引用本文： 賀賽, 田艷超, 耿潔, 高紅變, 陳楠, 侯艷妮, 范擁國, 楊曉民. CNTN1基因在乳腺癌中的表達及其與預后關系的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(6): 726-730. doi: 10.7507/1007-9424.202108116 復制
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，也是全球第二大惡性腫瘤相關死亡原因[1]。乳腺癌的發病率和病死率呈逐年上升趨勢，但其發生、發展的具體分子生物學機制尚不清楚[2]。雖然以手術為主的綜合治療大大提高了乳腺癌患者的遠期生存率[3]，但由于目前乳腺癌早診率仍較低，治療副作用往往難以耐受且治療費用高昂，乳腺癌的總體治療效果并不理想[4]。接觸蛋白-1（contactin-1，CNTN1）基因是免疫球蛋白超家族的一員[5-6]，有研究[7]表明CNTN1在肺癌、口腔癌、肝癌等腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移中扮演重要的角色，然而其在乳腺癌中的表達情況卻鮮有報道。為探討CNTN1基因在乳腺癌中的功能及其對于乳腺癌患者臨床預后的影響，本研究應用免疫組織化學、蛋白印跡（Western blot）及逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcriptase-PCR，RT-PCR）方法從蛋白水平及mRNA水平檢測CNTN1基因在乳腺癌組織及其癌旁組織中的表達情況，以探討CNTN1與乳腺癌患者臨床病理因素以及臨床預后之間的關系，為乳腺癌的診療提供理論依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
納入標準：① 臨床分期符合美國癌癥聯合會乳腺癌TNM分期（第7版）標準；② 入院前未進行過手術、放射治療、化學治療等治療；③ 為首發病；④ 臨床病理資料及隨訪資料齊全。排除標準：① 3個月內使用過激素類藥物治療；② 伴有其他惡性腫瘤；③ 伴有其他嚴重臟器病變或已參加其他臨床試驗者。根據納入和排除標準，收集2015年1月至2015年6月期間陜西省腫瘤醫院收治且行乳腺癌手術后的35例乳腺癌組織標本及其相應的癌旁組織（距癌組織5 cm以上），均為女性。年齡27~75歲，中位年齡49歲。每例標本均經切片后行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色鏡檢再次復查認定。標本離體后立即切塊分為2份，一份立即浸入10%中性甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋、切片，用于HE染色作病理組織學檢測和免疫組織化學染色；另一份立即放入無菌無酶的EP管中存于液氮罐中待用。
1.2 方法
1.2.1 主要試劑
兔抗人CNTN1單克隆抗體及β-actin單克隆抗體購自美國Epitomics公司，山羊抗兔二抗、免疫組織化學鏈酶菌抗生素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）試劑盒及二氨基聯苯胺顯色試劑盒均購自中國北京中杉金橋生物技術有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒和細胞蛋白放射免疫沉淀分析（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液購自中國大連Takara公司。
1.2.2 SP法檢測組織中CNTN1蛋白表達
將切片常規二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗5 min×2次，微波修復，3% H2O2孵育15 min；滴加山羊血清室溫孵育30 min。CNTN1抗體（1∶2 000）50 μL 4 ℃孵育過夜，滴加50 μL二抗孵育1 h，DAB顯色液顯色，自來水沖洗，HE復染，PBS返藍，脫水、透明、封片。以PBS作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。結果判讀：CNTN1蛋白陽性表達在細胞漿，呈棕黃色顆粒狀，在細胞靶部位著色或均勻著色者判定為陽性細胞。隨機選取5個不同高倍鏡視野觀察，根據陽性細胞染色強度及陽性細胞占百分比計分：無陽性細胞 0分，陽性細胞占比≤25% 1分，25%～75% 2分，>75% 3分；染色強度（與背景著色對比）：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩者乘積即為染色得分：0～2分為“（–）”，3～4分為“（+）”，5～7分為“（++）”，8～9分為“（+++）”。總分<3分為陰性，≥3分為陽性。由兩名有經驗的病理科醫師獨立判斷。
1.2.3 Western blot法檢測組織中CNTN1蛋白表達
于液氮中取出凍存組織，加入RIPA裂解液，于冰上裂解10 min，然后4 ℃、13 000×g離心10 min。取上清，以標準BCA法測定蛋白濃度，與5×十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，SDS）凝膠緩沖液混合，100 ℃下5 min蛋白變性，10% SDS-聚丙烯酰凝膠電泳，轉聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜 20 V 40 min，室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1h，洗滌PVDF膜3次，加CNTN1一抗（1∶2 000）、β-actin一抗（1∶2 000），4 ℃過夜；二抗（1∶3 000）室溫1 h，ECL顯影，凝膠成像系統掃描。Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。
1.2.4 RT-PCR法檢測組織中CNTN1 mRNA表達
提取凍存組織30 mg，用Trizol按說明書要求提取目標組織RNA，并逆轉錄為cDNA。以β-actin為內參照，根據Genbank中CNTN1基因片段序列設計如下引物并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，用PCR方法擴增CNTN1。CNTN1上游引物為5′-TGTTCAGCAAATTCATCCCA-3′，下游引物為5′-TCTACCCACTCAGGGAATGC-3′，擴增片段長度1 029 bp；β-actin上游引物為5′-AATCTGGCACCACACCTTCTA-3′，下游引物為5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCA-3′，擴增片段長度370 bp。反應條件均為25 μL的反應體系，程序設置如下： 95 °C 3 min，95 °C 20 s，56 °C 20 s，共40循環，72 °C 20 s，95 °C 15 s，60 °C 15 s，60～95 °C 20 min，95 °C 15 s。瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。采用2–ΔΔCT表示CNTN1 mRNA 相對表達水平。
1.3 隨訪方法
采用電話或門診的方式進行隨訪，隨訪時間截至2020年12月31日。納入本研究患者均獲得隨訪，無失訪病例。主要研究終點指標為總生存時間，其定義為首次診斷為乳腺癌至患者死亡或末次隨訪的時間。
1.4 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，采用GraphPad Prism7.0軟件進行生存曲線制作。符合正態分布的計量數據用均數±標準差（
±s）表示且2組間比較采用t檢驗，計數資料采用連續性校正的χ2檢驗，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并行log-rank檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SP法檢測CNTN1蛋白在乳腺癌及其相應癌旁組織中的表達結果以及其與患者臨床病理特征的關系
CNTN1呈棕黃色顆粒主要表達于細胞漿，乳腺癌組織中多呈陽性反應，著色較深且呈彌漫性分布（圖1a~1d）；癌旁組織著色較淺，部分呈局灶性（圖1e~1h）。CNTN1蛋白表達陽性率在癌組織中為65.7%（23/35），其在相應的癌旁組織中為45.7%（16/35），前者高于后者（χ2=8.235，P=0.003）。CNTN1蛋白在乳腺癌組織中的蛋白表達陽性率與患者年齡無關（P>0.05），但其在腫瘤直徑較大（>2 cm）、低分化、TNM分期較高（Ⅲ+Ⅳ期）以及有腋窩淋巴結轉移乳腺癌患者的癌組織中均高于腫瘤直徑較小（≤2 cm）、高/中分化、TNM分期較低（ Ⅰ+Ⅱ期）以及無腋窩淋巴結轉移乳腺癌患者（P<0.05），見表1。
圖1
示CNTN1蛋白在乳腺癌組織及其癌旁組織中的表達情況（SP ×200）
a~d：分別為CNTN1蛋白在乳腺癌組織中的（–）、（+）、（++）及（+++）表達情況；e~h：分別為CNTN1蛋白在癌旁組織中的（–）、（+）、（++）及（+++）表達情況
表1
乳腺癌組織中CNTN1蛋白表達與患者臨床病理特征的關系（例）
2.2 Western blot及RT-PCR法檢測乳腺癌及其癌旁組織中CNTN1的表達結果
Western blot法檢測的電泳定性結果見圖2a ；半定量結果顯示，35例乳腺癌組織中CNTN1蛋白相對表達水平高于其相應的癌旁組織（0.825±0.221比0.412±0.117，t=12.556，P<0.001）。RT-PCR法檢測結果顯示，35例乳腺癌組織中CNTN1 mRNA相對表達水平高于其相應的癌旁組織（0.763±0.218比0.353±0.135，t=11.162，P<0.001）。
圖2
示Western blot法檢測乳腺癌及其癌旁組織中CNTN1蛋白表達的定性結果（a）及高或低CNTN1表達水平的生存曲線（b）
2.3 CNTN1蛋白表達水平與患者5年總生存情況的關系
所有患者隨訪5年，35例乳腺癌患者的中位總生存時間為47.3 ［95%CI為（26.2，56.1）］個月，其中18例CNTN1高表達（以組織中CNTN1蛋白水平的中位值0.785為臨界值，>0.785）患者的中位總生存時間為36.2 ［95%CI為（22.5，47.5）］個月，17例CNTN1 低表達患者為52.5 ［95%CI為（42.1，59.3）］個月 ，二者的生存曲線（圖2b）比較，CNTN1高表達患者的生存情況差于低表達者（χ2=4.052，P=0.049）。
3 討論
乳腺癌發病率呈逐年增高趨勢[9]，尤其是我國乳腺癌發病人數和病死人數增加迅速[10]，其發病機制目前還不清楚，一般認為其發生與抑癌基因的失活與原癌基因的激活有關[11]。基因治療是近年來發展起來的一種新型有效的治療手段[12]，也已逐步在乳腺癌的臨床治療中應用，面對逐年增加的乳腺癌患者，迫切需要更為有效的基因治療手段[13]。
CNTN1基因作為第一個被識別的免疫球蛋白超家族成員，研究者[14-15]發現它在多種腫瘤和癌細胞中發揮了促進作用。早期有研究[16]發現，CNTN1作為神經系統中廣泛表達的一種天然蛋白，在神經細胞的生長和發育過程中有著必不可少的作用。除這一原始功能外，隨著研究的深入，研究者[17-18]發現CNTN1的異常表達與腫瘤的發生發展、侵襲、轉移及預后有著密切的關系。Su等[19]通過基因芯片技術發現CNTN1基因是影響肺癌細胞侵襲能力的基因之一；Lamprianou等[20]發現CNTN1的表達與口腔鱗狀細胞癌的淋巴結轉移相關；Yan等[21]發現血管內皮生長因子-C是通過調控CNTN1的表達從而促進肺癌細胞系的侵襲能力；有研究[22]發現，CNTN1在胃癌原發灶中異常表達，可能是胃癌新生淋巴管生成的分子基礎，影響胃癌淋巴道的轉移，對胃癌的診斷、治療及預后有一定的指導價值。目前針對CNTN1在乳腺癌中的研究相對較少，其在乳腺癌中的功能仍不明確。故本課題組擬通過系列研究闡明CNTN1在乳腺癌中的功能并進一步明確其影響乳腺癌發生發展的可能機制。
本研究發現，CNTN1蛋白在乳腺癌組織中的表達陽性率高于其相應的癌旁組織（P<0.05），這與胃癌[23]、結直腸癌[24]和前列腺癌[25]中的結果基本一致；進一步分析CNTN1蛋白表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系，結果顯示，CNTN1蛋白表達與腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小和腋窩淋巴結轉移情況有關（P<0.05），而與年齡無關（P>0.05），提示CNTN1可能在乳腺癌的發生、進展和浸潤轉移過程中發揮了一定的作用。同時本研究采用Western blot及RT-PCR法檢測了CNTN1蛋白及mRNA的表達情況，結果發現，在乳腺癌組織中CNTN1蛋白及mRNA的相對表達水平均高于其相應的癌旁組織（P<0.05），這與SP法的結果相符。通過對比Western blot與RT-PCR結果發現，在乳腺癌及其相應的癌旁組織中，CNTN1蛋白表達水平略高于其mRNA表達水平，產生該結果的原因可能是CNTN1轉錄后翻譯水平及轉錄后蛋白的穩定性在正常組織與腫瘤組織中存在差異。本研究根據隨訪數據發現，CNTN1蛋白相對表達水平與乳腺癌患者的總生存期有關，如CNTN1低表達的患者生存情況更好，進一步強調提示了CNTN1可能在乳腺癌發生及發展中的重要作用。與本研究結果一致， Li等[24]發現CNTN1高表達與結直腸癌患者的不良預后相關；Szász等[26]的研究結果提示CNTN1的表達水平是與胃癌預后相關的重要指標；Alkhathami等[27]的研究結論提示CNTN1的表達水平與乳腺癌的淋巴結轉移狀態、雌激素受體與人表皮生長因子受體-2的表達水平、TNM分期和遠處轉移相關。
從本研究結果結合文獻分析推測，CNTN1基因可能促進乳腺癌的發生及發展且對乳腺癌患者的預后有一定的影響。雖然CNTN1的具體作用機制復雜且目前尚不明確，但相信隨著對CNTN1基因研究的深入會對其在乳腺癌中的作用有更全面、更透徹地認識，有望作為乳腺癌早期診斷和預后判斷的一種新的潛在標志物，有可能為乳腺癌的基因治療提供新的思路。但本研究樣本量較少且缺乏功能驗證是其不足，后續將進行體外實驗研究來進一步探討CNTN1基因調控乳腺癌的可能機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：楊曉民和陳楠設立研究方案；賀賽和田艷超完成論文撰寫；高紅變完成隨訪數據收集；耿潔、侯艷妮和范擁國完成實驗。
倫理聲明：本研究通過了陜西省腫瘤醫院醫學倫理委員會的審批 ［批文編號：醫倫審（2021）第74號］。
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，也是全球第二大惡性腫瘤相關死亡原因[1]。乳腺癌的發病率和病死率呈逐年上升趨勢，但其發生、發展的具體分子生物學機制尚不清楚[2]。雖然以手術為主的綜合治療大大提高了乳腺癌患者的遠期生存率[3]，但由于目前乳腺癌早診率仍較低，治療副作用往往難以耐受且治療費用高昂，乳腺癌的總體治療效果并不理想[4]。接觸蛋白-1（contactin-1，CNTN1）基因是免疫球蛋白超家族的一員[5-6]，有研究[7]表明CNTN1在肺癌、口腔癌、肝癌等腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移中扮演重要的角色，然而其在乳腺癌中的表達情況卻鮮有報道。為探討CNTN1基因在乳腺癌中的功能及其對于乳腺癌患者臨床預后的影響，本研究應用免疫組織化學、蛋白印跡（Western blot）及逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcriptase-PCR，RT-PCR）方法從蛋白水平及mRNA水平檢測CNTN1基因在乳腺癌組織及其癌旁組織中的表達情況，以探討CNTN1與乳腺癌患者臨床病理因素以及臨床預后之間的關系，為乳腺癌的診療提供理論依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
納入標準：① 臨床分期符合美國癌癥聯合會乳腺癌TNM分期（第7版）標準；② 入院前未進行過手術、放射治療、化學治療等治療；③ 為首發病；④ 臨床病理資料及隨訪資料齊全。排除標準：① 3個月內使用過激素類藥物治療；② 伴有其他惡性腫瘤；③ 伴有其他嚴重臟器病變或已參加其他臨床試驗者。根據納入和排除標準，收集2015年1月至2015年6月期間陜西省腫瘤醫院收治且行乳腺癌手術后的35例乳腺癌組織標本及其相應的癌旁組織（距癌組織5 cm以上），均為女性。年齡27~75歲，中位年齡49歲。每例標本均經切片后行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色鏡檢再次復查認定。標本離體后立即切塊分為2份，一份立即浸入10%中性甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋、切片，用于HE染色作病理組織學檢測和免疫組織化學染色；另一份立即放入無菌無酶的EP管中存于液氮罐中待用。
1.2 方法
1.2.1 主要試劑
兔抗人CNTN1單克隆抗體及β-actin單克隆抗體購自美國Epitomics公司，山羊抗兔二抗、免疫組織化學鏈酶菌抗生素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）試劑盒及二氨基聯苯胺顯色試劑盒均購自中國北京中杉金橋生物技術有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒和細胞蛋白放射免疫沉淀分析（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液購自中國大連Takara公司。
1.2.2 SP法檢測組織中CNTN1蛋白表達
將切片常規二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗5 min×2次，微波修復，3% H2O2孵育15 min；滴加山羊血清室溫孵育30 min。CNTN1抗體（1∶2 000）50 μL 4 ℃孵育過夜，滴加50 μL二抗孵育1 h，DAB顯色液顯色，自來水沖洗，HE復染，PBS返藍，脫水、透明、封片。以PBS作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。結果判讀：CNTN1蛋白陽性表達在細胞漿，呈棕黃色顆粒狀，在細胞靶部位著色或均勻著色者判定為陽性細胞。隨機選取5個不同高倍鏡視野觀察，根據陽性細胞染色強度及陽性細胞占百分比計分：無陽性細胞 0分，陽性細胞占比≤25% 1分，25%～75% 2分，>75% 3分；染色強度（與背景著色對比）：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩者乘積即為染色得分：0～2分為“（–）”，3～4分為“（+）”，5～7分為“（++）”，8～9分為“（+++）”。總分<3分為陰性，≥3分為陽性。由兩名有經驗的病理科醫師獨立判斷。
1.2.3 Western blot法檢測組織中CNTN1蛋白表達
于液氮中取出凍存組織，加入RIPA裂解液，于冰上裂解10 min，然后4 ℃、13 000×g離心10 min。取上清，以標準BCA法測定蛋白濃度，與5×十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，SDS）凝膠緩沖液混合，100 ℃下5 min蛋白變性，10% SDS-聚丙烯酰凝膠電泳，轉聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜 20 V 40 min，室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1h，洗滌PVDF膜3次，加CNTN1一抗（1∶2 000）、β-actin一抗（1∶2 000），4 ℃過夜；二抗（1∶3 000）室溫1 h，ECL顯影，凝膠成像系統掃描。Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。
1.2.4 RT-PCR法檢測組織中CNTN1 mRNA表達
提取凍存組織30 mg，用Trizol按說明書要求提取目標組織RNA，并逆轉錄為cDNA。以β-actin為內參照，根據Genbank中CNTN1基因片段序列設計如下引物并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，用PCR方法擴增CNTN1。CNTN1上游引物為5′-TGTTCAGCAAATTCATCCCA-3′，下游引物為5′-TCTACCCACTCAGGGAATGC-3′，擴增片段長度1 029 bp；β-actin上游引物為5′-AATCTGGCACCACACCTTCTA-3′，下游引物為5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCA-3′，擴增片段長度370 bp。反應條件均為25 μL的反應體系，程序設置如下： 95 °C 3 min，95 °C 20 s，56 °C 20 s，共40循環，72 °C 20 s，95 °C 15 s，60 °C 15 s，60～95 °C 20 min，95 °C 15 s。瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。采用2–ΔΔCT表示CNTN1 mRNA 相對表達水平。
1.3 隨訪方法
采用電話或門診的方式進行隨訪，隨訪時間截至2020年12月31日。納入本研究患者均獲得隨訪，無失訪病例。主要研究終點指標為總生存時間，其定義為首次診斷為乳腺癌至患者死亡或末次隨訪的時間。
1.4 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，采用GraphPad Prism7.0軟件進行生存曲線制作。符合正態分布的計量數據用均數±標準差（±s）表示且2組間比較采用t檢驗，計數資料采用連續性校正的χ2檢驗，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并行log-rank檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SP法檢測CNTN1蛋白在乳腺癌及其相應癌旁組織中的表達結果以及其與患者臨床病理特征的關系
CNTN1呈棕黃色顆粒主要表達于細胞漿，乳腺癌組織中多呈陽性反應，著色較深且呈彌漫性分布（圖1a~1d）；癌旁組織著色較淺，部分呈局灶性（圖1e~1h）。CNTN1蛋白表達陽性率在癌組織中為65.7%（23/35），其在相應的癌旁組織中為45.7%（16/35），前者高于后者（χ2=8.235，P=0.003）。CNTN1蛋白在乳腺癌組織中的蛋白表達陽性率與患者年齡無關（P>0.05），但其在腫瘤直徑較大（>2 cm）、低分化、TNM分期較高（Ⅲ+Ⅳ期）以及有腋窩淋巴結轉移乳腺癌患者的癌組織中均高于腫瘤直徑較小（≤2 cm）、高/中分化、TNM分期較低（ Ⅰ+Ⅱ期）以及無腋窩淋巴結轉移乳腺癌患者（P<0.05），見表1。
圖1
示CNTN1蛋白在乳腺癌組織及其癌旁組織中的表達情況（SP ×200）
a~d：分別為CNTN1蛋白在乳腺癌組織中的（–）、（+）、（++）及（+++）表達情況；e~h：分別為CNTN1蛋白在癌旁組織中的（–）、（+）、（++）及（+++）表達情況
表1
乳腺癌組織中CNTN1蛋白表達與患者臨床病理特征的關系（例）
2.2 Western blot及RT-PCR法檢測乳腺癌及其癌旁組織中CNTN1的表達結果
Western blot法檢測的電泳定性結果見圖2a ；半定量結果顯示，35例乳腺癌組織中CNTN1蛋白相對表達水平高于其相應的癌旁組織（0.825±0.221比0.412±0.117，t=12.556，P<0.001）。RT-PCR法檢測結果顯示，35例乳腺癌組織中CNTN1 mRNA相對表達水平高于其相應的癌旁組織（0.763±0.218比0.353±0.135，t=11.162，P<0.001）。
圖2
示Western blot法檢測乳腺癌及其癌旁組織中CNTN1蛋白表達的定性結果（a）及高或低CNTN1表達水平的生存曲線（b）
2.3 CNTN1蛋白表達水平與患者5年總生存情況的關系
所有患者隨訪5年，35例乳腺癌患者的中位總生存時間為47.3 ［95%CI為（26.2，56.1）］個月，其中18例CNTN1高表達（以組織中CNTN1蛋白水平的中位值0.785為臨界值，>0.785）患者的中位總生存時間為36.2 ［95%CI為（22.5，47.5）］個月，17例CNTN1 低表達患者為52.5 ［95%CI為（42.1，59.3）］個月 ，二者的生存曲線（圖2b）比較，CNTN1高表達患者的生存情況差于低表達者（χ2=4.052，P=0.049）。
3 討論
乳腺癌發病率呈逐年增高趨勢[9]，尤其是我國乳腺癌發病人數和病死人數增加迅速[10]，其發病機制目前還不清楚，一般認為其發生與抑癌基因的失活與原癌基因的激活有關[11]。基因治療是近年來發展起來的一種新型有效的治療手段[12]，也已逐步在乳腺癌的臨床治療中應用，面對逐年增加的乳腺癌患者，迫切需要更為有效的基因治療手段[13]。
CNTN1基因作為第一個被識別的免疫球蛋白超家族成員，研究者[14-15]發現它在多種腫瘤和癌細胞中發揮了促進作用。早期有研究[16]發現，CNTN1作為神經系統中廣泛表達的一種天然蛋白，在神經細胞的生長和發育過程中有著必不可少的作用。除這一原始功能外，隨著研究的深入，研究者[17-18]發現CNTN1的異常表達與腫瘤的發生發展、侵襲、轉移及預后有著密切的關系。Su等[19]通過基因芯片技術發現CNTN1基因是影響肺癌細胞侵襲能力的基因之一；Lamprianou等[20]發現CNTN1的表達與口腔鱗狀細胞癌的淋巴結轉移相關；Yan等[21]發現血管內皮生長因子-C是通過調控CNTN1的表達從而促進肺癌細胞系的侵襲能力；有研究[22]發現，CNTN1在胃癌原發灶中異常表達，可能是胃癌新生淋巴管生成的分子基礎，影響胃癌淋巴道的轉移，對胃癌的診斷、治療及預后有一定的指導價值。目前針對CNTN1在乳腺癌中的研究相對較少，其在乳腺癌中的功能仍不明確。故本課題組擬通過系列研究闡明CNTN1在乳腺癌中的功能并進一步明確其影響乳腺癌發生發展的可能機制。
本研究發現，CNTN1蛋白在乳腺癌組織中的表達陽性率高于其相應的癌旁組織（P<0.05），這與胃癌[23]、結直腸癌[24]和前列腺癌[25]中的結果基本一致；進一步分析CNTN1蛋白表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系，結果顯示，CNTN1蛋白表達與腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小和腋窩淋巴結轉移情況有關（P<0.05），而與年齡無關（P>0.05），提示CNTN1可能在乳腺癌的發生、進展和浸潤轉移過程中發揮了一定的作用。同時本研究采用Western blot及RT-PCR法檢測了CNTN1蛋白及mRNA的表達情況，結果發現，在乳腺癌組織中CNTN1蛋白及mRNA的相對表達水平均高于其相應的癌旁組織（P<0.05），這與SP法的結果相符。通過對比Western blot與RT-PCR結果發現，在乳腺癌及其相應的癌旁組織中，CNTN1蛋白表達水平略高于其mRNA表達水平，產生該結果的原因可能是CNTN1轉錄后翻譯水平及轉錄后蛋白的穩定性在正常組織與腫瘤組織中存在差異。本研究根據隨訪數據發現，CNTN1蛋白相對表達水平與乳腺癌患者的總生存期有關，如CNTN1低表達的患者生存情況更好，進一步強調提示了CNTN1可能在乳腺癌發生及發展中的重要作用。與本研究結果一致， Li等[24]發現CNTN1高表達與結直腸癌患者的不良預后相關；Szász等[26]的研究結果提示CNTN1的表達水平是與胃癌預后相關的重要指標；Alkhathami等[27]的研究結論提示CNTN1的表達水平與乳腺癌的淋巴結轉移狀態、雌激素受體與人表皮生長因子受體-2的表達水平、TNM分期和遠處轉移相關。
從本研究結果結合文獻分析推測，CNTN1基因可能促進乳腺癌的發生及發展且對乳腺癌患者的預后有一定的影響。雖然CNTN1的具體作用機制復雜且目前尚不明確，但相信隨著對CNTN1基因研究的深入會對其在乳腺癌中的作用有更全面、更透徹地認識，有望作為乳腺癌早期診斷和預后判斷的一種新的潛在標志物，有可能為乳腺癌的基因治療提供新的思路。但本研究樣本量較少且缺乏功能驗證是其不足，后續將進行體外實驗研究來進一步探討CNTN1基因調控乳腺癌的可能機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：楊曉民和陳楠設立研究方案；賀賽和田艷超完成論文撰寫；高紅變完成隨訪數據收集；耿潔、侯艷妮和范擁國完成實驗。
倫理聲明：本研究通過了陜西省腫瘤醫院醫學倫理委員會的審批 ［批文編號：醫倫審（2021）第74號］。
