要額外的RNA測序以提供突變基因表達的信息用于進一步確認[27, 37-38]。許多現有的軟件工具用于實現突變識別。常用工具包括MuTect/MuTect2、Strelka/Strelka2、VarScan2、SomaticSniper、GATK等，它們在檢測不同的突變類別（如SNVs或Indels）、處理腫瘤異質性的同時保持可接受的準確度的能力各不相同[39-44]。如MuTect2和Strelka在檢測等位基因比例較低的SNVs時具有較高的敏感性，可以準確地檢測亞克隆變異。VarScan2和SomaticSniper通常在等位基因比例較高的情況下具有優勢，并且在區分生殖系變異和腫瘤變異方面具有更好的性能。目前還沒有統一的完美解決方案，通常的方法是針對不同的突變使用不同工具或者聯合使用[45]。
2.3 HLA結合
新抗原發現過程中最復雜的步驟是從通過測序手段鑒定的突變中進行抗原的計算和預測[46-47]。在患者中，已知存在16 000多個不同等位基因的經典人類白細胞抗原Ⅰ類分子（HLA-A/B/C）和8 000個Ⅱ類（HLA-DP/-DQ/-DR）分子[48-49]。突變肽具有與患者的至少一個MHC等位基因結合的能力，是形成 T 細胞識別的最基本要求。目前尚缺乏一致的方法來進行新抗原的預測。最近的研究通常使用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線作為性能指標來評估人類MHC- Ⅰ結合和呈遞的預測工具或小鼠T細胞反應的預測工具[50-51]。主要的預測算法包括基于人工神經網絡方法的NetMHC4[52]、基于泛特定方法的NetMHCpan[53]、基于位置特異性評分矩陣的PSSMHCpan[54]、免疫表位數據庫（Immune Epitope DataBase，IEDB）[55]等。最近的研究發現親和力以外的一些指標如MHC- Ⅰ結合穩定性、基因表達豐度和多肽異質性可以用來改善Ⅰ類新抗原預測的性能[56]。其中新抗原肽-MHC復合體的穩定性被認為比結合親和力更重要，因為更高的穩定性可能會增加該復合體被T細胞識別的可能性[57]。
到目前為止，表位預測方法主要集中在MHC- Ⅰ結合表位上，而MHC- Ⅱ結合表位預測的研究相對較少。抗原特異性CD4+和CD8+T細胞的協作對于有效的抗腫瘤免疫至關重要[58]。僅表達一種MHC- Ⅰ 新抗原是不夠的，腫瘤小鼠模型中有意義的抗腫瘤免疫至少需要一種額外的MHC- Ⅱ類新抗原[59]。事實上，已經在幾個臨床試驗中觀察到在接種疫苗后，優先誘導CD4+T細胞反應而不是CD8+T細胞反應[7-10, 60]。因此，個體化新抗原疫苗應包含預計與患者的MHC- Ⅰ和MHC- Ⅱ等位基因結合的新表位。MHC- Ⅰ型結合槽具有封閉的兩端，結合8～11個氨基酸長度的多肽，以便呈遞給CD8+T細胞。相比之下，MHC- Ⅱ肽結合槽有開放的兩端，這使得它能夠結合和呈現更長的肽。另外，MHC-Ⅱ分子核心結合部分兩側的肽區域可以影響肽的結合[61]。綜上所述，MHC- Ⅱ多肽結合的這些特征使免疫原性MHC- Ⅱ表位的鑒定變得復雜。Abelin等[62]開發了一種稱為MAPTAC（mono-allelic profiling technology）的分析技術，并在此基礎上訓練了結合預測算法neonmhc2。另外，Racle等[63]從23個不同的組織樣本中篩選了將近80 000個獨特的肽進行分析，開發了一種表位預測算法MixMHC2pred。另外，一種多模態遞歸神經網絡MARIA（具有遞歸集成架構的MHC分析）被開發用于預測HLA- Ⅱ復合物呈遞肽的可能性，并且其ROC達到了0.89～0.92[64]。而以往根據IEDB中的肽結合親和力數據開發的MHC- Ⅱ結合表位預測算法NetMHCIIpan也在2020年進行了更新，具有更好的預測水平[65]。
3 疫苗接種策略
3.1 直接注射抗原
合成肽疫苗是一種使用較多的個體化新抗原疫苗平臺。在研究早期，基于多肽的癌癥疫苗通常由MHC- Ⅰ結合短肽組成。盡管這些疫苗產生了相應的T 細胞反應，但其中大多數表達MHC- Ⅰ分子的細胞不專門用于抗原呈遞，從而導致T細胞啟動或耐受性不佳[66-67]。相比之下，合成長肽疫苗（synthetic long-peptide，SLP）接種必須在疫苗引流淋巴結中通過專業抗原遞呈細胞（如DCs）進行攝取和加工才能完成遞呈和T細胞活化。經DCs內化后,一部分SLP通過胞內體途徑降解并加載到MHC- Ⅱ分子上，允許CD4+T輔助細胞識別[68]。另一部分內吞SLP進入胞質，并由 MHC- Ⅰ分子交叉呈遞，激活 CD8+ CTL[69-70]。這種通過加工SLP從而產生抗原特異性CD8+ T 細胞反應的方式可以避免可能的CTL耐受機制[71]。另外SLP新抗原疫苗提供了潛在的MHC- Ⅱ類表位，從而涉及CD4+和 CD8+T細胞反應[72-73]。近年來，多項臨床試驗測試了SLP新抗原疫苗的功效。Ott等[7]為ⅢB/C期或Ⅳ期（M1a/b）的高危黑色素瘤患者設計并制備了包含20多種新抗原的個體化肽疫苗，并配合佐劑聚肌苷酸-聚胞苷酸（polyinosinic-Polycytidylic acid，Poly-ICLC）一起皮下注射，結果表明4例Ⅲ期黑色素瘤患者接受疫苗治療后32個月未見腫瘤復發，2例Ⅳ期黑色素瘤患者雖然在接受疫苗后仍發生腫瘤進展，但是在接受PD-1抑制劑后出現了完全的腫瘤消退。而更值得關注的是，55 個月的隨訪結果顯示，所有8例患者都還存活，6例患者沒有表現出活動性疾病的跡象。而且在接種新抗原個體化肽疫苗后，新抗原特異性 T 細胞反應在黑色素瘤患者中持續存在數年，并且持續存在記憶表型的新抗原特異性 T 細胞[3]。
DNA 疫苗可以通過將感興趣的基因插入細菌質粒來產生[74]。所有類型的表位都可以通過DNA格式進行編碼。DNA疫苗可以快速合成，在常規條件下保存，并可以通過皮下、肌內、皮內和黏膜注射方便地給藥[75]。新抗原DNA疫苗已在臨床前及臨床研究中被證明其能夠誘導針對腫瘤的有效免疫反應并且具有良好的安全性。最近，一種使用電穿孔介導的多種新抗原DNA疫苗被證明能在小鼠腫瘤模型中誘導與抗腫瘤免疫相關的CD8+T細胞反應[76]。Yang等[77]建立了一個基于DNA的多種新抗原疫苗平臺，證明了新抗原DNA疫苗能被DCs有效攝取并誘導針對小鼠黑色素瘤的有效免疫反應，從而顯著抑制黑色素瘤的生長。Aurisicchio等[78]通過結合電穿孔的新抗原DNA疫苗誘導了特異的免疫反應，并抑制了人源腫瘤組織來源的移植瘤模型的腫瘤生長。2022年美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology，ASCO）報告了一項基于新抗原DNA疫苗聯合白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）和 Pembrolizumab的1/2期臨床研究，研究結果顯示誘導了新抗原特異性的CD8+ 細胞，并報道1例患者獲得了部分緩解（partial response，PR）的療效[79]。
與DNA新抗原疫苗比較，RNA新抗原疫苗的制造相對簡單，并且具有內置的佐劑[80]。目前RNA疫苗主要直接注射到淋巴結內，在Ⅲ期和Ⅳ期黑色素瘤患者的Ⅰ期臨床試驗中，研究者為13例可評估的黑色素瘤患者設計了包含 20個患者特異性突變的新抗原RNA疫苗，研究結果表明新抗原RNA疫苗誘導了針對多種疫苗新表位的CD4+ 和CD8+T細胞反應，觀察到了客觀反應，并且通過接種疫苗顯著降低了累積復發率，從而誘導了持續的無進展生存獲益[8]。而脂質體運載（lipoplexes，LPX）技術以及脂質納米粒（lipid nanoparticle，LNP）遞送技術的發展[81-82]，為新抗原RNA疫苗提供了更多的給藥方式。最近在4例胃腸癌患者中進行的Ⅰ期臨床試驗的數據表明，用LNP進行新抗原RNA疫苗肌肉接種是安全的，并且可以誘導突變特異性T細胞反應[83]。
與多肽疫苗相比，核酸疫苗有助于抗原的持續有效表達和免疫刺激。重要的是，基于核酸的疫苗可使細胞自身合成抗原肽，避免了昂貴且困難的蛋白質純化，并為蛋白質配備了天然的翻譯后修飾。核酸疫苗在功效、縮短設計和制造時間以及生產可擴展性和可靠性方面具有優勢[84]。而比較DNA和RNA疫苗兩者，DNA攜帶遺傳信息，需要進入細胞核才能表達抗原，而mRNA在不進入細胞核的情況下以更好和集中的方式指導抗原的產生。此外，鑒于其固有的免疫原性特征，mRNA可以用作佐劑，并且僅需要較低的劑量來引發最佳的免疫反應，使其成為新抗原疫苗的安全和有前途的平臺[85]。但與多肽疫苗相比，核酸新抗原疫苗呈遞到DCs之前需要更多的加工步驟。
3.2 新抗原DCs疫苗
多肽及核酸新抗原疫苗均需面對如何被人體的抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APC）有效地攝取和呈遞的問題。而新抗原DCs疫苗可以通過與新抗原對應的肽進行共培養負載肽后，重新通過皮內、皮下或者靜脈注射等方式回輸至患者體內，從而避免體內抗原捕獲、處理、呈遞和DCs成熟的過程[86-87]。基于DCs的新抗原疫苗已在幾項臨床研究中進行了探索，包括高突變負荷的黑色素瘤[88-89]、NSCLC[90]、中低突變負荷的肝細胞癌[12]等。Carreno等[88]證明在Ⅲ期黑色素瘤患者中，新抗原DCs疫苗誘導的新抗原特異性T細胞的廣度和多樣性顯著增加。本課題組前期報道的一項研究中納入了12例無標準治療方案的晚期NSCLC患者，后續均接種了新抗原DCs疫苗，結果顯示該疫苗具有良好的安全性，可以誘導特定的 T 細胞免疫，顯示出25%的客觀應答率[90]；并且1例全身播散性轉移的晚期患者在接受5劑個體化DCs疫苗治療后，總體腫瘤病變減少了29%[90]。該試驗首次證明了基于新抗原的DCs疫苗對腫瘤患者的療效。
筆者團隊目前正在進行一項Ⅰ期臨床試驗，以探索在肝細胞癌中篩選新抗原肽的可行性，并在此基礎上確定負載新抗原DCs疫苗在具有高危復發風險的肝癌患者中的安全性及有效性（NCT04147078）。目前初步的研究結果證實，在肝細胞癌患者中進行新抗原DCs疫苗輔助治療是可行的，并且可以誘導新抗原特異性反應，而且具有良好的安全性。
目前，多數臨床試驗通過體外分化培養的單核細胞來源的DCs進行疫苗接種，主要是因為目前還不能獲得足夠數量的其他更相關的DCs亞群用于疫苗接種。然而，單核細胞來源的DCs并不具備其他DCs亞群所具有的完整的共刺激分子和抗原交叉遞呈機制[67]。傳統的1型DCs（cDC1）亞集已被證明在交叉呈遞和CD8+T細胞激活方面更優越，而cDC2亞集被認為可啟動CD4+T細胞[91]。此外DCs培養方案的改進將為大量獲取不同的DCs亞型提供了可能[92]，這將有助于確定DCs疫苗在誘導治療性抗腫瘤反應方面的真正生理潛力。
3.3 新型抗原遞送平臺
核酸或者基于多肽的新抗原疫苗往往可能面臨無法有效地前往或者靶向淋巴結DCs的情況，而納米顆粒（nanoparticles，NPs）長期以來一直是一種改善疫苗遞送的有吸引力的策略[93]。通過納米疫苗遞送系統，納米疫苗可以有效地輸送到二級淋巴組織并保留在淋巴結中相對較長的時間。其次，納米疫苗可以將多種協同佐劑和抗原共同遞送到淋巴結和APC[94-96]。并且通過共同封裝佐劑和抗原，納米疫苗可以改善其藥物有效載荷的藥代動力學特性，從而進一步增強由此產生的免疫調節作用[97]。Wang等[98]設計了一種基于腫瘤微酸性/近紅外光敏感的新抗原刺激性DCs納米疫苗，通過響應腫瘤微酸性信號，可控釋放卡托普利藥物用以降低N2型腫瘤相關中性粒細胞的免疫抑制作用；通過響應外源近紅外光信號產生的活性氧自由基用以提高原位腫瘤免疫原性；在H22荷瘤小鼠中實現83%的腫瘤完全消退并延長了存活時間。最近，Baharom等[99]報告了一種由自組裝納米顆粒疫苗平臺制備的新抗原多肽疫苗，與皮下免疫相比，靜脈內疫苗接種誘導了更高比例的T細胞特異性轉錄因子1（T-cell specific transcription factor 1，TCF1）陽性的CD8+PD-1+T細胞，并且在檢查點阻斷后，由靜脈回輸產生的干細胞樣細胞增殖并分化為效應細胞，與治療模型中的皮下回輸相比，產生了更好的抗腫瘤反應。基于新抗原多肽疫苗可能更主要引起CD4相關的免疫反應，Arbelaez等[100]設計了針對KRAS G12D突變相應新抗原多肽的陽離子脂質復合物（SLP-LPX），SLP-LPX免疫后可以刺激CD4+ 和 CD8+T 細胞，并以 CD8+T 細胞依賴性方式抑制腫瘤生長；另外還發現，SLP-LPX 疫苗與ICIs組合可以明顯抑制腫瘤的生長。同時，另外基于納米疫苗的兩項研究中也發現了類似的同時激活CD4+和CD8+T 細胞的現象[101-102]。以上結果均證明了使用納米遞送系統在新抗原疫苗中具有良好的前景。
4 新抗原疫苗發展中的常見障礙
盡管隨著測序技術以及各種算法的進一步發展，新抗原疫苗的發展已經有了長足的進步，但目前仍有許多挑戰需要解決。首先是需要再次強調的是惡性腫瘤異質性的本質，同一腫瘤病灶的多次活檢可能會發現不同的分子特征[103-104]，并且在患者的不同轉移灶或原發腫瘤中的候選新抗原不同[105]。基于當前的臨床實踐，許多新抗原疫苗方案都基于單個活檢樣本，這些樣本既不能完全捕獲所探測的單個腫瘤病變的異質性，也不能在寡轉移或多轉移疾病的情況下具有代表性[106]。因此，由此產生的復合新抗原疫苗可能只代表患者病變中目標的一小部分。
新抗原呈遞的復雜機制決定了新抗原預測的困境。對于腫瘤新抗原預測算法，必須考慮各種參數，例如抗原肽長度、抗原加工相關轉運體結合、MHC親和力、抗原肽結合的主要組織相容性復合物（peptide major histocompatibility complex，pMHC）的穩定性和腫瘤新抗原來源[107]。因此，基于機器學習和人工智能技術的預測算法仍必須通過驗證數據集進行不斷更新[108]。
另外，T 細胞耗竭是抗腫瘤免疫療法的主要挑戰之一。同樣，在新抗原疫苗的臨床研究中發現了誘導CD4+T細胞和CD8+T 細胞表達的多種抑制性受體 [7-10]，并導致細胞因子產生受損 ［腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNFα）、干擾素γ（interferon-gamma，IFN-γ）和IL-2］和T細胞增殖減少[109-112]。
針對腫瘤新抗原的各種免疫治療策略的最終目的是誘導和（或）放大腫瘤特異性T細胞反應。由于疫苗生產周期和患者病情進展的限制，許多針對腫瘤新抗原的臨床研究往往缺乏必要的時間來驗證預測的候選腫瘤新抗原的免疫學性質。在目前的研究中，酶聯免疫斑點試驗（enzyme-linked immunospot assay，ELISpot assay）常常用于評估新抗原特異性 T 細胞反應[113-114]，但其并不能用于確定抗原特異性 T 細胞反應的絕對數量。MHC多聚體技術也常用來檢測新抗原特異性T細胞。另外，腫瘤特異性T細胞反應也可以通過表征免疫治療前后患者T細胞受體池的變化來進行分析。這些工具共同提供了高度特異性檢測方式，但是真正實現臨床應用仍然存在較多障礙[115]。
如前所述，新抗原疫苗的制備通常需要經過標本獲取、DNA/RNA的提取、測序及分析、新抗原的預測和合成等一系列步驟，往往需要較長的制備周期。如Ott團隊[7]關于未經治療的高危黑色素瘤的臨床研究中，患者需經過3個月左右的時間才能接種新抗原疫苗；另外一Ⅰ b期膠質母細胞瘤臨床研究中，患者雖然在術后接受了放射治療，但平均約需要4個月時間才接種新抗原疫苗[10]。最近，Cai等[11]進行的臨床研究中，從肝切除到第一次接種疫苗的中位持續時間為86 d，范圍為59～159 d。對于腫瘤患者，縮短治療等待時間對預防疾病的進展十分關鍵。另外，目前新抗原疫苗的設計大多來自于SNVs，往往具有高度的個體特異性，而很少具有共享的新抗原。因此，每例患者均需要進行個體化的定制，從而導致高昂的治療成本。FDA批準的首款DCs的自體前列腺癌疫苗Sipuleucel-T（Provenge）3次治療的費用高達10萬美元，遠遠超過一般家庭的承受能力[116]。
5 針對新抗原有希望的免疫治療策略
5.1 提高新抗原預測的準確性
通過多點取樣并測序來預測腫瘤的新抗原需要額外的侵入性操作，可行性較差，很難在實際臨床上應用和推廣。計算算法的發展可以在一定程度上通過單點取樣估算患者整體的異質性。近期，Fang等[117]通過獲取69 例 NSCLC 患者的腫瘤WES數據，通過新的算法計算了單點取樣與多點取樣的腫瘤異質性，結果顯示新算法預測的單點取樣的異質性與整體具有高度相關性（r=0.96）；并且，研究發現在NSCLC患者中，腫瘤內異質低的患者克隆新抗原比例更高，且新抗原和 MHC 親和力能力得分更高。
隨著液體活檢技術的發展和成熟，患者血液中的ctDNA可以更容易進行收集及分析，并且ctDNA可以更全面地體現多部位疾病的特征，在既往研究中進行了嘗試。但ctDNA 樣本中突變的等位基因頻率通常很低，并且目前的技術僅限于檢測一組預定的突變，從而限制了其在新抗原預測中的價值，而需要進一步的技術突破。
5.2 聯合療法方案
癌癥疫苗研究領域的一項主要挑戰是我們如何提高T細胞的反應，特別是最大限度地誘導CD8+T 細胞的激活和擴增。為了實現這一目標，可能需要促進APC功能和T細胞最佳啟動的聯合療法。有可能實現這一目標的治療藥物包括ICIs、共刺激受體激動劑（如 CD40）、TOLL樣受體（toll-like receptors，TLR）激動劑等。另外，抗原疫苗安全且耐受性良好，與其他藥物結合使用增加毒性的風險較低。Knuschke及同事[118]的研究結果表明，在小鼠逆轉錄病毒模型中，治療性疫苗聯合ICIs療法可以誘導初始T細胞活化，并增強耗竭T 細胞的效應功能。近日，研究報道了在小鼠的MC38腫瘤模型中，新抗原疫苗和ICIs聯合治療有效地抑制了耗竭CD8+T 細胞和Treg細胞的增殖能力，增加了Th1-like CD4+T細胞和效應T細胞的比例，并且誘導抗原特異性 CD8+T 細胞群具有活躍的趨化因子信號傳導（Cxcr3+/Ccl5+）、較低的共抑制受體表達（Lag3–/Havcr2–）和更高的細胞毒性（Fasl+/Gzma+）。另外，在黑色素瘤的臨床研究中，2例患有復發性腫瘤的患者在接受Pembrolizumab 治療后腫瘤完全消退[7]，而在另外一項新抗原疫苗和ICIs聯合治療黑色素瘤、NSCLC和膀胱癌的臨床研中，聯合治療誘導了持久的新抗原特異性 T 細胞反應性，具有細胞毒性的新抗原特異性T細胞能夠遷移到腫瘤并且形成了表位擴散[89]。上述研究結果表明，新抗原疫苗接種和 ICIs 治療相結合可以通過各種機制增強T細胞反應并克服T細胞耗竭。截止至2022年6月，以“neoantigen vaccine”為檢索詞在國際臨床試驗注冊平臺（http://www. clinicaltrials.gov）中檢索到涉及新抗原疫苗聯合ICIs治療實體瘤的注冊臨床試驗共24項（表1），其中有7項研究聯合了雙免疫療法。在疫苗類型方面，包括DNA疫苗4項，RNA疫苗6項，DCs疫苗1項，其余均為多肽疫苗。
表1
個體化新抗原疫苗聯合ICIs的臨床試驗
5.3 新型免疫佐劑的應用
作為多肽疫苗的重要組成部分，在肽疫苗中添加免疫佐劑對于誘導有效的免疫反應至關重要[119]。傳統佐劑如弗氏不完全佐劑（incomplete Freund’s adjuvant，IFA）和鋁鹽在短肽疫苗相關研究中被發現可能會誘導 T 細胞滯留、衰竭、缺失等缺陷[120]。共刺激分子CD40 信號傳導介導 DCs 的活化，導致 MHC 分子、共刺激標志物的上調和促炎細胞因子釋放[121-122]。這提高了DCs啟動CD4+和 CD8+T細胞的能力。此外，通過CD40激活DCs可刺激有效的交叉呈遞，這對于誘導CD8+T細胞對腫瘤抗原的反應至關重要[123-125]。在一項針對GL261和NSCL61神經膠質瘤模型的研究中，研究者通過將FGK45（一種 CD40 的激動性抗體）添加到腫瘤裂解物疫苗中以探索CD40 激動性抗體在疫苗中的作用。結果證明，添加FGK45后可以在腫瘤模型中誘導更加明顯的免疫反應且延長了兩種腫瘤模型小鼠的存活。另一項涉及晚期前列腺癌的Ⅰ期試驗中，研究者制備了靶向前列腺特異性膜抗原的自體抗原提呈細胞疫苗，在部分患者中檢測到了CD8+T 細胞反應，并伴有高水平的外周血IFN-γ產生，但并沒有生存相關的療效獲益[126]。另外，TLR3 激動劑Poly-ICLC在新抗原疫苗中得到了廣泛地應用，在已報道的涉及黑色素瘤和膠質瘤的新抗原疫苗臨床研究中，添加了Poly-ICLC的新抗原疫苗可以有效地誘導特異性T細胞反應[7, 9-10]。近期，有研究者開發了一種具有載體和免疫佐劑雙重功能的低毒性膽固醇修飾的抗菌肽-DP7，它能夠通過TLR2-MyD88-NF-κB通路誘導DCs成熟和促炎細胞因子釋放，有效提高抗原呈遞效率，為提高疫苗療效提供了一種新的方案[127]。
5.4 通用型疫苗的探索
縮短疫苗的制備周期以及生產成本是新抗原疫苗進一步臨床應用需實現的目標之一。因此，眾多研究者將目標投向通用型新抗原疫苗。前期研究結果發現，神經膠質瘤中最常見的IDH1突變影響密碼132并編碼 IDH1（R132H），該 IDH1（R132H）具有一個共享的克隆新表位，并且主要與MHC-Ⅱ類分子結合[128-129]。一系列臨床前研究結果發現，IDH1（R132H）特異性肽疫苗在同源 MHC人源化小鼠中可以誘導特異性治療性 T 輔助細胞反應，有效對抗IDH1（R132H）+ 腫瘤[128, 130-132]。近期，德國海德堡大學附屬醫院的Michael Platten研究組[133]研制出了一種針對IDH1基因突變的腫瘤疫苗（IDH-vac），并開展了一項多中心、單臂、開放標簽、Ⅰ期臨床試驗，共入組了33例新診斷的WHO 3或4級IDH1（R132H）+ 星形膠質細胞瘤患者。在接受疫苗治療的32例患者中，總體反應率為84.4%（27例）；在可評價免疫反應的30例患者中，93.3%（28例）患者引起了免疫反應，3年無進展生存率和總生存率分別為0.63 ［95%CI（0.44，0.77）］和0.84 ［95%CI（0.67，0.93）］；2例免疫未應答的患者2年內出現病情進展，顯示出IDH新抗原疫苗具有良好的免疫反應及臨床療效。而突變占比更高的TP53、KRAS、PIK3CA等也得到了研究者的關注，并且在臨床前研究及臨床試驗中發現共享的突變基因來源的新抗原肽誘導了特異性的免疫反應[83, 134-137]。
6 結論和未來展望
近年來，隨著基因組學和蛋白質組學技術的進步以及生物信息學工具的發展，對腫瘤新抗原的篩選能力有所加強。另外，廣泛的基因組數據和計算機算法加速了腫瘤表位的預測，從而實現了新抗原表位的大規模篩選。但目前來說，新抗原疫苗仍然面臨著如何優化疫苗中包含的抗原類型和數量、如何識別和遞呈抗原等問題。同樣關鍵的因素是持續的免疫抑制對疫苗功效的影響，特別是T細胞的啟動和衰竭。隨著研究者對人體免疫系統及各種免疫療法的進一步探索，特別是免疫檢查點以及腫瘤微環境研究的深化，將有助于新抗原疫苗療法的進一步突破，有望為腫瘤患者帶來一種真正安全且有效的治療方式。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：吳秋吉整理資料與論文初稿撰寫；李秋指導選題與論文修改。
