引用本文： 何玲華, 陳剛, 佟虹興, 楊磊, 楊超, 李三利, 劉凱敏. 腫瘤相關中性粒細胞在肝細胞癌中的作用研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(8): 1109-1114. doi: 10.7507/1007-9424.202112012 復制
免疫治療的出現使中晚期肝細胞癌（以下簡稱肝癌）的治療發生了革命性的變化，但仍面臨應答率低、治療后耐藥等諸多挑戰。肝癌的腫瘤微環境是由腫瘤相關免疫細胞、細胞因子、細胞外基質等組成的一個復雜而動態的內外環境，其免疫抑制特性和肝臟本身的免疫耐受特性使得腫瘤細胞更易發生免疫逃逸，是當前免疫治療的一大阻礙[1-2]。目前，靶向腫瘤微環境中的抑制性免疫細胞是阻斷腫瘤免疫逃逸的重點和熱點。中性粒細胞作為人體最豐富的炎癥細胞，也是肝癌免疫抑制性微環境的重要組成部分，與肝癌的發生發展、免疫逃逸及藥物敏感性密切相關。大量的研究表明，這些腫瘤相關中性粒細胞（tumor associated neutrophils，TANs）同時具有抗腫瘤和促腫瘤作用，但其在肝癌中的具體調控及作用機制尚不清楚。筆者擬總結TANs在肝癌發生發展及預后中的重要作用，以期更好地理解肝癌的免疫學微環境，為改善肝癌的免疫治療療效和尋找新的臨床治療靶點提供理論依據。
1 TANs概述
中性粒細胞是人體抵御感染和組織損傷的第二道防線，對包括腫瘤在內的多種炎癥信號迅速作出反應，并獲得不同的表型和功能以適應不同的炎癥環境。為了發揮直接的抗腫瘤作用，中性粒細胞在腫瘤細胞或其他腫瘤相關免疫細胞產生的趨化因子介導下被吸引到腫瘤組織中，并被激活產生細胞毒性分子和額外的趨化因子，從而吸引更多的中性粒細胞進入微環境與腫瘤細胞發生相互作用[3]。
中性粒細胞的可塑性和多樣性是TANs在腫瘤微環境中具有雙重潛能的基礎。與腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAMs）相似，TANs可以極化為抗腫瘤的N1和親腫瘤的N2兩種表型[4]。N1表型TANs具有較高水平的細胞間黏附分子-1、干擾素γ、誘導蛋白10、C-X-C基序配體（chemokine C-X-C motif ligand，CXCL）10、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等促炎表型，可通過直接的腫瘤細胞毒性或激活細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和自然殺傷細胞增強抗腫瘤免疫，間接清除腫瘤細胞；N2表型TANs通過分泌促腫瘤生長因子和重塑細胞外基質來促進腫瘤細胞的增殖和遷移[5-6]。此外，N2表型TANs還可促進腫瘤細胞的血管生成，抑制CTL和自然殺傷細胞的抗腫瘤功能[7]。依據中性粒細胞在血液中的密度梯度可分為高密度中性粒細胞（high-density neutrophil，HDN）和低密度中性粒細胞（low-density neutrophil，LDN），HDN亞群的細胞密度大于1.080 g/mL，而LDN的細胞密度低于1.077 g/mL[8]。循環中的LDN是從骨髓中釋放出來的不成熟的、帶狀的或是經歷了脫顆粒的成熟及衰老的中性粒細胞，具有免疫抑制特性的促腫瘤作用，而HDN則發揮主要的抗腫瘤作用，二者（LDN/HDN）的比值隨腫瘤的進展而增加，這表明TANs的抗腫瘤功能在腫瘤發展的早期占主導地位，而促腫瘤功能則在晚期占優勢[9]。另外，中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）能夠喚醒和誘捕休眠的癌細胞并作為其黏附底物促進腫瘤的發生和轉移[10]。在轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和粒細胞集落刺激因子作用下， N1表型可轉化為N2表型；相反，阻斷TGF-β或Ⅰ型干擾素治療可使TANs從N2表型向N1表型轉變[11-12]。
2 TANs在肝癌發生發展中的作用
2.1 促腫瘤作用
TANs可能通過多種機制（圖1）直接或間接影響肝癌的生長和侵襲。 中性粒細胞本身作為趨化因子的主要來源，在腫瘤源性趨化因子作用下進一步自分泌[13]。腫瘤微環境中的多種趨化因子不僅對肝癌細胞和抑制性免疫細胞的遷移具有重要的作用，還可誘導血管和淋巴管生成，選擇性阻斷TANs促腫瘤相關信號通路和趨化因子網絡，可為肝癌患者提供有效的治療靶點。
圖1
示TANs通過多種機制在腫瘤源性趨化因子的作用下向肝癌微環境中浸潤，發揮促腫瘤作用
CAFs：腫瘤相關成纖維細胞；CLCF1：心肌營養素樣細胞因子1；CXCL5：C-X-C基序配體5；CXCL6：C-X-C基序配體6；TGF-β：轉化生長因子β；HGF：肝細胞生長因子；MET：HGF的特異性受體；IL-6：白介素-6；IL-8：白介素-8；JAK-STAT3：酪氨酸激酶/信號轉導子和轉錄激活子3信號通路； HCC：肝細胞癌；TANs：腫瘤相關中性粒細胞；CSF-1：粒細胞集落刺激因子；PNCs：癌前細胞；PD-1/PD-L1：程序性死亡受體1及其配體1；CYLD：家族性毛發上皮瘤家系腫瘤抑制基因；LSAMP：邊緣系統相關膜蛋白；BMP2：骨形態發生蛋白2；NF-κB：核因子κB
腫瘤微環境中的TANs高度浸潤往往與預后不良有關[14]。在缺氧條件下，肝癌細胞來源的CXCL5促進TANs向腫瘤組織遷移，同時增強巨噬細胞和調節性T細胞（regulatory cells，Tregs）的遷移活性，索拉菲尼的抗血管生成作用進一步加重組織缺氧，可增加腫瘤組織中TANs浸潤從而介導其抗藥性[15]。腫瘤相關成纖維細胞（tumor associated fibroblasts，CAFs）衍生的心肌營養素樣細胞因子1 （cardiotrophin like cytokine factor 1，CLCF1）增加腫瘤細胞CXCL6和TGF-β的分泌，并以旁分泌方式促進TANs的浸潤和極化。肝癌細胞分泌的CXCL6和TGF-β，激活細胞外信號調節激酶1/2信號，產生更多的CLCF1，從而形成一個正反饋環，加速肝癌的進展。在臨床標本中同樣發現，CLCF1-CXCL6/TGF-β軸的上調與肝癌干細胞增多、TANs的N2表型極化、腫瘤分期及預后不良密切相關[16]。此外，CAFs產生的肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）通過與其特異性受體Met作用，參與細胞增殖、存活、侵襲、血管生成等多種致瘤過程。肝癌細胞來源的巨噬細胞集落刺激因子激活TANs亦可產生HGF，抗中性粒細胞或抗HGF抗體治療可抑制腫瘤進展[17]。還有研究[18]表明，CAFs來源的白介素（interleukin，IL）-6通過酪氨酸激酶/信號轉導子和轉錄激活子3（janus kinase-signal transducer and activator of transcription 3，JAK-STAT3）信號通路激活TANs，活化的TANs可通過程序性死亡受體1及其配體1（programmed cell death-1/programmed cell death-ligand 1，PD1/PD-L1）信號通路抑制T細胞免疫，從而為肝癌的進展創造有利條件。 Zhou等[19]通過體內實驗研究發現，N2型TANs分泌骨形態發生蛋白2和TGF-β2，觸發肝癌細胞微小RNA 301b-3p（miR-301b-3p）表達，進而抑制邊緣系統相關膜蛋白和家族性毛發上皮瘤家系腫瘤抑制基因的表達，增強肝癌細胞的干細胞特性。
目前TANs的促腫瘤作用證據大多來自已經建立的腫瘤模型研究，而中性粒細胞在腫瘤發生前階段的作用卻知之甚少，這在很大程度上歸因于在人類和哺乳動物模型中很難發現腫瘤發生的早期階段。在轉基因斑馬魚肝癌模型中，常見癌基因kras、Xmrk和Myc的突變使得癌前細胞中的中性粒細胞趨化因子、巨噬細胞趨化因子1以及TGF-β的表達增加，并觸發了中性粒細胞和巨噬細胞向肝臟的浸潤，耗竭TANs和TAMs可導致肝臟部分增大，癌前細胞增殖減少，使肝臟恢復到野生型。此外，雄性斑馬魚可產生較高的皮質醇，使TANs和TAMs浸潤增強，從而促進肝癌的發生，這與在人類肝癌中觀察到的發病率性別差異是一致的[20-21]。de Oliveira等[22]通過DnaJ-PKAc融合蛋白（熱休克蛋白40的第一個外顯子DNAJB1和蛋白激酶A催化亞單位的外顯子PRKACA2-10融合而成）的轉基因表達模擬的肝纖維板層癌斑馬魚模型中，幼蟲出現以肝組織中性粒細胞和巨噬細胞浸潤增加為特征的早期天然免疫炎癥，TNF-α陽性表達的巨噬細胞增加，同時肝內胱冬肽酶-1活化，抑制TNF-α或胱冬肽酶-1可使中性粒細胞和巨噬細胞數量減少到野生型水平，提示這些細胞因子可作為TANs的招募因子。
2.2 抗腫瘤作用
TANs在肝癌微環境中的抗腫瘤作用是不容忽視的。只有一小部分（4%～10%）的N1亞群與腫瘤細胞發生相互作用，并在特定時間點顯示出抗腫瘤活性[23-24]。 除了通過釋放活性氧、刺激T細胞反應、協助抗原提呈等途徑殺傷腫瘤細胞，TANs還通過作用于多種炎癥小體或致癌基因，減輕肝臟炎癥、逆轉早期肝纖維化，從而阻礙肝癌的發生和進展。敲除小鼠抗炎微小RNA-223（miR-223）相關基因可上調包括CXCL10和具有PDz結合域的轉錄共刺激因子在內的炎癥和致癌基因表達。 而中性粒細胞來源的外泌體可向巨噬細胞傳遞miR-223并促進其抗炎表型轉換，介導肝臟炎癥和纖維化的自發緩解，淋巴細胞抗原抗體6G（lymphocyte antigen 6G，Ly-6G）中和循環中性粒細胞后肝臟出現明顯的炎癥壞死性改變[25-26]。此外，還有研究[27]表明，TANs的氧化損傷機制之一是通過產生H2O2上調瞬時受體電位陽離子通道M亞家族成員2（transient receptor potential cation channel member 2，TRPM2）的表達，誘導Ca2+大量內流殺傷腫瘤細胞，阻斷TRPM2的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖，減慢腫瘤的生長。TRPM2在癌組織中的表達高于在正常組織中的表達，但腫瘤細胞的TRPM2表達水平與中性粒細胞毒性的敏感程度之間的相關性，還需要進一步的探索。
由于中性粒細胞減少可能增加患者發生感染等風險，因此靶向TANs的治療策略應以促進其抗腫瘤功能為重點，但仍需要更多的研究來闡明在肝癌背景下抗腫瘤表型TANs不同亞群的招募和極化信號通路，以及它們在腫瘤微環境中與肝癌細胞和其他免疫細胞的相互作用機制。
2.3 NETs
NETs 是中性粒細胞活化后DNA、組蛋白和顆粒酶類組分如中性粒細胞彈性酶和髓過氧化物酶釋放至胞外而形成的網狀結構，能夠捕獲、殺死病原體和癌細胞[28]。NETs水平在肝癌患者中總體上是升高的，尤其在轉移性肝癌中，它誘捕循環中的癌細胞并進一步激活Toll樣受體4/9-環氧化酶2（Toll4/9-COX2）通路，促進癌細胞在肝臟微循環中的早期黏附、遷移和侵襲，而血管內NETs的形成會損害內皮細胞的完整性，促進腫瘤遠處轉移，因而在轉移性肝癌中NETs水平更高[29-30]。脫氧核糖核酸酶Ⅰ直接破壞網狀結構，與抗炎藥物阿司匹林與羥基氯喹聯合應用可有效減少小鼠肝癌模型的轉移[30]。Zenlander等[31]近年的研究顯示，肝癌組和肝硬化組血漿瓜氨酸化組蛋白H3（citrullinated histone H3，H3Cit） -DNA、凝血酶-抗凝血酶（thrombin.-antithrombin，TAT）水平均顯著高于健康對照組（H3Cit-DNA：66.4 ng/mL、63.8 ng/mL、31.8 ng/mL，P<0.01；TAT：3.1 mg/mL、3.7 mg/mL、0.0 mg/mL，P<0.01），肝硬化組血漿髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO） -DNA明顯高于正常對照組和肝癌組，終末期肝病模型（model for end-stage liver dIsease，MELD）評分為≥14分的患者MPO-DNA和H3Cit-DNA水平顯著高于MELD評分<14分的患者。該結果提示肝硬化患者血漿中與NETs形成相關的標志物水平升高，并與肝功能損害程度相關。然而，與單純肝硬化患者相比，肝癌的存在并沒有使血漿MPO-DNA或H3Cit-DNA的水平進一步提高，雖然腫瘤直徑≥8 cm的肝癌患者的H3Cit-DNA水平升高，但不能作為多變量分析的獨立預測指標。此外，還有研究[32-33]表明，Tregs增多可增強非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）肝臟微環境的免疫抑制，NETs在TGF-β和IL-2的作用下誘導幼稚CD4+ T細胞向Tregs分化并通過代謝重新編程調節Tregs活性，從而促進NASH相關肝癌的發生，深入探究NETs和Tregs之間的相互作用，可以為預防NASH患者肝癌的發生提供一種潛在的策略。
NETs的發現為腫瘤學開辟了一全新的研究領域。越來越多的證據表明，NETs在肝癌發展的各階段均起著重要作用。深入研究肝癌與TANs間的相互作用有助于闡明肝癌免疫反應的基本機制，準確識別肝癌組織或循環中的NETs及其標志物，并制定新的治療干預措施以阻止腫瘤逃逸和轉移擴散。
3 中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutro- phils to lymphocytes ratio，NLR）在肝癌預后中的臨床意義
以炎癥為基礎的標志物與肝癌預后的關系是腫瘤預后標志物研究的一大熱點。NLR是評價全身炎癥變化的一種有效指標，反映了中性粒細胞相關的促腫瘤炎癥與淋巴細胞依賴性抗腫瘤免疫功能之間的潛在平衡。 多項研究已證實，NLR與接受肝移植、肝切除、經肝動脈化療栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）、射頻消融和分子靶向藥物治療的肝癌患者的預后密切相關，治療前高NLR 可作為一個預后不良的獨立預測指標[34-35]。NLR在晚期肝癌的免疫治療單藥及聯合治療中同樣具有預測價值。Hung等[36]回顧性分析了接受抗PD-1單克隆抗體（Nivolumab）單藥治療的晚期肝癌患者的臨床資料，結果顯示疾病進展（progressive disease，PD）組血清NLR明顯高于非PD組（4.4±2.3比2.9±1.3，P=0.028）；在治療前、開始治療后和治療14 d后，血清NLR的最優截斷值分別為2.52、4.08和2.72，高NLR組疾病無進展生存率（progressives free survival，PFS）均較低NLR組差。Eso等[37]對40例接受抗PD-1單抗聯合抗血管內皮生長因子抑制劑（Atezolizumab+Bevatizumab）治療的肝癌患者的治療過程進行分析，應用ROC曲線分析確定最優NLR截斷值為3.21，低NLR組客觀緩解率和疾病控制率分別為41.7%（10/24）和87.5%（21/24），高NLR組分別為13.3%（2/15）和33.3%（5/15）；低NLR組的 50、100、150和200 d的累積PFS分別為96.0%、80.0%、64.0%和44.0%，高NLR組分別為66.7%、26.7%、20.0%和0.0%，這表明與高NLR組相比，低NLR組應答率更高、PFS明顯提高。還有研究[38]報道了NLR對TACE+侖伐替尼+免疫檢查點抑制劑三聯轉化治療晚期不可切除肝癌療效的預測價值，結果顯示以2.960為最優截斷值，高NLR組的24和48周的累積PFS分別為83.2% ［95%CI 為（75.5%，90.2%）］ 和58.3% ［95%CI為（44.4%，72.4%）］，低NLR組的24周和48周PFS均為100%。
中性粒細胞在人類和小鼠中的壽命可從正常情況下的7 h延長到癌癥病例中的17 h[39]。與此相一致的證據表明，腫瘤和基質細胞產生的細胞因子，包括粒細胞集落刺激因子、IL-6、血管內皮生長因子-α和IL-1β，可引起中性粒細胞計數增多并誘導及增強這些中性粒細胞的免疫抑制特性[40-41]。 另外，中性粒細胞在腫瘤微環境中的計數也比在脾臟內多，表明腫瘤生態位有助于延長其在局部和循環中的生存時間[42]。更長的壽命可以給中性粒細胞更多的時間來合成和釋放更多的分子，并在腫瘤發展過程中有效地發揮作用。免疫抑制性淋巴細胞，如CD8+ T淋巴細胞、髓源性抑制細胞、Tregs等，在抑制腫瘤相關免疫方面起著重要作用，其高度浸潤與預后不良密切相關[43-44]。 但腫瘤浸潤淋巴細胞在間質、瘤周和瘤內不同位置的預后價值仍不清楚。總的來說，NLR升高可能反映腫瘤相關炎癥增加和機體抗腫瘤免疫功能下降的趨勢，也可能是由于造血干細胞向粒細胞系的分化傾斜以及中性粒細胞對T細胞增殖和溶細胞活性的抑制作用減弱所致。此外，肝癌患者NLR升高與高惡性腫瘤特征有關，如血管侵犯、多個腫瘤的存在和高甲胎蛋白水平，還易受到年齡、肥胖、體質量減輕、服用類固醇、飲酒、脂肪肝、營養不良、糖尿病等多種因素的影響[45-46]。目前NLR的最優截斷值尚無統一的標準，特別在免疫治療與其他治療的聯合方案中，大多數研究為單中心研究，樣本量小，未進行多因素分析，且隨訪時間短，NLR與總生存期之間的相關性未得到檢驗。
4 小結與展望
越來越多的研究表明，TANs和NETs在肝癌的發生發展中起著至關重要的作用。在腫瘤微環境中，中性粒細胞、肝癌細胞和其他成分之間的相互作用受到多種信號通路的調控，一些與TANs相關的參數已被用作肝癌患者臨床預后的有效預測性生物標志物。進一步在基礎與臨床研究中探索中性粒細胞在肝癌中的確切作用是非常必要的，這無疑將進一步加深我們對肝癌病理生理的認識，并尋求治療上的突破。隨著腫瘤相關免疫抑制性中性粒細胞的功能和靶向中性粒細胞新型治療的研究成果不斷積累，預計在未來10年中，更多的肝癌患者將從免疫治療和個性化靶向治療中受益。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：何玲華負責文章的撰寫；陳剛負責文章內容的審閱及提出修改意見；佟虹興、楊磊、楊超、李三利和劉凱敏負責文獻的補充查閱。
免疫治療的出現使中晚期肝細胞癌（以下簡稱肝癌）的治療發生了革命性的變化，但仍面臨應答率低、治療后耐藥等諸多挑戰。肝癌的腫瘤微環境是由腫瘤相關免疫細胞、細胞因子、細胞外基質等組成的一個復雜而動態的內外環境，其免疫抑制特性和肝臟本身的免疫耐受特性使得腫瘤細胞更易發生免疫逃逸，是當前免疫治療的一大阻礙[1-2]。目前，靶向腫瘤微環境中的抑制性免疫細胞是阻斷腫瘤免疫逃逸的重點和熱點。中性粒細胞作為人體最豐富的炎癥細胞，也是肝癌免疫抑制性微環境的重要組成部分，與肝癌的發生發展、免疫逃逸及藥物敏感性密切相關。大量的研究表明，這些腫瘤相關中性粒細胞（tumor associated neutrophils，TANs）同時具有抗腫瘤和促腫瘤作用，但其在肝癌中的具體調控及作用機制尚不清楚。筆者擬總結TANs在肝癌發生發展及預后中的重要作用，以期更好地理解肝癌的免疫學微環境，為改善肝癌的免疫治療療效和尋找新的臨床治療靶點提供理論依據。
1 TANs概述
中性粒細胞是人體抵御感染和組織損傷的第二道防線，對包括腫瘤在內的多種炎癥信號迅速作出反應，并獲得不同的表型和功能以適應不同的炎癥環境。為了發揮直接的抗腫瘤作用，中性粒細胞在腫瘤細胞或其他腫瘤相關免疫細胞產生的趨化因子介導下被吸引到腫瘤組織中，并被激活產生細胞毒性分子和額外的趨化因子，從而吸引更多的中性粒細胞進入微環境與腫瘤細胞發生相互作用[3]。
中性粒細胞的可塑性和多樣性是TANs在腫瘤微環境中具有雙重潛能的基礎。與腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAMs）相似，TANs可以極化為抗腫瘤的N1和親腫瘤的N2兩種表型[4]。N1表型TANs具有較高水平的細胞間黏附分子-1、干擾素γ、誘導蛋白10、C-X-C基序配體（chemokine C-X-C motif ligand，CXCL）10、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等促炎表型，可通過直接的腫瘤細胞毒性或激活細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和自然殺傷細胞增強抗腫瘤免疫，間接清除腫瘤細胞；N2表型TANs通過分泌促腫瘤生長因子和重塑細胞外基質來促進腫瘤細胞的增殖和遷移[5-6]。此外，N2表型TANs還可促進腫瘤細胞的血管生成，抑制CTL和自然殺傷細胞的抗腫瘤功能[7]。依據中性粒細胞在血液中的密度梯度可分為高密度中性粒細胞（high-density neutrophil，HDN）和低密度中性粒細胞（low-density neutrophil，LDN），HDN亞群的細胞密度大于1.080 g/mL，而LDN的細胞密度低于1.077 g/mL[8]。循環中的LDN是從骨髓中釋放出來的不成熟的、帶狀的或是經歷了脫顆粒的成熟及衰老的中性粒細胞，具有免疫抑制特性的促腫瘤作用，而HDN則發揮主要的抗腫瘤作用，二者（LDN/HDN）的比值隨腫瘤的進展而增加，這表明TANs的抗腫瘤功能在腫瘤發展的早期占主導地位，而促腫瘤功能則在晚期占優勢[9]。另外，中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）能夠喚醒和誘捕休眠的癌細胞并作為其黏附底物促進腫瘤的發生和轉移[10]。在轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和粒細胞集落刺激因子作用下， N1表型可轉化為N2表型；相反，阻斷TGF-β或Ⅰ型干擾素治療可使TANs從N2表型向N1表型轉變[11-12]。
2 TANs在肝癌發生發展中的作用
2.1 促腫瘤作用
TANs可能通過多種機制（圖1）直接或間接影響肝癌的生長和侵襲。 中性粒細胞本身作為趨化因子的主要來源，在腫瘤源性趨化因子作用下進一步自分泌[13]。腫瘤微環境中的多種趨化因子不僅對肝癌細胞和抑制性免疫細胞的遷移具有重要的作用，還可誘導血管和淋巴管生成，選擇性阻斷TANs促腫瘤相關信號通路和趨化因子網絡，可為肝癌患者提供有效的治療靶點。
圖1
示TANs通過多種機制在腫瘤源性趨化因子的作用下向肝癌微環境中浸潤，發揮促腫瘤作用
CAFs：腫瘤相關成纖維細胞；CLCF1：心肌營養素樣細胞因子1；CXCL5：C-X-C基序配體5；CXCL6：C-X-C基序配體6；TGF-β：轉化生長因子β；HGF：肝細胞生長因子；MET：HGF的特異性受體；IL-6：白介素-6；IL-8：白介素-8；JAK-STAT3：酪氨酸激酶/信號轉導子和轉錄激活子3信號通路； HCC：肝細胞癌；TANs：腫瘤相關中性粒細胞；CSF-1：粒細胞集落刺激因子；PNCs：癌前細胞；PD-1/PD-L1：程序性死亡受體1及其配體1；CYLD：家族性毛發上皮瘤家系腫瘤抑制基因；LSAMP：邊緣系統相關膜蛋白；BMP2：骨形態發生蛋白2；NF-κB：核因子κB
腫瘤微環境中的TANs高度浸潤往往與預后不良有關[14]。在缺氧條件下，肝癌細胞來源的CXCL5促進TANs向腫瘤組織遷移，同時增強巨噬細胞和調節性T細胞（regulatory cells，Tregs）的遷移活性，索拉菲尼的抗血管生成作用進一步加重組織缺氧，可增加腫瘤組織中TANs浸潤從而介導其抗藥性[15]。腫瘤相關成纖維細胞（tumor associated fibroblasts，CAFs）衍生的心肌營養素樣細胞因子1 （cardiotrophin like cytokine factor 1，CLCF1）增加腫瘤細胞CXCL6和TGF-β的分泌，并以旁分泌方式促進TANs的浸潤和極化。肝癌細胞分泌的CXCL6和TGF-β，激活細胞外信號調節激酶1/2信號，產生更多的CLCF1，從而形成一個正反饋環，加速肝癌的進展。在臨床標本中同樣發現，CLCF1-CXCL6/TGF-β軸的上調與肝癌干細胞增多、TANs的N2表型極化、腫瘤分期及預后不良密切相關[16]。此外，CAFs產生的肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）通過與其特異性受體Met作用，參與細胞增殖、存活、侵襲、血管生成等多種致瘤過程。肝癌細胞來源的巨噬細胞集落刺激因子激活TANs亦可產生HGF，抗中性粒細胞或抗HGF抗體治療可抑制腫瘤進展[17]。還有研究[18]表明，CAFs來源的白介素（interleukin，IL）-6通過酪氨酸激酶/信號轉導子和轉錄激活子3（janus kinase-signal transducer and activator of transcription 3，JAK-STAT3）信號通路激活TANs，活化的TANs可通過程序性死亡受體1及其配體1（programmed cell death-1/programmed cell death-ligand 1，PD1/PD-L1）信號通路抑制T細胞免疫，從而為肝癌的進展創造有利條件。 Zhou等[19]通過體內實驗研究發現，N2型TANs分泌骨形態發生蛋白2和TGF-β2，觸發肝癌細胞微小RNA 301b-3p（miR-301b-3p）表達，進而抑制邊緣系統相關膜蛋白和家族性毛發上皮瘤家系腫瘤抑制基因的表達，增強肝癌細胞的干細胞特性。
目前TANs的促腫瘤作用證據大多來自已經建立的腫瘤模型研究，而中性粒細胞在腫瘤發生前階段的作用卻知之甚少，這在很大程度上歸因于在人類和哺乳動物模型中很難發現腫瘤發生的早期階段。在轉基因斑馬魚肝癌模型中，常見癌基因kras、Xmrk和Myc的突變使得癌前細胞中的中性粒細胞趨化因子、巨噬細胞趨化因子1以及TGF-β的表達增加，并觸發了中性粒細胞和巨噬細胞向肝臟的浸潤，耗竭TANs和TAMs可導致肝臟部分增大，癌前細胞增殖減少，使肝臟恢復到野生型。此外，雄性斑馬魚可產生較高的皮質醇，使TANs和TAMs浸潤增強，從而促進肝癌的發生，這與在人類肝癌中觀察到的發病率性別差異是一致的[20-21]。de Oliveira等[22]通過DnaJ-PKAc融合蛋白（熱休克蛋白40的第一個外顯子DNAJB1和蛋白激酶A催化亞單位的外顯子PRKACA2-10融合而成）的轉基因表達模擬的肝纖維板層癌斑馬魚模型中，幼蟲出現以肝組織中性粒細胞和巨噬細胞浸潤增加為特征的早期天然免疫炎癥，TNF-α陽性表達的巨噬細胞增加，同時肝內胱冬肽酶-1活化，抑制TNF-α或胱冬肽酶-1可使中性粒細胞和巨噬細胞數量減少到野生型水平，提示這些細胞因子可作為TANs的招募因子。
2.2 抗腫瘤作用
TANs在肝癌微環境中的抗腫瘤作用是不容忽視的。只有一小部分（4%～10%）的N1亞群與腫瘤細胞發生相互作用，并在特定時間點顯示出抗腫瘤活性[23-24]。 除了通過釋放活性氧、刺激T細胞反應、協助抗原提呈等途徑殺傷腫瘤細胞，TANs還通過作用于多種炎癥小體或致癌基因，減輕肝臟炎癥、逆轉早期肝纖維化，從而阻礙肝癌的發生和進展。敲除小鼠抗炎微小RNA-223（miR-223）相關基因可上調包括CXCL10和具有PDz結合域的轉錄共刺激因子在內的炎癥和致癌基因表達。 而中性粒細胞來源的外泌體可向巨噬細胞傳遞miR-223并促進其抗炎表型轉換，介導肝臟炎癥和纖維化的自發緩解，淋巴細胞抗原抗體6G（lymphocyte antigen 6G，Ly-6G）中和循環中性粒細胞后肝臟出現明顯的炎癥壞死性改變[25-26]。此外，還有研究[27]表明，TANs的氧化損傷機制之一是通過產生H2O2上調瞬時受體電位陽離子通道M亞家族成員2（transient receptor potential cation channel member 2，TRPM2）的表達，誘導Ca2+大量內流殺傷腫瘤細胞，阻斷TRPM2的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖，減慢腫瘤的生長。TRPM2在癌組織中的表達高于在正常組織中的表達，但腫瘤細胞的TRPM2表達水平與中性粒細胞毒性的敏感程度之間的相關性，還需要進一步的探索。
由于中性粒細胞減少可能增加患者發生感染等風險，因此靶向TANs的治療策略應以促進其抗腫瘤功能為重點，但仍需要更多的研究來闡明在肝癌背景下抗腫瘤表型TANs不同亞群的招募和極化信號通路，以及它們在腫瘤微環境中與肝癌細胞和其他免疫細胞的相互作用機制。
2.3 NETs
NETs 是中性粒細胞活化后DNA、組蛋白和顆粒酶類組分如中性粒細胞彈性酶和髓過氧化物酶釋放至胞外而形成的網狀結構，能夠捕獲、殺死病原體和癌細胞[28]。NETs水平在肝癌患者中總體上是升高的，尤其在轉移性肝癌中，它誘捕循環中的癌細胞并進一步激活Toll樣受體4/9-環氧化酶2（Toll4/9-COX2）通路，促進癌細胞在肝臟微循環中的早期黏附、遷移和侵襲，而血管內NETs的形成會損害內皮細胞的完整性，促進腫瘤遠處轉移，因而在轉移性肝癌中NETs水平更高[29-30]。脫氧核糖核酸酶Ⅰ直接破壞網狀結構，與抗炎藥物阿司匹林與羥基氯喹聯合應用可有效減少小鼠肝癌模型的轉移[30]。Zenlander等[31]近年的研究顯示，肝癌組和肝硬化組血漿瓜氨酸化組蛋白H3（citrullinated histone H3，H3Cit） -DNA、凝血酶-抗凝血酶（thrombin.-antithrombin，TAT）水平均顯著高于健康對照組（H3Cit-DNA：66.4 ng/mL、63.8 ng/mL、31.8 ng/mL，P<0.01；TAT：3.1 mg/mL、3.7 mg/mL、0.0 mg/mL，P<0.01），肝硬化組血漿髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO） -DNA明顯高于正常對照組和肝癌組，終末期肝病模型（model for end-stage liver dIsease，MELD）評分為≥14分的患者MPO-DNA和H3Cit-DNA水平顯著高于MELD評分<14分的患者。該結果提示肝硬化患者血漿中與NETs形成相關的標志物水平升高，并與肝功能損害程度相關。然而，與單純肝硬化患者相比，肝癌的存在并沒有使血漿MPO-DNA或H3Cit-DNA的水平進一步提高，雖然腫瘤直徑≥8 cm的肝癌患者的H3Cit-DNA水平升高，但不能作為多變量分析的獨立預測指標。此外，還有研究[32-33]表明，Tregs增多可增強非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）肝臟微環境的免疫抑制，NETs在TGF-β和IL-2的作用下誘導幼稚CD4+ T細胞向Tregs分化并通過代謝重新編程調節Tregs活性，從而促進NASH相關肝癌的發生，深入探究NETs和Tregs之間的相互作用，可以為預防NASH患者肝癌的發生提供一種潛在的策略。
NETs的發現為腫瘤學開辟了一全新的研究領域。越來越多的證據表明，NETs在肝癌發展的各階段均起著重要作用。深入研究肝癌與TANs間的相互作用有助于闡明肝癌免疫反應的基本機制，準確識別肝癌組織或循環中的NETs及其標志物，并制定新的治療干預措施以阻止腫瘤逃逸和轉移擴散。
3 中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutro- phils to lymphocytes ratio，NLR）在肝癌預后中的臨床意義
以炎癥為基礎的標志物與肝癌預后的關系是腫瘤預后標志物研究的一大熱點。NLR是評價全身炎癥變化的一種有效指標，反映了中性粒細胞相關的促腫瘤炎癥與淋巴細胞依賴性抗腫瘤免疫功能之間的潛在平衡。 多項研究已證實，NLR與接受肝移植、肝切除、經肝動脈化療栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）、射頻消融和分子靶向藥物治療的肝癌患者的預后密切相關，治療前高NLR 可作為一個預后不良的獨立預測指標[34-35]。NLR在晚期肝癌的免疫治療單藥及聯合治療中同樣具有預測價值。Hung等[36]回顧性分析了接受抗PD-1單克隆抗體（Nivolumab）單藥治療的晚期肝癌患者的臨床資料，結果顯示疾病進展（progressive disease，PD）組血清NLR明顯高于非PD組（4.4±2.3比2.9±1.3，P=0.028）；在治療前、開始治療后和治療14 d后，血清NLR的最優截斷值分別為2.52、4.08和2.72，高NLR組疾病無進展生存率（progressives free survival，PFS）均較低NLR組差。Eso等[37]對40例接受抗PD-1單抗聯合抗血管內皮生長因子抑制劑（Atezolizumab+Bevatizumab）治療的肝癌患者的治療過程進行分析，應用ROC曲線分析確定最優NLR截斷值為3.21，低NLR組客觀緩解率和疾病控制率分別為41.7%（10/24）和87.5%（21/24），高NLR組分別為13.3%（2/15）和33.3%（5/15）；低NLR組的 50、100、150和200 d的累積PFS分別為96.0%、80.0%、64.0%和44.0%，高NLR組分別為66.7%、26.7%、20.0%和0.0%，這表明與高NLR組相比，低NLR組應答率更高、PFS明顯提高。還有研究[38]報道了NLR對TACE+侖伐替尼+免疫檢查點抑制劑三聯轉化治療晚期不可切除肝癌療效的預測價值，結果顯示以2.960為最優截斷值，高NLR組的24和48周的累積PFS分別為83.2% ［95%CI 為（75.5%，90.2%）］ 和58.3% ［95%CI為（44.4%，72.4%）］，低NLR組的24周和48周PFS均為100%。
中性粒細胞在人類和小鼠中的壽命可從正常情況下的7 h延長到癌癥病例中的17 h[39]。與此相一致的證據表明，腫瘤和基質細胞產生的細胞因子，包括粒細胞集落刺激因子、IL-6、血管內皮生長因子-α和IL-1β，可引起中性粒細胞計數增多并誘導及增強這些中性粒細胞的免疫抑制特性[40-41]。 另外，中性粒細胞在腫瘤微環境中的計數也比在脾臟內多，表明腫瘤生態位有助于延長其在局部和循環中的生存時間[42]。更長的壽命可以給中性粒細胞更多的時間來合成和釋放更多的分子，并在腫瘤發展過程中有效地發揮作用。免疫抑制性淋巴細胞，如CD8+ T淋巴細胞、髓源性抑制細胞、Tregs等，在抑制腫瘤相關免疫方面起著重要作用，其高度浸潤與預后不良密切相關[43-44]。 但腫瘤浸潤淋巴細胞在間質、瘤周和瘤內不同位置的預后價值仍不清楚。總的來說，NLR升高可能反映腫瘤相關炎癥增加和機體抗腫瘤免疫功能下降的趨勢，也可能是由于造血干細胞向粒細胞系的分化傾斜以及中性粒細胞對T細胞增殖和溶細胞活性的抑制作用減弱所致。此外，肝癌患者NLR升高與高惡性腫瘤特征有關，如血管侵犯、多個腫瘤的存在和高甲胎蛋白水平，還易受到年齡、肥胖、體質量減輕、服用類固醇、飲酒、脂肪肝、營養不良、糖尿病等多種因素的影響[45-46]。目前NLR的最優截斷值尚無統一的標準，特別在免疫治療與其他治療的聯合方案中，大多數研究為單中心研究，樣本量小，未進行多因素分析，且隨訪時間短，NLR與總生存期之間的相關性未得到檢驗。
4 小結與展望
越來越多的研究表明，TANs和NETs在肝癌的發生發展中起著至關重要的作用。在腫瘤微環境中，中性粒細胞、肝癌細胞和其他成分之間的相互作用受到多種信號通路的調控，一些與TANs相關的參數已被用作肝癌患者臨床預后的有效預測性生物標志物。進一步在基礎與臨床研究中探索中性粒細胞在肝癌中的確切作用是非常必要的，這無疑將進一步加深我們對肝癌病理生理的認識，并尋求治療上的突破。隨著腫瘤相關免疫抑制性中性粒細胞的功能和靶向中性粒細胞新型治療的研究成果不斷積累，預計在未來10年中，更多的肝癌患者將從免疫治療和個性化靶向治療中受益。
重要聲明
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