引用本文： 何建春, 裴昌貞, 楊雷, 王丹, 陳虹佑. 某院普外科高MRSA檢出率及其分子流行病學調查. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(7): 897-903. doi: 10.7507/1007-9424.202109098 復制
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是一種革蘭陽性球菌，在血平板上易產生透明的β溶血環，其也是典型的導致社區及醫院獲得性感染的重要條件致病菌[1]。正常人對SA的攜帶率可達30%～50%，當患者免疫力低下時大量繁殖，引起呼吸道感染、皮膚組織感染、傷口感染、引流管相關感染、血液感染等多樣性感染[2-3]，導致患者住院時間延長、治療費用增加和預后不良[4]。自1959年在歐洲出現耐甲氧西林SA（methicillin-resistant SA，MRSA）以來，MRSA在世界范圍內開始流行，成為世界范圍內最難解決的感染性疾病之一[5]。由于MRSA具有多重耐藥性、毒性大、容易感染且死亡率高等特性，近10年來全球對MRSA進行了嚴格的監控，使得MRSA的檢出率在全球開始呈現出逐步降低的趨勢。在美國和一些西方國家的研究報告中發現， MRSA 的檢出率呈下降趨勢[6-7]。我國，胡付品等[8-9]在中國耐藥監測網（China Antimicrobial Surveillance Network，CHINET）公布的數據中顯示， MRSA 的檢出率由2005年的 69.0%逐年下降至2018年的34.0%，說明不管國際還是國內MRSA感染均有明顯下降的趨勢。然而在筆者所在醫院（以下簡稱我院）MRSA的流行趨勢恰好呈現出相反的趨勢，從2013年的26.0%逐步上升至2019年的48.2%，呈明顯上升趨勢，引發本研究團隊反思和研究。進一步研究發現，普外科為我院MRSA檢出最多的科室。因此，本研究主要以我院MRSA檢出最多的科室普外科患者為研究對象，從標本種類、藥敏情況、多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、耐藥基因、毒力基因、生物膜基因、MRSA感染危險因素和預后多方位多角度進行綜合性分析，旨在為MRSA感染的預防和控制提供理論依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
本研究以在我院普外科從2016年1月到2020年12月住院期間感染MRSA的患者為研究對象。5年間分離培養的非重復SA共119株。根據SA是否對苯唑西林耐藥分為2組，分別是對苯唑西林耐藥的菌株為MRSA組（n=69），對苯唑西林敏感的菌株則為甲氧西林敏感SA（methicillin-sensitive SA，MSSA）組（n=50）。本研究通過了大足區人民醫院倫理委員會的審批。
1.2 方法
1.2.1 細菌的鑒定及藥敏測定
依據《全國臨床檢驗操作規程》第4版[10]完成樣本的采集和細菌培養，所有細菌均通過梅里埃Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統（法國梅里埃公司）進行鑒定，并采用配套的藥敏卡測定SA對常規抗生素的最小抑菌濃度；最后依據美國臨床和實驗室標準協會制定的微生物臨床檢驗標準進行藥敏結果的判讀。質控菌株購自衛生部臨床檢驗中心，為SA ATCC29213。
1.2.2 提取DNA模板
使用DNA 試劑提取盒 ［天根生化科技（北京）有限公司］ 完成SA的DNA的提取，相關步驟參照其說明書的方法進行。具體為菌體裂解（收集菌懸液，加入緩沖液GA重懸細菌，并加入溶菌酶，混勻后37 ℃溫育60 min，再加入緩沖液GB和蛋白酶K，混勻后70 ℃溫育10 min，最后加入100%乙醇，混勻）；DNA與膜結合及純化，將上述裂解后菌液加入收集管中， 10 000 r/min 離心30 s、r=8 cm（離心速度、時間及半徑下同），然后重復2次加入緩沖液GD后離心，再加入滅菌蒸餾水，離心得到DNA； 最后將得到的DNA分裝，并保存于–20 ℃備檢。
1.2.3 檢測 MLST 并構建進化樹
MLST是將SA的7個管家基因（分別為arcC、aroE、glpF、Gmk、pta、tpi和yqiL基因）進行PCR擴增，基因引物參照相關文獻[11]，反應條件為預變性 94 ℃ 5 min，30次循環（變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 90 s，延伸72 ℃ 90 s），72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。并將PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司雙向測序拼接。所得測序結果在MLST官方網站（
1.2.4 耐藥、毒力和生物膜基因的PCR檢測
將1.2.2項提取的DNA用于PCR擴增，擴增的基因分別為耐藥基因 ［包括β-內酰胺類耐藥基因mecA、mecC，氨基糖苷類修飾酶基因Aac（6′ ）/Aph（2′ ′ ）、Aph（3） -Ⅲ、ant（4′）- Ⅰ a，四環素類耐藥基因tetM和喹諾酮類qnrA］、毒力基因 ［包括殺白細胞素（panton-valentine leukocidin，PVL）基因、纖維蛋白結合蛋白A（fibronectin- binding protein A，FnbA）基因、葡萄球菌腸毒素A （staphylococcal enterotoxin A，SEA）基因、葡萄球菌腸毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）基因和α-溶血素（α-hemolysins，Hla）基因］ 以及生物膜基因 ［包括細胞內黏附素A（intracellular adhesion A，ICAA）基因、葡萄球菌輔助調節因子A（staphylococcal accessory regulators A，SarA）基因和纖維蛋白結合蛋白B（fibronectin-binding protein B，FnbB）基因］；基因擴增引物參照相關文獻[10]，反應條件為預變性（94 ℃ 5 min），35次循環（變性94 ℃ 60 s，退火 30 s，延伸72 ℃ 60 s），72 ℃延伸10 min，最后將PCR產物進行電泳和凝膠成像觀察。
1.2.5 MRSA 感染相關危險因素分析
MRSA 感染危險因素分析采用病例對照方式進行，查詢我院電子病歷系統和檢驗科LIS系統收集MRSA 感染相關危險因素，包括患者年齡、性別、吸煙、飲酒、是否轉院、慢性基礎疾病、低蛋白血癥、創面感染、導管相關感染、尿路感染、肺部感染、腹腔感染、感染前手術史、呼吸機輔助通氣、導尿管、引流管、抗菌藥物使用史和患者住院時間。
1.3 統計學方法
所有數據分析均使用SPSS 22.0軟件進行。 計量資料采用單樣本K-S檢驗驗證其是否符合正態分布，符合正態分布者用均數±標準差（
±s）表示，采用兩獨立樣本t檢驗進行組間比較；計數資料采用率表示，使用成組χ2檢驗；多因素分析采用logistic回歸模型（逐步前進法）進行并計算OR值、95%CI和P值。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MRSA檢出率及標本類別分布情況
2016年1月至2020年12月共5年，納入患者824例，共檢出762株非重復SA，其中檢出最多的前3個科室依次為：普外科119株（15.62%，119/762），耳鼻喉科98株（12.86%，98/762）和兒科85株（11.15%，85/762）。在普外科檢出的119株SA中MRSA 69株，MRSA檢出率為57.98%，其中2016–2020年期間每年MRSA檢出數和檢出率見圖1。從送檢的119份標本類別看，96份膿液中檢出MRSA 58株（48.7%，58/119），11份傷口分泌物中檢出MRSA 5株（4.2%，5/119），7份痰液中檢出MRSA 4株（3.4%，4/119），3份引流液中檢出MRSA 1株（0.8%，1/119），2份血液中檢出MRSA 1株（0.8%，1/119）。
圖1
示2016–2020年我院普外科MRSA檢出數和檢出率
2.2 MRSA藥敏結果分析
SA藥敏結果顯示，普外科分離的SA對各類抗生素的耐藥情況各異，對青霉素、苯唑西林、頭孢西丁和紅霉素的耐藥率均在75%以上，未發現對奎奴普丁/達福普汀、替考拉寧、利奈唑胺和萬古霉素耐藥的SA。進一步將MRSA組和MSSA組對比分析發現，2組間青霉素和紅霉素的耐藥率差異有統計學意義（P<0.05），其余抗生素的耐藥率2組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
表1
2016–2020年5年間MRSA對常見抗生素的耐藥情況
2.3 MLST結果分析
MLST結果顯示：69株MRSA共檢出10個ST型別，具體見表2。從表2可見，構成比在10%以上的ST型別有3個，分別是ST88、ST951和ST59，此3個ST型別占全部菌株的84.06%（58/69），未發現新的ST型別。進一步將ST型別構建遺傳進化樹，可以看出所有MRSA未出現明顯聚類現象，見圖2。
表2
MRSA等位基因編碼和序列型
圖2
示MRSA的ST型別進化樹
不同顏色的圓圈表示不同標本種類，黃色代表膿液，紅色代表痰液，藍色代表傷口分泌物，綠色代表血液，紫色代表引流液
2.4 MRSA耐藥基因、毒力基因和生物膜基因檢測結果
MRSA耐藥基因、毒力基因和生物膜基因檢測結果見表3。由表3可見：耐藥基因中所有菌株均攜帶mecA基因，其次為Aph（3）-Ⅲ基因；毒力基因檢出最多的為FnbA基因，其次為Hla基因；生物膜基因檢出最多的為SarA基因，其次為ICAA基因。
表3
MRSA耐藥基因、毒力基因和生物膜相關基因的檢測結果［株（%） ］
2.5 MRSA感染的單因素分析結果
將MRSA感染的相關危險因素先進行單因素分析（采用成組χ2檢驗），結果見表4。從表4中可見，與MSSA組相比，MRSA組患者在轉院、創面感染、引流管和頭孢菌素類使用史方面的差異有統計學意義（P<0.05），MRSA組患者的住院時間長于MSSA組（P<0.05），其余危險因素2組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
表4
MRSA感染的單因素分析結果
2.6 MRSA感染的多因素分析結果
進一步將上述單因素分析中P<0.10變量及臨床認為有關系的變量納入多因素分析，其結果（表5）顯示，轉院、創面感染、導管相關感染、引流管和頭孢菌素類使用史是MRSA感染的獨立危險因素。
表5
MRSA感染的多因素logistic回歸分析結果
3 討論
MRSA廣泛存在于人體呼吸道、消化道、皮膚黏膜等部位，常引起肺部、軟組織等部位感染，也是引起社區和醫院獲得性感染的重要致病菌[13-14]。自第1例MRSA檢出后[5]，其感染遍及全球，引起世界各國高度關注，已成為常規監控菌，一經發現，需將患者進行隔離。相關研究[15]顯示，SA在急診科和兒科感染較多見。本研究發現，我院普外科MRSA檢出率在所有科室中最高，達57.98%，高于2019年中國CHINET對1 400多家醫院監測結果的平均檢出率31.4%[9]。故需引起重點關注和研究。
首先，從藥敏結果來看，與MSSA組相比，MRSA組對青霉素（100% 比82.00%）、苯唑西林（100%比 0.00%）和頭孢西丁（100% 比 0.00%）的耐藥率更高，其原因可能是MRSA常常攜帶mecA基因，而該基因編碼的青霉素結合蛋白2a（penicillin binding protein 2a，PBP2a）與β-內酰胺類的親和力低，引起PBP2a催化細菌合成細胞壁，從而使得MRSA對β-內酰胺類抗生素耐藥[16]。這也與MRSA耐藥基因mecA檢出率為100%相一致。進一步研究發現，2組均未發現對奎奴普丁/達福普汀、替考拉寧、利奈唑胺和萬古霉素耐藥的SA。故對于MRSA感染，可采用萬古霉素或利奈唑胺甚至聯合用藥的治療方式。目前，臨床上常使用萬古霉素通過時間依賴性殺菌的方式治療嚴重 MRSA 感染，但該抗生素存在耳毒性和腎毒性不良反應，故需要嚴格控制血藥濃度。在國外已有報道耐萬古霉素的SA存在。而利奈唑胺在臨床治療MRSA感染效果顯著，是由于其不與其他抗生素發生交叉耐藥[17]，臨床可考慮聯合用藥治療MRSA感染，以防止更高一級抗生素耐藥菌的出現。
其次，從遺傳特性來看，有研究[11, 16]表明，MRSA流行一般是由少數流行菌株導致的，這些流行菌株可造成一定范圍的爆發流行。而及時掌控這些流行菌株的分子特征對于鑒別菌株間的親緣性具有重要的防控作用。脈沖場凝膠電泳分型可較準確判定某地的流行菌株的同源性，但其耗時長，操作復雜，且不適合多地區對比研究。而MLST通過世界公認的檢測其7個管家基因來進行國際間宏觀對比研究。本研究中69株MRSA共顯示10個ST型別，最多的3個型別分別為ST88占37.68%、ST951占27.54%和ST59占18.84%，與亞洲國家多流行ST88和ST59相一致[18]，而美國以ST1和ST8多見，歐洲國家以ST80多見[19-20]。
再次，MRSA的多重藥耐特性和高致病特性與其攜帶的基因緊密相關[11,16]。從耐藥基因攜帶情況來看，mecA攜帶率為100%，而mecC攜帶率為0.00%，說明我院普外科MRSA流行菌株對β-內酰胺類抗生素的耐藥為mecA基因引起，與上述藥敏結果相一致。MRSA菌對Aac（6′ ）/Aph（2′ ′ ）、Aph（3） -Ⅲ和ant（4′ ）- Ⅰ a與氨基糖苷類相關耐藥基因的攜帶率分別為27.54%、34.78%和18.84%；主要通過產生氨基糖苷乙酰轉移酶、氨基糖苷磷酸轉移酶或氨基糖苷核苷轉移酶對氨基糖苷類抗生素的氨基或羥基進行修飾，使得這類抗生素與MRSA的核糖體的親和力降低，從而無法起到抑菌作用[21]。進一步分析發現，對氨基糖苷類耐藥基因的攜帶率高于對慶大霉素的耐藥率（11.59%），產生這種現象的原因可能系細菌的異質性耐藥所致，部分細菌雖攜帶耐藥基因但體外實驗未表現耐藥，這可能只是細菌耐藥進化的一個階段，如果在體內抗生素連續壓力作用下，這些菌株最終會進化為耐藥菌株。從毒力基因來看，在檢測的5種毒力基因中， FnbA、Hla和SEB檢出率較高，分別為98.55%、94.20%和91.30%。FnbA基因編碼的黏附因子FnbA，能加強細菌間的黏附聚集作用，不僅能在MRSA侵襲宿主過程中發揮重要作用，還能封閉細菌識別機體的一些免疫系統位點[22]。Hla是一種重要的外毒素，能破壞紅細胞和溶酶體，收縮血管平滑肌，使血管阻滯，血流不暢，造成局部組織缺血壞死[23]。從生物膜基因來看，SarA和ICAA的攜帶率為97.10%和92.75%，均在90%以上。ICAA是胞間黏附基因操縱子4個功能基因中最常見的一個，其與多糖胞間黏附素（最主要的生物膜基質）緊密相關，在生物膜形成過程中扮演最重要的角色。而葡萄球菌輔助調節子SarA是一種重要的調控因子，可以通過對核酸酶和蛋白酶的活性進行抑制，促進MRSA的黏附而形成生物膜[24]。
本研究通過對MRSA感染的危險因素分析，其結果顯示，轉院是MRSA感染的獨立危險因素，說明在轉入我院前，部分患者已經在其他醫院感染了MRSA，從而引起我院普外科的高MRSA檢出率。故應加強轉院患者的監控，及時隔離并進行治療，減少該菌傳播。創面感染也是MRSA感染的獨立危險因素，與先前研究結果[25]相似，MRSA在醫院的各個環境中大量定植，患者在住院過程中特別是普外科的患者，因創面的存在，大大增加了感染MRSA的概率，加上臨床工作者需對患者創面進行反復護理，也增加了感染概率[26]。故普外科應加強院感監測，臨床工作者注意手衛生，勤洗手，保持無菌操作，定期進行環境衛生消毒，防止發生交叉感染，從而減少患者創面感染。另外，引流管也是MRSA感染的獨立危險因素，引流管是外科常見的侵入性操作，長期的引流使得細菌積聚，增加內源性感染，加上該菌極易形成生物膜而定居在管壁[27]，使得患者容易發生MRSA感染。最后，頭孢菌素類使用史是MRSA感染的獨立危險因素。患者在手術前一般需要預防性用藥，在抗生素的選擇壓力下，MRSA容易出現。此外，預防性用藥使得大部分其他菌被抑制，剩下MRSA成為優勢菌，更加促進該菌的大量繁殖。且MRSA感染的患者住院時間更長，增加了患者負擔。
綜上，我院普外科MRSA檢出率高，ST型別以ST88最為常見，耐藥、毒力和生物膜相關基因攜帶率高，轉院、創面感染、引流管、頭孢菌素類使用史等是MRSA感染的高危因素。臨床應減少侵入性操作，合理使用抗生素，注意手衛生，定期進行環境衛生消毒，加強MRSA監測，從而減少和控制MRSA的感染和傳播。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：何建春負責數據分析和撰寫論文；裴昌貞負責統計臨床資料；楊雷和王丹負責PCR擴增實驗；陳虹佑負責指導論文撰寫和提出研究思路。
倫理聲明：本研究已通過重慶市大足區人民醫院倫理委員會的審核批準。
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是一種革蘭陽性球菌，在血平板上易產生透明的β溶血環，其也是典型的導致社區及醫院獲得性感染的重要條件致病菌[1]。正常人對SA的攜帶率可達30%～50%，當患者免疫力低下時大量繁殖，引起呼吸道感染、皮膚組織感染、傷口感染、引流管相關感染、血液感染等多樣性感染[2-3]，導致患者住院時間延長、治療費用增加和預后不良[4]。自1959年在歐洲出現耐甲氧西林SA（methicillin-resistant SA，MRSA）以來，MRSA在世界范圍內開始流行，成為世界范圍內最難解決的感染性疾病之一[5]。由于MRSA具有多重耐藥性、毒性大、容易感染且死亡率高等特性，近10年來全球對MRSA進行了嚴格的監控，使得MRSA的檢出率在全球開始呈現出逐步降低的趨勢。在美國和一些西方國家的研究報告中發現， MRSA 的檢出率呈下降趨勢[6-7]。我國，胡付品等[8-9]在中國耐藥監測網（China Antimicrobial Surveillance Network，CHINET）公布的數據中顯示， MRSA 的檢出率由2005年的 69.0%逐年下降至2018年的34.0%，說明不管國際還是國內MRSA感染均有明顯下降的趨勢。然而在筆者所在醫院（以下簡稱我院）MRSA的流行趨勢恰好呈現出相反的趨勢，從2013年的26.0%逐步上升至2019年的48.2%，呈明顯上升趨勢，引發本研究團隊反思和研究。進一步研究發現，普外科為我院MRSA檢出最多的科室。因此，本研究主要以我院MRSA檢出最多的科室普外科患者為研究對象，從標本種類、藥敏情況、多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、耐藥基因、毒力基因、生物膜基因、MRSA感染危險因素和預后多方位多角度進行綜合性分析，旨在為MRSA感染的預防和控制提供理論依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
本研究以在我院普外科從2016年1月到2020年12月住院期間感染MRSA的患者為研究對象。5年間分離培養的非重復SA共119株。根據SA是否對苯唑西林耐藥分為2組，分別是對苯唑西林耐藥的菌株為MRSA組（n=69），對苯唑西林敏感的菌株則為甲氧西林敏感SA（methicillin-sensitive SA，MSSA）組（n=50）。本研究通過了大足區人民醫院倫理委員會的審批。
1.2 方法
1.2.1 細菌的鑒定及藥敏測定
依據《全國臨床檢驗操作規程》第4版[10]完成樣本的采集和細菌培養，所有細菌均通過梅里埃Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統（法國梅里埃公司）進行鑒定，并采用配套的藥敏卡測定SA對常規抗生素的最小抑菌濃度；最后依據美國臨床和實驗室標準協會制定的微生物臨床檢驗標準進行藥敏結果的判讀。質控菌株購自衛生部臨床檢驗中心，為SA ATCC29213。
1.2.2 提取DNA模板
使用DNA 試劑提取盒 ［天根生化科技（北京）有限公司］ 完成SA的DNA的提取，相關步驟參照其說明書的方法進行。具體為菌體裂解（收集菌懸液，加入緩沖液GA重懸細菌，并加入溶菌酶，混勻后37 ℃溫育60 min，再加入緩沖液GB和蛋白酶K，混勻后70 ℃溫育10 min，最后加入100%乙醇，混勻）；DNA與膜結合及純化，將上述裂解后菌液加入收集管中， 10 000 r/min 離心30 s、r=8 cm（離心速度、時間及半徑下同），然后重復2次加入緩沖液GD后離心，再加入滅菌蒸餾水，離心得到DNA； 最后將得到的DNA分裝，并保存于–20 ℃備檢。
1.2.3 檢測 MLST 并構建進化樹
MLST是將SA的7個管家基因（分別為arcC、aroE、glpF、Gmk、pta、tpi和yqiL基因）進行PCR擴增，基因引物參照相關文獻[11]，反應條件為預變性 94 ℃ 5 min，30次循環（變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 90 s，延伸72 ℃ 90 s），72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。并將PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司雙向測序拼接。所得測序結果在MLST官方網站（
1.2.4 耐藥、毒力和生物膜基因的PCR檢測
將1.2.2項提取的DNA用于PCR擴增，擴增的基因分別為耐藥基因 ［包括β-內酰胺類耐藥基因mecA、mecC，氨基糖苷類修飾酶基因Aac（6′ ）/Aph（2′ ′ ）、Aph（3） -Ⅲ、ant（4′）- Ⅰ a，四環素類耐藥基因tetM和喹諾酮類qnrA］、毒力基因 ［包括殺白細胞素（panton-valentine leukocidin，PVL）基因、纖維蛋白結合蛋白A（fibronectin- binding protein A，FnbA）基因、葡萄球菌腸毒素A （staphylococcal enterotoxin A，SEA）基因、葡萄球菌腸毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）基因和α-溶血素（α-hemolysins，Hla）基因］ 以及生物膜基因 ［包括細胞內黏附素A（intracellular adhesion A，ICAA）基因、葡萄球菌輔助調節因子A（staphylococcal accessory regulators A，SarA）基因和纖維蛋白結合蛋白B（fibronectin-binding protein B，FnbB）基因］；基因擴增引物參照相關文獻[10]，反應條件為預變性（94 ℃ 5 min），35次循環（變性94 ℃ 60 s，退火 30 s，延伸72 ℃ 60 s），72 ℃延伸10 min，最后將PCR產物進行電泳和凝膠成像觀察。
1.2.5 MRSA 感染相關危險因素分析
MRSA 感染危險因素分析采用病例對照方式進行，查詢我院電子病歷系統和檢驗科LIS系統收集MRSA 感染相關危險因素，包括患者年齡、性別、吸煙、飲酒、是否轉院、慢性基礎疾病、低蛋白血癥、創面感染、導管相關感染、尿路感染、肺部感染、腹腔感染、感染前手術史、呼吸機輔助通氣、導尿管、引流管、抗菌藥物使用史和患者住院時間。
1.3 統計學方法
所有數據分析均使用SPSS 22.0軟件進行。 計量資料采用單樣本K-S檢驗驗證其是否符合正態分布，符合正態分布者用均數±標準差（±s）表示，采用兩獨立樣本t檢驗進行組間比較；計數資料采用率表示，使用成組χ2檢驗；多因素分析采用logistic回歸模型（逐步前進法）進行并計算OR值、95%CI和P值。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MRSA檢出率及標本類別分布情況
2016年1月至2020年12月共5年，納入患者824例，共檢出762株非重復SA，其中檢出最多的前3個科室依次為：普外科119株（15.62%，119/762），耳鼻喉科98株（12.86%，98/762）和兒科85株（11.15%，85/762）。在普外科檢出的119株SA中MRSA 69株，MRSA檢出率為57.98%，其中2016–2020年期間每年MRSA檢出數和檢出率見圖1。從送檢的119份標本類別看，96份膿液中檢出MRSA 58株（48.7%，58/119），11份傷口分泌物中檢出MRSA 5株（4.2%，5/119），7份痰液中檢出MRSA 4株（3.4%，4/119），3份引流液中檢出MRSA 1株（0.8%，1/119），2份血液中檢出MRSA 1株（0.8%，1/119）。
圖1
示2016–2020年我院普外科MRSA檢出數和檢出率
2.2 MRSA藥敏結果分析
SA藥敏結果顯示，普外科分離的SA對各類抗生素的耐藥情況各異，對青霉素、苯唑西林、頭孢西丁和紅霉素的耐藥率均在75%以上，未發現對奎奴普丁/達福普汀、替考拉寧、利奈唑胺和萬古霉素耐藥的SA。進一步將MRSA組和MSSA組對比分析發現，2組間青霉素和紅霉素的耐藥率差異有統計學意義（P<0.05），其余抗生素的耐藥率2組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
表1
2016–2020年5年間MRSA對常見抗生素的耐藥情況
2.3 MLST結果分析
MLST結果顯示：69株MRSA共檢出10個ST型別，具體見表2。從表2可見，構成比在10%以上的ST型別有3個，分別是ST88、ST951和ST59，此3個ST型別占全部菌株的84.06%（58/69），未發現新的ST型別。進一步將ST型別構建遺傳進化樹，可以看出所有MRSA未出現明顯聚類現象，見圖2。
表2
MRSA等位基因編碼和序列型
圖2
示MRSA的ST型別進化樹
不同顏色的圓圈表示不同標本種類，黃色代表膿液，紅色代表痰液，藍色代表傷口分泌物，綠色代表血液，紫色代表引流液
2.4 MRSA耐藥基因、毒力基因和生物膜基因檢測結果
MRSA耐藥基因、毒力基因和生物膜基因檢測結果見表3。由表3可見：耐藥基因中所有菌株均攜帶mecA基因，其次為Aph（3）-Ⅲ基因；毒力基因檢出最多的為FnbA基因，其次為Hla基因；生物膜基因檢出最多的為SarA基因，其次為ICAA基因。
表3
MRSA耐藥基因、毒力基因和生物膜相關基因的檢測結果［株（%） ］
2.5 MRSA感染的單因素分析結果
將MRSA感染的相關危險因素先進行單因素分析（采用成組χ2檢驗），結果見表4。從表4中可見，與MSSA組相比，MRSA組患者在轉院、創面感染、引流管和頭孢菌素類使用史方面的差異有統計學意義（P<0.05），MRSA組患者的住院時間長于MSSA組（P<0.05），其余危險因素2組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
表4
MRSA感染的單因素分析結果
2.6 MRSA感染的多因素分析結果
進一步將上述單因素分析中P<0.10變量及臨床認為有關系的變量納入多因素分析，其結果（表5）顯示，轉院、創面感染、導管相關感染、引流管和頭孢菌素類使用史是MRSA感染的獨立危險因素。
表5
MRSA感染的多因素logistic回歸分析結果
3 討論
MRSA廣泛存在于人體呼吸道、消化道、皮膚黏膜等部位，常引起肺部、軟組織等部位感染，也是引起社區和醫院獲得性感染的重要致病菌[13-14]。自第1例MRSA檢出后[5]，其感染遍及全球，引起世界各國高度關注，已成為常規監控菌，一經發現，需將患者進行隔離。相關研究[15]顯示，SA在急診科和兒科感染較多見。本研究發現，我院普外科MRSA檢出率在所有科室中最高，達57.98%，高于2019年中國CHINET對1 400多家醫院監測結果的平均檢出率31.4%[9]。故需引起重點關注和研究。
首先，從藥敏結果來看，與MSSA組相比，MRSA組對青霉素（100% 比82.00%）、苯唑西林（100%比 0.00%）和頭孢西丁（100% 比 0.00%）的耐藥率更高，其原因可能是MRSA常常攜帶mecA基因，而該基因編碼的青霉素結合蛋白2a（penicillin binding protein 2a，PBP2a）與β-內酰胺類的親和力低，引起PBP2a催化細菌合成細胞壁，從而使得MRSA對β-內酰胺類抗生素耐藥[16]。這也與MRSA耐藥基因mecA檢出率為100%相一致。進一步研究發現，2組均未發現對奎奴普丁/達福普汀、替考拉寧、利奈唑胺和萬古霉素耐藥的SA。故對于MRSA感染，可采用萬古霉素或利奈唑胺甚至聯合用藥的治療方式。目前，臨床上常使用萬古霉素通過時間依賴性殺菌的方式治療嚴重 MRSA 感染，但該抗生素存在耳毒性和腎毒性不良反應，故需要嚴格控制血藥濃度。在國外已有報道耐萬古霉素的SA存在。而利奈唑胺在臨床治療MRSA感染效果顯著，是由于其不與其他抗生素發生交叉耐藥[17]，臨床可考慮聯合用藥治療MRSA感染，以防止更高一級抗生素耐藥菌的出現。
其次，從遺傳特性來看，有研究[11, 16]表明，MRSA流行一般是由少數流行菌株導致的，這些流行菌株可造成一定范圍的爆發流行。而及時掌控這些流行菌株的分子特征對于鑒別菌株間的親緣性具有重要的防控作用。脈沖場凝膠電泳分型可較準確判定某地的流行菌株的同源性，但其耗時長，操作復雜，且不適合多地區對比研究。而MLST通過世界公認的檢測其7個管家基因來進行國際間宏觀對比研究。本研究中69株MRSA共顯示10個ST型別，最多的3個型別分別為ST88占37.68%、ST951占27.54%和ST59占18.84%，與亞洲國家多流行ST88和ST59相一致[18]，而美國以ST1和ST8多見，歐洲國家以ST80多見[19-20]。
再次，MRSA的多重藥耐特性和高致病特性與其攜帶的基因緊密相關[11,16]。從耐藥基因攜帶情況來看，mecA攜帶率為100%，而mecC攜帶率為0.00%，說明我院普外科MRSA流行菌株對β-內酰胺類抗生素的耐藥為mecA基因引起，與上述藥敏結果相一致。MRSA菌對Aac（6′ ）/Aph（2′ ′ ）、Aph（3） -Ⅲ和ant（4′ ）- Ⅰ a與氨基糖苷類相關耐藥基因的攜帶率分別為27.54%、34.78%和18.84%；主要通過產生氨基糖苷乙酰轉移酶、氨基糖苷磷酸轉移酶或氨基糖苷核苷轉移酶對氨基糖苷類抗生素的氨基或羥基進行修飾，使得這類抗生素與MRSA的核糖體的親和力降低，從而無法起到抑菌作用[21]。進一步分析發現，對氨基糖苷類耐藥基因的攜帶率高于對慶大霉素的耐藥率（11.59%），產生這種現象的原因可能系細菌的異質性耐藥所致，部分細菌雖攜帶耐藥基因但體外實驗未表現耐藥，這可能只是細菌耐藥進化的一個階段，如果在體內抗生素連續壓力作用下，這些菌株最終會進化為耐藥菌株。從毒力基因來看，在檢測的5種毒力基因中， FnbA、Hla和SEB檢出率較高，分別為98.55%、94.20%和91.30%。FnbA基因編碼的黏附因子FnbA，能加強細菌間的黏附聚集作用，不僅能在MRSA侵襲宿主過程中發揮重要作用，還能封閉細菌識別機體的一些免疫系統位點[22]。Hla是一種重要的外毒素，能破壞紅細胞和溶酶體，收縮血管平滑肌，使血管阻滯，血流不暢，造成局部組織缺血壞死[23]。從生物膜基因來看，SarA和ICAA的攜帶率為97.10%和92.75%，均在90%以上。ICAA是胞間黏附基因操縱子4個功能基因中最常見的一個，其與多糖胞間黏附素（最主要的生物膜基質）緊密相關，在生物膜形成過程中扮演最重要的角色。而葡萄球菌輔助調節子SarA是一種重要的調控因子，可以通過對核酸酶和蛋白酶的活性進行抑制，促進MRSA的黏附而形成生物膜[24]。
本研究通過對MRSA感染的危險因素分析，其結果顯示，轉院是MRSA感染的獨立危險因素，說明在轉入我院前，部分患者已經在其他醫院感染了MRSA，從而引起我院普外科的高MRSA檢出率。故應加強轉院患者的監控，及時隔離并進行治療，減少該菌傳播。創面感染也是MRSA感染的獨立危險因素，與先前研究結果[25]相似，MRSA在醫院的各個環境中大量定植，患者在住院過程中特別是普外科的患者，因創面的存在，大大增加了感染MRSA的概率，加上臨床工作者需對患者創面進行反復護理，也增加了感染概率[26]。故普外科應加強院感監測，臨床工作者注意手衛生，勤洗手，保持無菌操作，定期進行環境衛生消毒，防止發生交叉感染，從而減少患者創面感染。另外，引流管也是MRSA感染的獨立危險因素，引流管是外科常見的侵入性操作，長期的引流使得細菌積聚，增加內源性感染，加上該菌極易形成生物膜而定居在管壁[27]，使得患者容易發生MRSA感染。最后，頭孢菌素類使用史是MRSA感染的獨立危險因素。患者在手術前一般需要預防性用藥，在抗生素的選擇壓力下，MRSA容易出現。此外，預防性用藥使得大部分其他菌被抑制，剩下MRSA成為優勢菌，更加促進該菌的大量繁殖。且MRSA感染的患者住院時間更長，增加了患者負擔。
綜上，我院普外科MRSA檢出率高，ST型別以ST88最為常見，耐藥、毒力和生物膜相關基因攜帶率高，轉院、創面感染、引流管、頭孢菌素類使用史等是MRSA感染的高危因素。臨床應減少侵入性操作，合理使用抗生素，注意手衛生，定期進行環境衛生消毒，加強MRSA監測，從而減少和控制MRSA的感染和傳播。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：何建春負責數據分析和撰寫論文；裴昌貞負責統計臨床資料；楊雷和王丹負責PCR擴增實驗；陳虹佑負責指導論文撰寫和提出研究思路。
倫理聲明：本研究已通過重慶市大足區人民醫院倫理委員會的審核批準。
