引用本文： 樂奇, 呂坤, 姜雷, 王軍, 姚南. 基于生物信息學分析肥大細胞表達膜蛋白1在胃癌中的表達及其與免疫浸潤的關系. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(5): 599-606. doi: 10.7507/1007-9424.202107063 復制
胃癌（gastric cancer）是消化系統最常見的惡性腫瘤之一。根據統計，2018年胃癌新增人數達100萬，死亡人數近80萬（死亡率達8.2%），亞洲地區發病占主要地位[1-2]。胃癌是一種分子和表型高度異質的疾病，早期癥狀不明顯且缺少可靠的生物標志物，約70%的胃癌患者進展至晚期階段、部分患者發生遠隔器官轉移，是胃癌預后不良的因素之一[3-4]。目前免疫療法是治療晚期腫瘤的重要替代方案，可有效延長部分患者的生存期。目前批準使用的免疫抑制劑，如細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4）、程序性死亡受體1（PD-1）、程序性死亡-配體1（PD-L1）等，在惡性黑色素瘤及腎細胞癌中臨床療效顯著，但對晚期胃癌的臨床治療效果不佳[5-6]。這些分子參與調節腫瘤的免疫應答，在腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中它們經常表達失調，從而抑制效應T細胞對腫瘤細胞的有效殺傷[7]。免疫治療的療效與腫瘤免疫微環境密切相關，腫瘤免疫微環境主要包括血管、免疫細胞、基質細胞、細胞外基質等成分。復雜的微環境可通過調節增殖、化學治療耐藥性和免疫逃逸來提高腫瘤細胞的侵襲性，這對早期診斷及臨床預后有重要意義[8-9]。因此，深入了解胃癌的發病機制及免疫相關機制，尋求更敏感的生物標志物至關重要。本研究通過癌癥基因組圖譜（the cancer genomeatlas，TCGA）數據庫下載胃癌相關表達數據，篩選出與胃癌預后相關的關鍵基因肥大細胞表達膜蛋白 1（mast cell expressed membrane protein 1，MCEMP1），再通過CIBERSORT算法及TISIDB數據庫分析其與胃癌免疫浸潤的關系。
1 資料與方法
1.1 TCGA數據集分析
從TCGA在線數據庫（
1.2 蛋白質相互作用網絡（protein-protein interaction network，PPI）的構建和Cox比例風險回歸分析
利用蛋白質-蛋白質相互作用在線數據庫（
1.3 關鍵基因的表達與臨床病理特征及預后的相關性分析
基于TCGA獲取的胃癌相關轉錄組FPKM數據和臨床數據信息，使用R 4.0.5軟件中的“limma”“ggpubr”“beeswarm”包及Wilcoxon秩和檢驗分析關鍵基因MCEMP1在胃癌組織樣本及癌旁組織樣本中的表達差異；利用R 4.0.5軟件“survival”包分析兩組之間總體生存（overall survival，OS）率的差異。并通過GEPIA（
1.4 基因集富集分析
以MSigDB的C7.all.v.7.4symbols.gmt作為目標集，使用從Broad Institute下載的基因集富集分析（GSEA）軟件（版本4.1.0）對所有腫瘤病例進行GSEA分析，得出差異具有統計學意義的基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集通路。采用缺省加權富集統計的方法，隨機組合次數設為1 000次，其他參數設為默認值。僅將名義（NOM）P<0.05的基因集視為顯著富集的基因集，具有統計學意義。
1.5 腫瘤免疫細胞浸潤分析
CIBERSORT是一種基于基因表達的反卷積算法，用于量化腫瘤浸潤的免疫細胞的比例，為了提高反卷積算法的準確性，對每個樣本文件計算了CIBERSORT P值，僅將CIBERSORT P值<0.05的數據進行過濾并選擇用于下一步分析。使用R 4.0.5軟件中的“limma”“vioplot”“ggplot2”“ggpubr”和“ggExtra”包，對胃癌中的免疫細胞進行定量差異分析，并使用Spearman秩相關分析MCEMP1表達與浸潤免疫細胞之間的相關性。本部分研究基于1.1中的TCGA數據。
1.6 TISIDB數據庫分析
TISIDB在線數據庫（
1.7 統計學方法
本研究數據分析采用R 4.0.5、Strawberry Perl 5.32.1、GSEA 4.1.0軟件進行。采用Wilcoxon秩和檢驗分析關鍵基因在胃癌中的差異表達情況，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗分析關鍵基因與胃癌臨床病理特征之間的相關性，采用Spearman秩相關分析MCEMP1表達與浸潤免疫細胞及免疫分子之間的相關性。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 篩選胃癌關鍵基因
2.1.1 篩選胃癌組織及其癌旁組織中的DEGs
以︱log2FC︱>1、FDR<0.05為標準，篩選基質組（低分和高分）和免疫組（低分和高分）中的DEGs。在基質評分隊列中篩選出1 756種DEGs，其中1 535種基因表達上調，221種基因表達下調；在免疫評分隊列中篩選出1 169種DEGs，其中881種基因表達上調，288種基因表達下調。本研究選取基質組和免疫組（低分和高分）中前20種差異明顯的DEGs（表1），并對基質和免疫評分隊列中共表達上調（640種）及下調（120種）的DEGs進行韋恩圖可視化（圖1a和1b）。
表1
基質評分組與免疫評分組（低分和高分）中的前 20 種 DEGs
圖1
示胃癌中差異表達的基因、MCEMP1的表達及其與預后的關系
a、b：基質評分和免疫評分中表達上調（a）及下調（b）DEGs的韋恩圖；c：單因素Cox比例風險回歸分析所示的前11種差異表達基因，以
2.1.2 篩選關鍵基因
以交互關系大于0.900并隱藏網絡中已斷開的節點為標準，在STRING在線數據庫中對760種DEGs進行網絡構建，最終該網絡覆蓋了247個節點和1 735個邊。利用單因素Cox比例風險回歸分析研究這些DEGs與胃癌預后的相關性，并篩選出具有統計學意義的DGEs共26種，本研究按P<0.01進一步篩選出11種DGEs，并繪制森林圖（圖1c）。將PPI網絡中交互節點數在前60位的DGEs和單因素Cox比例風險回歸分析結果篩選出的DEGs進行交叉分析發現，MCEMP1是這兩個分析中唯一的重疊基因（圖1d）。
2.2 MCEMP1與胃癌預后相關
在本研究中，筆者通過計算MCEMP1表達量的中位值將所有胃癌病例分為高和低MCEMP1表達組，Wilcoxon秩和檢驗結果表明：MCEMP1在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.001），見圖1e。生存分析結果表明，胃癌患者中MCEMP1的高表達與預后呈負相關［HR=1.176，95%CI（1.066，1.297），P=0.046］，見圖1f。進一步使用GEPIA數據庫驗證MCEMP1表達與胃癌患者預后的相關性，其結果也顯示MCEMP1高表達組的OS差于低表達組（P=0.012），見圖1g。
基于Kruskal-Wallis秩和檢驗統計分析，結果顯示MCEMP1表達水平分別與年齡、胃癌T分期及臨床分期存在相關性（P<0.05），而與性別、組織學分級、胃癌N分期及M分期無明顯關聯（P>0.05），見圖2a～2g。結合上述結果，本研究發現MCEMP1過表達可能與胃癌的進展有關，可能是胃癌預后的相關生物標志物。
圖2
示MCEMP1表達與臨床病理特征之間的相關性、胃癌中MCEMP1的GSEA分析及免疫細胞浸潤水平比較，以及MCEMP1表達與免疫細胞浸潤水平之間的相關性
a～g：MCEMP1表達與臨床病理特征之間的相關性，包括年齡（a）、性別（b）、T分期（c）、N分期（d）、M分期（e）、臨床分期（f）、組織學分級（g）；h：MCEMP1功能富集分析；i：MCEMP1高表達組和低表達組中22種免疫細胞浸潤水平比較，綠色代表MCEMP1低表達組，紅色代表MCEMP1高表達組；j～u：MCEMP1表達與免疫細胞浸潤水平之間的相關性，包括中性粒細胞（j）、嗜酸性粒細胞（k）、巨噬細胞M0（l）、巨噬細胞M2（m）、靜息NK細胞（n）、活化肥大細胞（o）、CD8+T細胞（p）、Tregs（q）、活化NK細胞（r）、靜息CD4記憶T細胞（s）、幼稚B細胞（t）、靜息肥大細胞（u）
2.3 GSEA富集分析
為了探索MCEMP1在胃癌中的生物學功能及作用途徑，利用GSEA中MSigDB收集的C7基因集來分析MCEMP1高表達組及低表達組中差異具有統計學意義的通路，本研究進一步篩選與免疫相關的信號通路（圖2h）。其結果顯示，MCEMP1高表達樣本主要富集在核苷酸寡聚化結構域（NOD）樣受體信號通路、蛋白酶體、細胞因子與細胞因子受體相互作用、TOLL樣受體（Toll-like reporters，TLRs）信號通路、胞質DNA傳感途徑、移植物抗宿主病、視黃酸誘導基因蛋白Ⅰ（RIG-Ⅰ）樣受體信號通路及NK細胞介導的細胞毒性途徑。
2.4 MCEMP1與免疫浸潤細胞相關
基于CIBERSORT算法分析腫瘤浸潤的免疫細胞的比例，根據MCEMP1表達的中位值，將 375 個腫瘤樣本分為高低表達兩組，評估腫瘤樣本中 22 種免疫細胞比例（圖2i），篩選出了12種差異有統計學意義的免疫細胞。相關性分析結果顯示：MCEMP1的表達水平與巨噬細胞M0和M2、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、靜息NK細胞、活性肥大細胞比例呈正相關（P<0.05），與幼稚B細胞、靜息CD4記憶T細胞、靜息肥大細胞、CD8+T細胞、活性NK細胞和調節性T細胞（Tregs）比例呈負相關（P<0.05），見圖2j－2u。
2.5 MCEMP1與免疫分子有關
為了進一步探索MCMEP1與胃癌免疫浸潤的關系，本研究從TISIDB數據庫下載了MCEMP1表達與免疫調節劑、趨化因子及其受體之間的相關數據。相關性分析結果顯示，MCEMP1與免疫抑制因子 ［包括細胞程序性死亡蛋白1配體2（PDCD1LG2，rs=0.327）、甲型肝炎病毒細胞受體2（HAVCR2，rs=0.379）、分化簇（CD）274（rs=0.340）、白細胞介素（IL）-10（rs=0.324）、集落刺激因子1受體（CSF1R，rs=0.284）和IL-10RB（rs=0.246）］、免疫刺激因子 ［CD86（rs=0.387）、IL-6（rs=0.394）、CD80（rs=0.383）、IL-2RA（rs=0.375）、CD276（rs=0.324）和腫瘤壞死因子受體超家族成員4（TNFSF4，rs=0.250）］、趨化因子 ［C-X-C 基序趨化因子配體（CXCL）8（rs=0.612）、CXCL1（rs=0.546）、C-C 基序趨化因子配體（CCL）3（rs=0.506）、CCL7（rs=0.559）、CCL8（rs=0.439）和CCL18（rs=0.464）］和趨化因子受體 ［C-X-C 基序趨化因子受體（CXCR）1（rs=0.680）、CXCR2（rs=0.615）、C-C 基序趨化因子受體（CCR）1（rs=0.423）、CCR2（rs=0.216）、CCR3（rs=0.429）和CCR8（rs=0.187）］之間均存在正相關關系（P<0.05），見圖3。
圖3
示MCEMP1 表達水平與免疫分子之間的相關性散點圖
a～f：免疫抑制因子，包括PDCD1LG2（a）、HAVCR2（b）、CD274（c）、IL-10（d）、CSF1R（e）、IL-10RB（f）；g～l：免疫刺激因子，包括CD80（g）、CD86（h）、CD276（i）、IL-2RA（j）、TNFSF4（k）、IL-6（l）；m～r：趨化因子，包括CCL3（m）、CCL7（n）、CCL8（o）、CCL18（p）、CXCL1（q）、CXCL8（r）；s～x：趨化因子受體，包括CCR1（s）、CCR2（t）、CCR3（u）、CCR8（v）、CXCR1（w）、CXCR2（x）
3 討論
大量證據表明，TME在腫瘤發生、發展及臨床治療療效中起著至關重要的作用，腫瘤細胞可以通過分泌各種細胞因子、趨化因子和其他因子來重塑微環境[10-12]。另外，已經進行了一些研究來剖析胃癌中TME的特征[13-14]。探索TME中各類細胞的潛在機制可能是一種有前景的策略，可能為胃癌的治療提供新的選擇[15]。本研究基于胃癌樣本的轉錄組學數據分析免疫和基質細胞的組分，然后提取DGEs，利用DEGs蛋白質互作網絡分析及單因素Cox比例風險回歸分析篩選出關鍵基因MCEMP1。MCEMP1（也被稱為CR19ORF59）是肥大細胞表達的一種跨膜蛋白，其C末端暴露于細胞膜外，而N末端分布在細胞質。肥大細胞表面的跨膜蛋白與周圍組織中的細胞接觸，從而介導其周圍環境的信號調節[16]。目前研究認為，MCEMP1參與調節肥大細胞分化及相關免疫反應機制[16-17]。肥大細胞在調節急性和慢性炎癥反應、微環境的重建等過程發揮重要作用[18]，而慢性炎癥又是癌癥發生的重要原因[19-20]。腫瘤中浸潤的肥大細胞有利于腫瘤細胞的增殖和侵襲，也可以間接通過重塑TME和調節腫瘤細胞的免疫應答來加速腫瘤的進展[21]。肥大細胞通過釋放經典的促血管生成因子，包括血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子2（FGF-2）、血小板衍生生長因子（PDGF）和白介素6（IL-6），以及非經典的促血管生成因子（主要是蛋白酶，包括類胰蛋白酶和糜酶），從而積極地促進血管生成并誘導新血管形成[22-23]。這些均提示MCEMP1可能與腫瘤的發生、進展及腫瘤免疫密切相關。
正如大量資料報道，免疫細胞可以誘導胃癌免疫微環境的重塑，進而影響胃癌患者的預后[24-26]。基于CIBERSORT算法、差異分析及相關性分析的結果表明，MCEMP1與腫瘤免疫細胞浸潤有關，其中巨噬細胞M0/M2、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、靜息NK細胞及活性肥大細胞與MCEMP1的表達水平呈正相關，而幼稚B細胞、靜息CD4記憶T細胞、CD8+T細胞、靜息肥大細胞、活性NK細胞及Tregs與MCEMP1的表達水平呈負相關。研究[27]指出，在胃癌中IL33可以激活肥大細胞及腫瘤相關巨噬細胞（TAM），從而發揮促腫瘤作用。另外，肥大細胞在胃癌微環境中蓄積，并參與腫瘤新生血管形成，促進腫瘤生長和轉移[28]。TAM的常見表型M2巨噬細胞可以分泌多種細胞因子，如IL-4、IL-6、IL-10、VEGF等，發揮促腫瘤作用。胃癌患者的腫瘤區域內的肥大細胞及M2巨噬細胞的密度均增加[28-29]。這可能揭示MCEMP1的高表達有助于肥大細胞及M2巨噬細胞的免疫反應及浸潤，共同說明MCEMP1可以作用于胃癌浸潤免疫細胞的調節和募集。
NK細胞是細胞毒性淋巴細胞，參與早期防御及腫瘤免疫監視，通過與腫瘤細胞相互作用直接發揮抗腫瘤作用，也可以通過影響TME中其他免疫細胞的活性間接殺傷癌細胞[30]，這與本研究的結果一致。腫瘤中浸潤的Treg可以抑制腫瘤相關的樹突狀細胞的免疫活性，在免疫逃逸中起關鍵作用，以促進胃癌的免疫耐受性[31]。而本研究發現MCEMP1的表達水平與Treg的浸潤水平呈負相關。研究報道Treg的募集隨著腫瘤進展而降低，說明TME中的Treg是動態分布的[32]。消化系統中Th17細胞和Treg之間的平衡保障了免疫系統的穩態和正常功能，但TME可能會擾亂二者之間的平衡[31]。Th17細胞可以驅動抗腫瘤免疫反應[33-34]，因此筆者推測在胃癌的發展中MCEMP1的表達可能與Treg之間的相關性會減弱，與Th17細胞的相關性增強。通過進一步分析TISIDB數據，證實MCEMP1與胃癌中的多種免疫分子有關，可能影響TME中的免疫浸潤。這些均揭示MCEMP1與胃癌免疫浸潤密切相關，它可能通過這些免疫細胞及免疫分子參與調節胃癌的發生發展。
為了進一步了解MCEMP1在胃癌中的調控機制，本研究基于GSEA數據庫進行KEGG基因富集分析，結果表明，MCEMP1涉及的通路包括NOD樣受體信號通路、蛋白酶體、細胞因子與細胞因子受體相互作用、TLRs信號通路、胞質DNA傳感途徑、移植物抗宿主病、RIG-Ⅰ樣受體信號通路及NK細胞介導的細胞毒性途徑。TLRs信號通路參與調節廣泛的生物反應，包括腫瘤的炎癥和免疫反應；在多種腫瘤細胞中表達，在不同的腫瘤中可表現出不同的生物學功能，如TLR5在乳腺癌和胃癌中均高表達，TLR5信號傳導促進胃癌增殖[35]，但卻抑制乳腺癌的生長[36]。TLRs可能通過TME或腫瘤細胞本身的促炎反應、抗細胞凋亡、促進腫瘤細胞增殖和促纖維化信號發揮致癌作用[37]。TLRs是炎癥信號傳導的重要調節因子，其異常激活致使NF-κB信號激活和炎癥細胞因子的過度表達[38]（如IL-1β、TNF-α和IL-6），而這些炎癥細胞因子是促進胃癌、肝癌和結直腸癌發生發展的重要因素[39]。研究[40]表明，TLRs通過刺激細胞因子IL-1β和TNF-α的釋放，使靶細胞中的NF-κB信號活化。而在抗細胞凋亡途徑中，NF-κB是調控抗凋亡基因表達的最關鍵的信號，同時也抑制了促凋亡途徑。因此，TLRs誘導的NF-κB激活可以促進腫瘤細胞的存活及增殖[41]。MCEMP1的啟動子區域包含NF-κB結合基序[16]，而NF-κB是TLRs信號通路重要的環節之一，共同參與TLRs信號通路發揮促腫瘤作用。以上研究結果表明，MCEMP1過表達可能通過TLRs信號通路介導的NF-κB信號激活，進一步調節體內慢性炎癥、腫瘤細胞促炎反應、抗細胞凋亡等過程，參與胃癌的發生發展。
本研究基于生物信息學分析發現MCEMP1與胃癌發生、發展等過程密切相關，其高表達與胃癌總體生存、多種免疫浸潤細胞及免疫分子有關，有作為胃癌潛在標志物及治療靶點的可能。但本研究是基于生物信息學分析得出的結果，仍需進一步組織學或細胞學實驗進行深入探討。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：樂奇是本研究設計者和執行者，同時參與數據提取分析及論文初稿的寫作；呂坤參與結果討論與分析；王軍和姜雷參與實施研究、獲取研究經費；姚南是本研究的監督者并參與文章潤色及修改。
胃癌（gastric cancer）是消化系統最常見的惡性腫瘤之一。根據統計，2018年胃癌新增人數達100萬，死亡人數近80萬（死亡率達8.2%），亞洲地區發病占主要地位[1-2]。胃癌是一種分子和表型高度異質的疾病，早期癥狀不明顯且缺少可靠的生物標志物，約70%的胃癌患者進展至晚期階段、部分患者發生遠隔器官轉移，是胃癌預后不良的因素之一[3-4]。目前免疫療法是治療晚期腫瘤的重要替代方案，可有效延長部分患者的生存期。目前批準使用的免疫抑制劑，如細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4）、程序性死亡受體1（PD-1）、程序性死亡-配體1（PD-L1）等，在惡性黑色素瘤及腎細胞癌中臨床療效顯著，但對晚期胃癌的臨床治療效果不佳[5-6]。這些分子參與調節腫瘤的免疫應答，在腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中它們經常表達失調，從而抑制效應T細胞對腫瘤細胞的有效殺傷[7]。免疫治療的療效與腫瘤免疫微環境密切相關，腫瘤免疫微環境主要包括血管、免疫細胞、基質細胞、細胞外基質等成分。復雜的微環境可通過調節增殖、化學治療耐藥性和免疫逃逸來提高腫瘤細胞的侵襲性，這對早期診斷及臨床預后有重要意義[8-9]。因此，深入了解胃癌的發病機制及免疫相關機制，尋求更敏感的生物標志物至關重要。本研究通過癌癥基因組圖譜（the cancer genomeatlas，TCGA）數據庫下載胃癌相關表達數據，篩選出與胃癌預后相關的關鍵基因肥大細胞表達膜蛋白 1（mast cell expressed membrane protein 1，MCEMP1），再通過CIBERSORT算法及TISIDB數據庫分析其與胃癌免疫浸潤的關系。
1 資料與方法
1.1 TCGA數據集分析
從TCGA在線數據庫（
1.2 蛋白質相互作用網絡（protein-protein interaction network，PPI）的構建和Cox比例風險回歸分析
利用蛋白質-蛋白質相互作用在線數據庫（
1.3 關鍵基因的表達與臨床病理特征及預后的相關性分析
基于TCGA獲取的胃癌相關轉錄組FPKM數據和臨床數據信息，使用R 4.0.5軟件中的“limma”“ggpubr”“beeswarm”包及Wilcoxon秩和檢驗分析關鍵基因MCEMP1在胃癌組織樣本及癌旁組織樣本中的表達差異；利用R 4.0.5軟件“survival”包分析兩組之間總體生存（overall survival，OS）率的差異。并通過GEPIA（
1.4 基因集富集分析
以MSigDB的C7.all.v.7.4symbols.gmt作為目標集，使用從Broad Institute下載的基因集富集分析（GSEA）軟件（版本4.1.0）對所有腫瘤病例進行GSEA分析，得出差異具有統計學意義的基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集通路。采用缺省加權富集統計的方法，隨機組合次數設為1 000次，其他參數設為默認值。僅將名義（NOM）P<0.05的基因集視為顯著富集的基因集，具有統計學意義。
1.5 腫瘤免疫細胞浸潤分析
CIBERSORT是一種基于基因表達的反卷積算法，用于量化腫瘤浸潤的免疫細胞的比例，為了提高反卷積算法的準確性，對每個樣本文件計算了CIBERSORT P值，僅將CIBERSORT P值<0.05的數據進行過濾并選擇用于下一步分析。使用R 4.0.5軟件中的“limma”“vioplot”“ggplot2”“ggpubr”和“ggExtra”包，對胃癌中的免疫細胞進行定量差異分析，并使用Spearman秩相關分析MCEMP1表達與浸潤免疫細胞之間的相關性。本部分研究基于1.1中的TCGA數據。
1.6 TISIDB數據庫分析
TISIDB在線數據庫（
1.7 統計學方法
本研究數據分析采用R 4.0.5、Strawberry Perl 5.32.1、GSEA 4.1.0軟件進行。采用Wilcoxon秩和檢驗分析關鍵基因在胃癌中的差異表達情況，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗分析關鍵基因與胃癌臨床病理特征之間的相關性，采用Spearman秩相關分析MCEMP1表達與浸潤免疫細胞及免疫分子之間的相關性。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 篩選胃癌關鍵基因
2.1.1 篩選胃癌組織及其癌旁組織中的DEGs
以︱log2FC︱>1、FDR<0.05為標準，篩選基質組（低分和高分）和免疫組（低分和高分）中的DEGs。在基質評分隊列中篩選出1 756種DEGs，其中1 535種基因表達上調，221種基因表達下調；在免疫評分隊列中篩選出1 169種DEGs，其中881種基因表達上調，288種基因表達下調。本研究選取基質組和免疫組（低分和高分）中前20種差異明顯的DEGs（表1），并對基質和免疫評分隊列中共表達上調（640種）及下調（120種）的DEGs進行韋恩圖可視化（圖1a和1b）。
表1
基質評分組與免疫評分組（低分和高分）中的前 20 種 DEGs
圖1
示胃癌中差異表達的基因、MCEMP1的表達及其與預后的關系
a、b：基質評分和免疫評分中表達上調（a）及下調（b）DEGs的韋恩圖；c：單因素Cox比例風險回歸分析所示的前11種差異表達基因，以
2.1.2 篩選關鍵基因
以交互關系大于0.900并隱藏網絡中已斷開的節點為標準，在STRING在線數據庫中對760種DEGs進行網絡構建，最終該網絡覆蓋了247個節點和1 735個邊。利用單因素Cox比例風險回歸分析研究這些DEGs與胃癌預后的相關性，并篩選出具有統計學意義的DGEs共26種，本研究按P<0.01進一步篩選出11種DGEs，并繪制森林圖（圖1c）。將PPI網絡中交互節點數在前60位的DGEs和單因素Cox比例風險回歸分析結果篩選出的DEGs進行交叉分析發現，MCEMP1是這兩個分析中唯一的重疊基因（圖1d）。
2.2 MCEMP1與胃癌預后相關
在本研究中，筆者通過計算MCEMP1表達量的中位值將所有胃癌病例分為高和低MCEMP1表達組，Wilcoxon秩和檢驗結果表明：MCEMP1在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.001），見圖1e。生存分析結果表明，胃癌患者中MCEMP1的高表達與預后呈負相關［HR=1.176，95%CI（1.066，1.297），P=0.046］，見圖1f。進一步使用GEPIA數據庫驗證MCEMP1表達與胃癌患者預后的相關性，其結果也顯示MCEMP1高表達組的OS差于低表達組（P=0.012），見圖1g。
基于Kruskal-Wallis秩和檢驗統計分析，結果顯示MCEMP1表達水平分別與年齡、胃癌T分期及臨床分期存在相關性（P<0.05），而與性別、組織學分級、胃癌N分期及M分期無明顯關聯（P>0.05），見圖2a～2g。結合上述結果，本研究發現MCEMP1過表達可能與胃癌的進展有關，可能是胃癌預后的相關生物標志物。
圖2
示MCEMP1表達與臨床病理特征之間的相關性、胃癌中MCEMP1的GSEA分析及免疫細胞浸潤水平比較，以及MCEMP1表達與免疫細胞浸潤水平之間的相關性
a～g：MCEMP1表達與臨床病理特征之間的相關性，包括年齡（a）、性別（b）、T分期（c）、N分期（d）、M分期（e）、臨床分期（f）、組織學分級（g）；h：MCEMP1功能富集分析；i：MCEMP1高表達組和低表達組中22種免疫細胞浸潤水平比較，綠色代表MCEMP1低表達組，紅色代表MCEMP1高表達組；j～u：MCEMP1表達與免疫細胞浸潤水平之間的相關性，包括中性粒細胞（j）、嗜酸性粒細胞（k）、巨噬細胞M0（l）、巨噬細胞M2（m）、靜息NK細胞（n）、活化肥大細胞（o）、CD8+T細胞（p）、Tregs（q）、活化NK細胞（r）、靜息CD4記憶T細胞（s）、幼稚B細胞（t）、靜息肥大細胞（u）
2.3 GSEA富集分析
為了探索MCEMP1在胃癌中的生物學功能及作用途徑，利用GSEA中MSigDB收集的C7基因集來分析MCEMP1高表達組及低表達組中差異具有統計學意義的通路，本研究進一步篩選與免疫相關的信號通路（圖2h）。其結果顯示，MCEMP1高表達樣本主要富集在核苷酸寡聚化結構域（NOD）樣受體信號通路、蛋白酶體、細胞因子與細胞因子受體相互作用、TOLL樣受體（Toll-like reporters，TLRs）信號通路、胞質DNA傳感途徑、移植物抗宿主病、視黃酸誘導基因蛋白Ⅰ（RIG-Ⅰ）樣受體信號通路及NK細胞介導的細胞毒性途徑。
2.4 MCEMP1與免疫浸潤細胞相關
基于CIBERSORT算法分析腫瘤浸潤的免疫細胞的比例，根據MCEMP1表達的中位值，將 375 個腫瘤樣本分為高低表達兩組，評估腫瘤樣本中 22 種免疫細胞比例（圖2i），篩選出了12種差異有統計學意義的免疫細胞。相關性分析結果顯示：MCEMP1的表達水平與巨噬細胞M0和M2、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、靜息NK細胞、活性肥大細胞比例呈正相關（P<0.05），與幼稚B細胞、靜息CD4記憶T細胞、靜息肥大細胞、CD8+T細胞、活性NK細胞和調節性T細胞（Tregs）比例呈負相關（P<0.05），見圖2j－2u。
2.5 MCEMP1與免疫分子有關
為了進一步探索MCMEP1與胃癌免疫浸潤的關系，本研究從TISIDB數據庫下載了MCEMP1表達與免疫調節劑、趨化因子及其受體之間的相關數據。相關性分析結果顯示，MCEMP1與免疫抑制因子 ［包括細胞程序性死亡蛋白1配體2（PDCD1LG2，rs=0.327）、甲型肝炎病毒細胞受體2（HAVCR2，rs=0.379）、分化簇（CD）274（rs=0.340）、白細胞介素（IL）-10（rs=0.324）、集落刺激因子1受體（CSF1R，rs=0.284）和IL-10RB（rs=0.246）］、免疫刺激因子 ［CD86（rs=0.387）、IL-6（rs=0.394）、CD80（rs=0.383）、IL-2RA（rs=0.375）、CD276（rs=0.324）和腫瘤壞死因子受體超家族成員4（TNFSF4，rs=0.250）］、趨化因子 ［C-X-C 基序趨化因子配體（CXCL）8（rs=0.612）、CXCL1（rs=0.546）、C-C 基序趨化因子配體（CCL）3（rs=0.506）、CCL7（rs=0.559）、CCL8（rs=0.439）和CCL18（rs=0.464）］和趨化因子受體 ［C-X-C 基序趨化因子受體（CXCR）1（rs=0.680）、CXCR2（rs=0.615）、C-C 基序趨化因子受體（CCR）1（rs=0.423）、CCR2（rs=0.216）、CCR3（rs=0.429）和CCR8（rs=0.187）］之間均存在正相關關系（P<0.05），見圖3。
圖3
示MCEMP1 表達水平與免疫分子之間的相關性散點圖
a～f：免疫抑制因子，包括PDCD1LG2（a）、HAVCR2（b）、CD274（c）、IL-10（d）、CSF1R（e）、IL-10RB（f）；g～l：免疫刺激因子，包括CD80（g）、CD86（h）、CD276（i）、IL-2RA（j）、TNFSF4（k）、IL-6（l）；m～r：趨化因子，包括CCL3（m）、CCL7（n）、CCL8（o）、CCL18（p）、CXCL1（q）、CXCL8（r）；s～x：趨化因子受體，包括CCR1（s）、CCR2（t）、CCR3（u）、CCR8（v）、CXCR1（w）、CXCR2（x）
3 討論
大量證據表明，TME在腫瘤發生、發展及臨床治療療效中起著至關重要的作用，腫瘤細胞可以通過分泌各種細胞因子、趨化因子和其他因子來重塑微環境[10-12]。另外，已經進行了一些研究來剖析胃癌中TME的特征[13-14]。探索TME中各類細胞的潛在機制可能是一種有前景的策略，可能為胃癌的治療提供新的選擇[15]。本研究基于胃癌樣本的轉錄組學數據分析免疫和基質細胞的組分，然后提取DGEs，利用DEGs蛋白質互作網絡分析及單因素Cox比例風險回歸分析篩選出關鍵基因MCEMP1。MCEMP1（也被稱為CR19ORF59）是肥大細胞表達的一種跨膜蛋白，其C末端暴露于細胞膜外，而N末端分布在細胞質。肥大細胞表面的跨膜蛋白與周圍組織中的細胞接觸，從而介導其周圍環境的信號調節[16]。目前研究認為，MCEMP1參與調節肥大細胞分化及相關免疫反應機制[16-17]。肥大細胞在調節急性和慢性炎癥反應、微環境的重建等過程發揮重要作用[18]，而慢性炎癥又是癌癥發生的重要原因[19-20]。腫瘤中浸潤的肥大細胞有利于腫瘤細胞的增殖和侵襲，也可以間接通過重塑TME和調節腫瘤細胞的免疫應答來加速腫瘤的進展[21]。肥大細胞通過釋放經典的促血管生成因子，包括血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子2（FGF-2）、血小板衍生生長因子（PDGF）和白介素6（IL-6），以及非經典的促血管生成因子（主要是蛋白酶，包括類胰蛋白酶和糜酶），從而積極地促進血管生成并誘導新血管形成[22-23]。這些均提示MCEMP1可能與腫瘤的發生、進展及腫瘤免疫密切相關。
正如大量資料報道，免疫細胞可以誘導胃癌免疫微環境的重塑，進而影響胃癌患者的預后[24-26]。基于CIBERSORT算法、差異分析及相關性分析的結果表明，MCEMP1與腫瘤免疫細胞浸潤有關，其中巨噬細胞M0/M2、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、靜息NK細胞及活性肥大細胞與MCEMP1的表達水平呈正相關，而幼稚B細胞、靜息CD4記憶T細胞、CD8+T細胞、靜息肥大細胞、活性NK細胞及Tregs與MCEMP1的表達水平呈負相關。研究[27]指出，在胃癌中IL33可以激活肥大細胞及腫瘤相關巨噬細胞（TAM），從而發揮促腫瘤作用。另外，肥大細胞在胃癌微環境中蓄積，并參與腫瘤新生血管形成，促進腫瘤生長和轉移[28]。TAM的常見表型M2巨噬細胞可以分泌多種細胞因子，如IL-4、IL-6、IL-10、VEGF等，發揮促腫瘤作用。胃癌患者的腫瘤區域內的肥大細胞及M2巨噬細胞的密度均增加[28-29]。這可能揭示MCEMP1的高表達有助于肥大細胞及M2巨噬細胞的免疫反應及浸潤，共同說明MCEMP1可以作用于胃癌浸潤免疫細胞的調節和募集。
NK細胞是細胞毒性淋巴細胞，參與早期防御及腫瘤免疫監視，通過與腫瘤細胞相互作用直接發揮抗腫瘤作用，也可以通過影響TME中其他免疫細胞的活性間接殺傷癌細胞[30]，這與本研究的結果一致。腫瘤中浸潤的Treg可以抑制腫瘤相關的樹突狀細胞的免疫活性，在免疫逃逸中起關鍵作用，以促進胃癌的免疫耐受性[31]。而本研究發現MCEMP1的表達水平與Treg的浸潤水平呈負相關。研究報道Treg的募集隨著腫瘤進展而降低，說明TME中的Treg是動態分布的[32]。消化系統中Th17細胞和Treg之間的平衡保障了免疫系統的穩態和正常功能，但TME可能會擾亂二者之間的平衡[31]。Th17細胞可以驅動抗腫瘤免疫反應[33-34]，因此筆者推測在胃癌的發展中MCEMP1的表達可能與Treg之間的相關性會減弱，與Th17細胞的相關性增強。通過進一步分析TISIDB數據，證實MCEMP1與胃癌中的多種免疫分子有關，可能影響TME中的免疫浸潤。這些均揭示MCEMP1與胃癌免疫浸潤密切相關，它可能通過這些免疫細胞及免疫分子參與調節胃癌的發生發展。
為了進一步了解MCEMP1在胃癌中的調控機制，本研究基于GSEA數據庫進行KEGG基因富集分析，結果表明，MCEMP1涉及的通路包括NOD樣受體信號通路、蛋白酶體、細胞因子與細胞因子受體相互作用、TLRs信號通路、胞質DNA傳感途徑、移植物抗宿主病、RIG-Ⅰ樣受體信號通路及NK細胞介導的細胞毒性途徑。TLRs信號通路參與調節廣泛的生物反應，包括腫瘤的炎癥和免疫反應；在多種腫瘤細胞中表達，在不同的腫瘤中可表現出不同的生物學功能，如TLR5在乳腺癌和胃癌中均高表達，TLR5信號傳導促進胃癌增殖[35]，但卻抑制乳腺癌的生長[36]。TLRs可能通過TME或腫瘤細胞本身的促炎反應、抗細胞凋亡、促進腫瘤細胞增殖和促纖維化信號發揮致癌作用[37]。TLRs是炎癥信號傳導的重要調節因子，其異常激活致使NF-κB信號激活和炎癥細胞因子的過度表達[38]（如IL-1β、TNF-α和IL-6），而這些炎癥細胞因子是促進胃癌、肝癌和結直腸癌發生發展的重要因素[39]。研究[40]表明，TLRs通過刺激細胞因子IL-1β和TNF-α的釋放，使靶細胞中的NF-κB信號活化。而在抗細胞凋亡途徑中，NF-κB是調控抗凋亡基因表達的最關鍵的信號，同時也抑制了促凋亡途徑。因此，TLRs誘導的NF-κB激活可以促進腫瘤細胞的存活及增殖[41]。MCEMP1的啟動子區域包含NF-κB結合基序[16]，而NF-κB是TLRs信號通路重要的環節之一，共同參與TLRs信號通路發揮促腫瘤作用。以上研究結果表明，MCEMP1過表達可能通過TLRs信號通路介導的NF-κB信號激活，進一步調節體內慢性炎癥、腫瘤細胞促炎反應、抗細胞凋亡等過程，參與胃癌的發生發展。
本研究基于生物信息學分析發現MCEMP1與胃癌發生、發展等過程密切相關，其高表達與胃癌總體生存、多種免疫浸潤細胞及免疫分子有關，有作為胃癌潛在標志物及治療靶點的可能。但本研究是基于生物信息學分析得出的結果，仍需進一步組織學或細胞學實驗進行深入探討。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：樂奇是本研究設計者和執行者，同時參與數據提取分析及論文初稿的寫作；呂坤參與結果討論與分析；王軍和姜雷參與實施研究、獲取研究經費；姚南是本研究的監督者并參與文章潤色及修改。
