引用本文： 章銳, 杜秋麗, 阮劍, 趙建國. Osteoglycin通過上調雌激素受體表達抑制Luminal型乳腺癌細胞增殖. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(12): 1580-1586. doi: 10.7507/1007-9424.202106119 復制
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，2018年乳腺癌在全球范圍內新增了200多萬病例，有20%~30%的乳腺癌患者會發生遠處轉移[1]。乳腺癌從發病機制上是一種具有多種致病因子的異質多元性疾病，基于激素受體如雌激素受體（estrogen receptor，ER）和孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體2（HER2）和Ki-67將乳腺癌患者分為不同的亞型，包括Luminal A、Luminal B、HER2過表達（HER2 3+）和三陰性乳腺癌，其中75%的患者為ER陽性[2]。ER分為膜受體與核受體，核受體又分為ERα和ERβ兩種類型。免疫組織化學染色結果ER陽性常指ERα陽性[3]。ERα陽性的乳腺癌常表現為良好的分化和較好的預后，沉默ERα可導致Luminal型乳腺癌細胞的形態學變化，促使其運動性和侵襲性增強，從而促進乳腺癌細胞轉移，同時可導致內分泌治療抗藥性[3]。內分泌治療藥物可通過拮抗配體與ERα的結合（他莫昔芬和其他選擇性ER調節劑）[4]和調節ER（氟維司群）或阻斷雌激素的生物合成（芳香化酶抑制）發揮作用。但是由于ER的突變或ER表達下調，內分泌藥物治療的緩解率只能達到35%~70%，ERα的表達是Luminal型乳腺癌對內分泌藥物治療敏感性的關鍵[5]。Osteoglycin（OGN）是富含亮氨酸低分子蛋白聚糖的家族成員[6-7]，在多種類型的惡性腫瘤中均呈低表達，具有抑癌作用[8]。本課題組一直在以OGN基因為中心進行乳腺癌表觀遺傳學方面的研究，發現OGN抑制乳腺癌的增殖、侵襲，參與了乳腺癌的發生發展[9-10]，但是OGN在Luminal型乳腺癌中的作用尚不清楚，OGN基因能否調控Luminal型乳腺癌ER表達尚不清楚。因此，本研究通過干擾Luminal型乳腺癌細胞的OGN表達，以探討Luminal型乳腺癌細胞中OGN介導ER的表達和腫瘤的發生發展情況。
1 材料與方法
1.1 主要研究對象
1.1.1 臨床乳腺癌組織
收集2020年3月至2020年12月期間在武漢市第一醫院甲狀腺乳腺外科手術治療的Luminal型（ER陽性）乳腺癌患者的組織標本，取癌組織和癌旁乳腺組織共30對，將組織標本浸入RNAlater溶液于4 ℃過夜，然后在–80 ℃保存。所有患者都簽署了知情同意書，同時武漢市第一醫院倫理委員會批準對腫瘤組織進行研究。
1.1.2 細胞系
Luminal型乳腺癌細胞系MCF-7和T47D來自中國科學院武漢大學細胞庫。采用添加了100 U/mL青霉素/鏈霉素（Invitrogen公司）和10%胎牛血清（Gibco公司）的高糖DMEM培養液于37 ℃、5% CO 2的培養箱中培養MCF-7和T47D細胞。實驗細胞傳代在30代之內。① MCF-7和T47D細胞在6孔板中生長至接近70%～80%的融合度時，使用含有2.0 μg空載體質粒（pENTER，Ctrl組）或OGN質粒（OE-OGN組，NM_014057，維真生物，山東）的HP（Thermo Scientific）轉染。48 h后收集轉染后的細胞用于隨后的實驗。② 過表達OGN的MCF-7和T47D細胞在6孔板中生長至接近70%～80%的融合度時，針對ESR1（ER的mRNA）的特異性小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）設計及轉染。從山東維真生物有限公司購買2條針對ESR1（ER）的siRNA1和siRNA2，siRNA1的上游引物為5′-GGGCUCUACUUCAUCGCAUTT-3′，下游引物為 5′-AUGCGAUGAAGUAGAGCCCTT-3′；siRNA2的上游引物為5′-GGAUUUGACCCUCCAUGAUTT-3′，下游引物為5′-UUGUGUUUCAACAUUCUCCTT-3′ [11]。每孔加入DMEM稀釋好的Lipofectamin2000和適量ESR1特異性siRNA（轉染濃度為50 nmol/L），未轉染ESR1特異性siRNA的細胞為OE-OGN-NC組，轉染ESR1 siRNA1的細胞為OE-OGN+siRNA1組，轉染ESR1 siRNA2的細胞為OE-OGN+siRNA2組，48 h后收集各組細胞并用于隨后的實驗。
1.1.3 在線數據庫數據
使用 Ualcan（
1.2 方法
1.2.1 實時定量PCR（qRT-PCR）法檢測組織或細胞中OGN、ER mRNA表達情況
采用Trizol試劑盒提取組織或細胞總RNA，以GAPDH作為內參，qRT-PCR引物序列見表1。然后使用SYBR Green qPCR Mix（Toyobo，中國上海）檢測OGN、ER mRNA表達情況，OGN和ER相對于GAPDH的表達使用2–ΔΔCt法計算和標準化。qRT-PCR和數據收集基于CFX96平臺（Bio-Rad）。
表1
qRT-PCR引物序列
1.2.2 Western blot檢測細胞中OGN和ER蛋白表達情況
細胞裂解液RIPA（Thermo Scientific）提取各組細胞蛋白，測定濃度后，使用30 μg細胞蛋白在10%的 SDS-PAGE中進行電泳，將蛋白電轉到PVDF膜上。封閉后分別加入一抗抗體：兔抗GAPDH蛋白單抗（1∶1 000）、兔抗α-tubulin蛋白單抗（1∶800）、兔抗OGN蛋白單抗（1∶800）、兔抗ERα蛋白單抗（1∶800），這些抗體均來自Proteintech（武漢）。將膜與物種匹配的HRP二抗孵育1 h。ECL（Thermo Scientific）顯影進行定性分析。
1.2.3 CCK8法細胞增殖實驗和克隆形成實驗
① CCK8法：轉染48 h后，將約3 000個MCF-7或T47D細胞重懸于90 μL DMEM并置于96孔板中，于37 ℃、5% CO2 培養箱中培養。使用酶標儀在24 h至96 h內測量450 nm處的吸光度值（A 值），計算不同處理組細胞的增殖率，復孔取均數進行分析。CCK8法增殖實驗分別比較2組之間24、48、72、96 h的 A 值。②克隆形成實驗：將1 000個細胞鋪在6孔板中并培養大約2周。將細胞在室溫下固定在4%多聚甲醛溶液中10～15 min，然后在室溫下用0.5%結晶紫（Servicebio，武漢）染色10~15 min，然后計數細胞克隆數。不同分組設置復孔（n=6）。
1.3 統計學方法
采用SPSS 22.0和GraphPad 8.0完成統計分析及處理。計數資料以“例（%）”的形式呈現，行配對卡方檢驗。計量資料經正態分布檢驗不符合正態分布者采用Wilcoxon 秩和檢驗，符合正態分布者2組間比較采用t檢驗，多組間行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 OGN在乳腺癌組織中的表達情況以及其高或低表達對乳腺癌患者預后的影響
① Ualcan在線數據庫中，正常乳腺組織114例、Luminal型乳腺癌566例、HER2過表達型56例、三陰性乳腺癌116例，OGN mRNA在不同類型乳腺癌組織中的表達均低于正常乳腺組織（P<0.001）且在Luminal型乳腺癌組織中表達最高（P<0.001），見圖1a。② 臨床病例數據中，OGN mRNA表達在Luminal型乳腺癌癌組織中低于其相應的癌旁組織（1.912±1.065比0.790±0.680，t=4.774，P=0.000 019），見圖1b。③ 通過Kaplan-Meier Plotter在線數據對預后進行分析，在所有乳腺癌患者中，OGN高表達者（938例）的預后情況優于OGN低表達者（941例），P=0.000 14，見圖1c；在Luminal型乳腺癌患者中（高表達者439例，低表達者438例）亦然，P=0.001 8，見圖1d。
圖1
示OGN在乳腺癌組織中的表達及其對乳腺癌患者預后的影響
a：Ualcan在線數據庫中OGN在不同組織中的表達情況，其中1代表正常乳腺組織（
2.2 過表達OGN后MCF-7和T47D細胞中OGN和ER表達情況以及其對增殖和克隆形成的影響
2.2.1 MCF7和T47D細胞中OGN和ER mRNA和蛋白表達情況
① qRT-PCR法檢測結果顯示，相對于轉染空載體質粒組（Ctrl組），轉染過表達OGN質粒（OE-OGN組）后，MCF-7和T47D細胞中OGN mRNA表達水平均升高（P=0.000 002、P=0.000 001），并且這2種細胞中ER mRNA表達水平也均明顯升高（P=0.001 3、P=0.003 6），見圖2a、2b。② Western blot法檢測結果也證實MCF-7和T47D細胞轉染過表達OGN質粒后OGN和ER蛋白表達均明顯增強，見圖2c–2f。
圖2
示過表達OGN后MCF-7和T47D細胞中OGN表達情況以及其對增殖和克隆形成的影響
a、b：MCF7和T47D細胞中OGN（a）和ER（b） mRNA表達情況；c–f：MCF-7和T47D細胞中OGN（c為MCF-7細胞，d為T47D細胞）和ER（e為MCF-7細胞，f為T47D細胞）蛋白表達情況，其中1代表Ctrl組、2代表OE-OGN組；g、h：MCF-7（g）和T47D（h）細胞增殖情況，與OE-OGN組相應時間點比較，*
2.2.2 CCK8檢測MCF7和T47D細胞增殖情況
相對于轉染空載體質粒組（Ctrl 組），轉染過表達 OGN 質粒（OE-OGN 組）后，MCF-7 和 T47D 細胞增殖均被抑制，見圖2g、2h。2組不同時間點比較：① MCF-7細胞，24 h時t=1.416、P=0.194，48 h時t=6.292、P<0.001，72 h時t=3.993、P=0.004，96 h時t=8.509、P<0.001）；② T47D細胞，24 h時t=1.377、P=0.206，48 h時t=10.130、P<0.001，72 h時t=12.860、P<0.001，96 h時t=10.800、P<0.001。
2.2.3 克隆形成實驗
相對于轉染空載體質粒組（Ctrl 組），轉染過表達 OGN 質粒（OE-OGN 組）后，MCF-7 和 T47D 細胞克隆數明顯減少（MCF7細胞：t=14.470，P<0.001；T47D細胞：t=5.118，P=0.006），見圖2i、2j。
2.3 siRNA瞬時轉染干擾過表達OGN的乳腺癌細胞系后對Luminal型乳腺癌細胞增殖的影響
2.3.1 MCF-7、T47D細胞中ER mRNA表達情況
① 轉染ESR1特異性siRNA1或siRNA2后，無論是MCF-7還是T47D細胞，OE-OGN+siRNA1組和OE-OGN+siRNA2組的ER mRNA相對表達水平均分別明顯低于OE-OGN-NC組（MCF-7細胞：t=7.456，P=0.002；t=23.250，P<0.001；T47D細胞：t=3.245，P=0.032；t=25.810，P<0.001），見圖3a、3b。② Western blot法檢測結果也證實，轉染ESR1特異性siRNA1或siRNA2后，OE-OGN+siRNA1組和OE-OGN+siRNA2組的ER蛋白表達水平均弱于OE-OGN-NC組，見圖3c、3d。
圖3
示siRNA瞬時轉染干擾過表達OGN的乳腺癌細胞系后通過上調ER的表達抑制Luminal型乳腺癌細胞的增殖
a、b：MCF-7（a）、T47D（b）細胞中ER mRNA表達情況；c、d：MCF-7（c）和T47D（d）細胞中ER 蛋白表達情況的定性結果；e、f：MCF-7（e）、T47D（f）細胞中各組細胞增殖情況（與OE-OGN-NC組相應時間點比較，*
2.3.2 MCF-7、T47D細胞增殖情況
轉染ESR1特異性siRNA1或siRNA2后，無論是MCF-7還是T47D細胞，從培養后第72 h開始，MCF-7細胞和T47D細胞增殖均明顯增強，見圖3e、3f。① MCF-7細胞：OE-OGN+siRNA1比OE-OGN-NC組，72 h時t=6.234、P<0.001，96 h時t=10.660、P<0.001；OE-OGN+siRNA2比OE-OGN-NC組，72 h時t=8.475、P<0.001，96 h時t=13.880、P<0.001。② T47D細胞：OE-OGN+siRNA1比OE-OGN-NC組，72 h時t=2.873、P=0.031，96 h時t=5.293、P=0.002；OE-OGN+siRNA2比OE-OGN-NC組：72 h時t=8.475、P<0.001；96 h時 t=12.540、P<0.001。
3 討論
乳腺癌發病率目前位居世界第1位，也是女性最常見的惡性腫瘤，其中Luminal型占75%[1, 12-13]，此類型患者通過內分泌藥物治療預后優于其他類型，內分泌治療藥物可通過ER發揮作用。對于ER陽性乳腺癌對內分泌藥物治療反應的關鍵在于ER表達情況，因此調控ER的表達是ER陽性乳腺癌的研究重點與熱點。
OGN在多種腫瘤中呈低表達，發揮抑癌基因的作用，OGN表達水平更高的結直腸癌具有較高生存率和較低的復發率[14-15]，其機制在于OGN通過抑制EGFR/Akt/Zeb-1軸逆轉上皮-間質轉化。在小鼠黑色素瘤細胞系中也觀察到OGN抑制腫瘤活性，過表達OGN后增加了應激觸發的細胞死亡，同時沉默OGN后減弱了細胞死亡[16]。本研究通過質粒轉染得到過表達OGN的乳腺癌細胞系，然后通過CCK8增殖和克隆形成實驗發現，上調OGN表達后，能夠抑制Luminal型乳腺癌細胞的增殖，同時發現ER表達水平也升高，而ER表達水平對Luminal型乳腺癌治療及進展起著決定性作用。
siRNA作為敲除基因下調目的基因表達的方法，常用于需要短時低表達目的基因的實驗。本研究中，在乳腺癌細胞中瞬時轉染siRNA以干擾ER的表達，結果發現，siRNA能下調被OGN所上調的ER的表達水平，并且在ER表達下調后Luminal型乳腺癌細胞的增殖較單純OGN過表達的細胞增殖更為明顯，結果進一步證實了OGN對乳腺癌細胞的抑制可能是通過上調ER的表達而發揮作用，而ER的表達又受到乳腺癌相關信號通路的影響。
ER的表達與磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）通路密切相關，超過1/3的ER陽性乳腺癌患者存在PI3K基因激活突變[17-18]，PI3K根據結構不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中Ⅰ型研究最多，其由調節亞基p85和催化亞基p110組成，p110由癌基因PIK3CA編碼，PI3K的活化是二磷酸磷脂酰肌醇被磷酸化為三磷酸磷脂酰肌醇，從而促進Akt磷酸化激活發揮效應，促使ERα突變，反過來突變的ERα又可激活PI3K/Akt信號通路，該雙向調節決定了乳腺癌的進展及對治療的反應[19]。美國食品藥品監督管理局（FDA）已于2019年5月24日批準諾華制藥的PI3K通路抑制劑阿博利布（alpelisib）與氟維司群聯用治療Luminal型、HER2陰性、PIK3CA基因變異型晚期乳腺癌，SOLAR-1臨床隨機試驗納入572例內分泌治療無效的Luminal型、HER2陰性的晚期或轉移性乳腺癌患者，發現接受阿博利布與氟維司群治療的患者中位無進展生存期明顯延長[20]。PI3K通路被PI3K抑制劑BYL719完全抑制后出現ERα表達失調是其產生耐藥性的關鍵[21]，而PI3K/Akt信號通路下游效應分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantarget of rapamycin，mTOR）的抑制劑卻能克服晚期乳腺癌對PI3K抑制劑的抗性[22-23]。ERα的表達也與mTOR復合物相關，mTOR是乳腺癌細胞中雌激素信號轉導的關鍵節點[24]。mTOR是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可作為PI3K/Akt通路的下游效應分子被激活，更重要的是，mTOR是ERα活性的關鍵激活劑，mTOR效應分子40S核糖體S6激酶1（S6K1）介導ERα Ser118、Ser167的磷酸化，而沉默mTOR可促進Forkhead box O3（FOXO3a）向細胞核轉移，從而上調ERα表達，與增強內分泌治療敏感性和克服耐藥性相關[25]。mTOR和ERα信號通路之間的這種關系為FDA批準將mTOR抑制劑（如依維莫司）與內分泌藥物聯合用于晚期ER陽性乳腺癌的治療提供了依據。在前期實驗研究[10]中發現，OGN抑制PI3K/Akt/mTOR與ER表達密切相關。
基于以上研究結果提示，Luminal型乳腺癌組織中OGN表達降低。OGN過表達可誘導ER表達上調，進而發揮抑制Luminal型乳腺癌細胞增殖的作用，并且猜想OGN的抑癌活性以及對ER表達的調控是通過其對Luminal型乳腺癌中PI3K/Akt途徑的影響而體現出來的，有待于本研究團隊通過后續實驗進行驗證。本研究可能為Luminal型乳腺癌的治療及耐藥研究提供一種新的思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：章銳參與實驗設計及實驗研究；杜秋麗及阮劍參與部分數據的統計分許；趙建國參與文章的設計、校對及修改。
倫理聲明：本研究通過了武漢市第一醫院倫理委員會審批，批文編號：【2020】IEC（A021）號。
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，2018年乳腺癌在全球范圍內新增了200多萬病例，有20%~30%的乳腺癌患者會發生遠處轉移[1]。乳腺癌從發病機制上是一種具有多種致病因子的異質多元性疾病，基于激素受體如雌激素受體（estrogen receptor，ER）和孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體2（HER2）和Ki-67將乳腺癌患者分為不同的亞型，包括Luminal A、Luminal B、HER2過表達（HER2 3+）和三陰性乳腺癌，其中75%的患者為ER陽性[2]。ER分為膜受體與核受體，核受體又分為ERα和ERβ兩種類型。免疫組織化學染色結果ER陽性常指ERα陽性[3]。ERα陽性的乳腺癌常表現為良好的分化和較好的預后，沉默ERα可導致Luminal型乳腺癌細胞的形態學變化，促使其運動性和侵襲性增強，從而促進乳腺癌細胞轉移，同時可導致內分泌治療抗藥性[3]。內分泌治療藥物可通過拮抗配體與ERα的結合（他莫昔芬和其他選擇性ER調節劑）[4]和調節ER（氟維司群）或阻斷雌激素的生物合成（芳香化酶抑制）發揮作用。但是由于ER的突變或ER表達下調，內分泌藥物治療的緩解率只能達到35%~70%，ERα的表達是Luminal型乳腺癌對內分泌藥物治療敏感性的關鍵[5]。Osteoglycin（OGN）是富含亮氨酸低分子蛋白聚糖的家族成員[6-7]，在多種類型的惡性腫瘤中均呈低表達，具有抑癌作用[8]。本課題組一直在以OGN基因為中心進行乳腺癌表觀遺傳學方面的研究，發現OGN抑制乳腺癌的增殖、侵襲，參與了乳腺癌的發生發展[9-10]，但是OGN在Luminal型乳腺癌中的作用尚不清楚，OGN基因能否調控Luminal型乳腺癌ER表達尚不清楚。因此，本研究通過干擾Luminal型乳腺癌細胞的OGN表達，以探討Luminal型乳腺癌細胞中OGN介導ER的表達和腫瘤的發生發展情況。
1 材料與方法
1.1 主要研究對象
1.1.1 臨床乳腺癌組織
收集2020年3月至2020年12月期間在武漢市第一醫院甲狀腺乳腺外科手術治療的Luminal型（ER陽性）乳腺癌患者的組織標本，取癌組織和癌旁乳腺組織共30對，將組織標本浸入RNAlater溶液于4 ℃過夜，然后在–80 ℃保存。所有患者都簽署了知情同意書，同時武漢市第一醫院倫理委員會批準對腫瘤組織進行研究。
1.1.2 細胞系
Luminal型乳腺癌細胞系MCF-7和T47D來自中國科學院武漢大學細胞庫。采用添加了100 U/mL青霉素/鏈霉素（Invitrogen公司）和10%胎牛血清（Gibco公司）的高糖DMEM培養液于37 ℃、5% CO 2的培養箱中培養MCF-7和T47D細胞。實驗細胞傳代在30代之內。① MCF-7和T47D細胞在6孔板中生長至接近70%～80%的融合度時，使用含有2.0 μg空載體質粒（pENTER，Ctrl組）或OGN質粒（OE-OGN組，NM_014057，維真生物，山東）的HP（Thermo Scientific）轉染。48 h后收集轉染后的細胞用于隨后的實驗。② 過表達OGN的MCF-7和T47D細胞在6孔板中生長至接近70%～80%的融合度時，針對ESR1（ER的mRNA）的特異性小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）設計及轉染。從山東維真生物有限公司購買2條針對ESR1（ER）的siRNA1和siRNA2，siRNA1的上游引物為5′-GGGCUCUACUUCAUCGCAUTT-3′，下游引物為 5′-AUGCGAUGAAGUAGAGCCCTT-3′；siRNA2的上游引物為5′-GGAUUUGACCCUCCAUGAUTT-3′，下游引物為5′-UUGUGUUUCAACAUUCUCCTT-3′ [11]。每孔加入DMEM稀釋好的Lipofectamin2000和適量ESR1特異性siRNA（轉染濃度為50 nmol/L），未轉染ESR1特異性siRNA的細胞為OE-OGN-NC組，轉染ESR1 siRNA1的細胞為OE-OGN+siRNA1組，轉染ESR1 siRNA2的細胞為OE-OGN+siRNA2組，48 h后收集各組細胞并用于隨后的實驗。
1.1.3 在線數據庫數據
使用 Ualcan（
1.2 方法
1.2.1 實時定量PCR（qRT-PCR）法檢測組織或細胞中OGN、ER mRNA表達情況
采用Trizol試劑盒提取組織或細胞總RNA，以GAPDH作為內參，qRT-PCR引物序列見表1。然后使用SYBR Green qPCR Mix（Toyobo，中國上海）檢測OGN、ER mRNA表達情況，OGN和ER相對于GAPDH的表達使用2–ΔΔCt法計算和標準化。qRT-PCR和數據收集基于CFX96平臺（Bio-Rad）。
表1
qRT-PCR引物序列
1.2.2 Western blot檢測細胞中OGN和ER蛋白表達情況
細胞裂解液RIPA（Thermo Scientific）提取各組細胞蛋白，測定濃度后，使用30 μg細胞蛋白在10%的 SDS-PAGE中進行電泳，將蛋白電轉到PVDF膜上。封閉后分別加入一抗抗體：兔抗GAPDH蛋白單抗（1∶1 000）、兔抗α-tubulin蛋白單抗（1∶800）、兔抗OGN蛋白單抗（1∶800）、兔抗ERα蛋白單抗（1∶800），這些抗體均來自Proteintech（武漢）。將膜與物種匹配的HRP二抗孵育1 h。ECL（Thermo Scientific）顯影進行定性分析。
1.2.3 CCK8法細胞增殖實驗和克隆形成實驗
① CCK8法：轉染48 h后，將約3 000個MCF-7或T47D細胞重懸于90 μL DMEM并置于96孔板中，于37 ℃、5% CO2 培養箱中培養。使用酶標儀在24 h至96 h內測量450 nm處的吸光度值（A 值），計算不同處理組細胞的增殖率，復孔取均數進行分析。CCK8法增殖實驗分別比較2組之間24、48、72、96 h的 A 值。②克隆形成實驗：將1 000個細胞鋪在6孔板中并培養大約2周。將細胞在室溫下固定在4%多聚甲醛溶液中10～15 min，然后在室溫下用0.5%結晶紫（Servicebio，武漢）染色10~15 min，然后計數細胞克隆數。不同分組設置復孔（n=6）。
1.3 統計學方法
采用SPSS 22.0和GraphPad 8.0完成統計分析及處理。計數資料以“例（%）”的形式呈現，行配對卡方檢驗。計量資料經正態分布檢驗不符合正態分布者采用Wilcoxon 秩和檢驗，符合正態分布者2組間比較采用t檢驗，多組間行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 OGN在乳腺癌組織中的表達情況以及其高或低表達對乳腺癌患者預后的影響
① Ualcan在線數據庫中，正常乳腺組織114例、Luminal型乳腺癌566例、HER2過表達型56例、三陰性乳腺癌116例，OGN mRNA在不同類型乳腺癌組織中的表達均低于正常乳腺組織（P<0.001）且在Luminal型乳腺癌組織中表達最高（P<0.001），見圖1a。② 臨床病例數據中，OGN mRNA表達在Luminal型乳腺癌癌組織中低于其相應的癌旁組織（1.912±1.065比0.790±0.680，t=4.774，P=0.000 019），見圖1b。③ 通過Kaplan-Meier Plotter在線數據對預后進行分析，在所有乳腺癌患者中，OGN高表達者（938例）的預后情況優于OGN低表達者（941例），P=0.000 14，見圖1c；在Luminal型乳腺癌患者中（高表達者439例，低表達者438例）亦然，P=0.001 8，見圖1d。
圖1
示OGN在乳腺癌組織中的表達及其對乳腺癌患者預后的影響
a：Ualcan在線數據庫中OGN在不同組織中的表達情況，其中1代表正常乳腺組織（
2.2 過表達OGN后MCF-7和T47D細胞中OGN和ER表達情況以及其對增殖和克隆形成的影響
2.2.1 MCF7和T47D細胞中OGN和ER mRNA和蛋白表達情況
① qRT-PCR法檢測結果顯示，相對于轉染空載體質粒組（Ctrl組），轉染過表達OGN質粒（OE-OGN組）后，MCF-7和T47D細胞中OGN mRNA表達水平均升高（P=0.000 002、P=0.000 001），并且這2種細胞中ER mRNA表達水平也均明顯升高（P=0.001 3、P=0.003 6），見圖2a、2b。② Western blot法檢測結果也證實MCF-7和T47D細胞轉染過表達OGN質粒后OGN和ER蛋白表達均明顯增強，見圖2c–2f。
圖2
示過表達OGN后MCF-7和T47D細胞中OGN表達情況以及其對增殖和克隆形成的影響
a、b：MCF7和T47D細胞中OGN（a）和ER（b） mRNA表達情況；c–f：MCF-7和T47D細胞中OGN（c為MCF-7細胞，d為T47D細胞）和ER（e為MCF-7細胞，f為T47D細胞）蛋白表達情況，其中1代表Ctrl組、2代表OE-OGN組；g、h：MCF-7（g）和T47D（h）細胞增殖情況，與OE-OGN組相應時間點比較，*
2.2.2 CCK8檢測MCF7和T47D細胞增殖情況
相對于轉染空載體質粒組（Ctrl 組），轉染過表達 OGN 質粒（OE-OGN 組）后，MCF-7 和 T47D 細胞增殖均被抑制，見圖2g、2h。2組不同時間點比較：① MCF-7細胞，24 h時t=1.416、P=0.194，48 h時t=6.292、P<0.001，72 h時t=3.993、P=0.004，96 h時t=8.509、P<0.001）；② T47D細胞，24 h時t=1.377、P=0.206，48 h時t=10.130、P<0.001，72 h時t=12.860、P<0.001，96 h時t=10.800、P<0.001。
2.2.3 克隆形成實驗
相對于轉染空載體質粒組（Ctrl 組），轉染過表達 OGN 質粒（OE-OGN 組）后，MCF-7 和 T47D 細胞克隆數明顯減少（MCF7細胞：t=14.470，P<0.001；T47D細胞：t=5.118，P=0.006），見圖2i、2j。
2.3 siRNA瞬時轉染干擾過表達OGN的乳腺癌細胞系后對Luminal型乳腺癌細胞增殖的影響
2.3.1 MCF-7、T47D細胞中ER mRNA表達情況
① 轉染ESR1特異性siRNA1或siRNA2后，無論是MCF-7還是T47D細胞，OE-OGN+siRNA1組和OE-OGN+siRNA2組的ER mRNA相對表達水平均分別明顯低于OE-OGN-NC組（MCF-7細胞：t=7.456，P=0.002；t=23.250，P<0.001；T47D細胞：t=3.245，P=0.032；t=25.810，P<0.001），見圖3a、3b。② Western blot法檢測結果也證實，轉染ESR1特異性siRNA1或siRNA2后，OE-OGN+siRNA1組和OE-OGN+siRNA2組的ER蛋白表達水平均弱于OE-OGN-NC組，見圖3c、3d。
圖3
示siRNA瞬時轉染干擾過表達OGN的乳腺癌細胞系后通過上調ER的表達抑制Luminal型乳腺癌細胞的增殖
a、b：MCF-7（a）、T47D（b）細胞中ER mRNA表達情況；c、d：MCF-7（c）和T47D（d）細胞中ER 蛋白表達情況的定性結果；e、f：MCF-7（e）、T47D（f）細胞中各組細胞增殖情況（與OE-OGN-NC組相應時間點比較，*
2.3.2 MCF-7、T47D細胞增殖情況
轉染ESR1特異性siRNA1或siRNA2后，無論是MCF-7還是T47D細胞，從培養后第72 h開始，MCF-7細胞和T47D細胞增殖均明顯增強，見圖3e、3f。① MCF-7細胞：OE-OGN+siRNA1比OE-OGN-NC組，72 h時t=6.234、P<0.001，96 h時t=10.660、P<0.001；OE-OGN+siRNA2比OE-OGN-NC組，72 h時t=8.475、P<0.001，96 h時t=13.880、P<0.001。② T47D細胞：OE-OGN+siRNA1比OE-OGN-NC組，72 h時t=2.873、P=0.031，96 h時t=5.293、P=0.002；OE-OGN+siRNA2比OE-OGN-NC組：72 h時t=8.475、P<0.001；96 h時 t=12.540、P<0.001。
3 討論
乳腺癌發病率目前位居世界第1位，也是女性最常見的惡性腫瘤，其中Luminal型占75%[1, 12-13]，此類型患者通過內分泌藥物治療預后優于其他類型，內分泌治療藥物可通過ER發揮作用。對于ER陽性乳腺癌對內分泌藥物治療反應的關鍵在于ER表達情況，因此調控ER的表達是ER陽性乳腺癌的研究重點與熱點。
OGN在多種腫瘤中呈低表達，發揮抑癌基因的作用，OGN表達水平更高的結直腸癌具有較高生存率和較低的復發率[14-15]，其機制在于OGN通過抑制EGFR/Akt/Zeb-1軸逆轉上皮-間質轉化。在小鼠黑色素瘤細胞系中也觀察到OGN抑制腫瘤活性，過表達OGN后增加了應激觸發的細胞死亡，同時沉默OGN后減弱了細胞死亡[16]。本研究通過質粒轉染得到過表達OGN的乳腺癌細胞系，然后通過CCK8增殖和克隆形成實驗發現，上調OGN表達后，能夠抑制Luminal型乳腺癌細胞的增殖，同時發現ER表達水平也升高，而ER表達水平對Luminal型乳腺癌治療及進展起著決定性作用。
siRNA作為敲除基因下調目的基因表達的方法，常用于需要短時低表達目的基因的實驗。本研究中，在乳腺癌細胞中瞬時轉染siRNA以干擾ER的表達，結果發現，siRNA能下調被OGN所上調的ER的表達水平，并且在ER表達下調后Luminal型乳腺癌細胞的增殖較單純OGN過表達的細胞增殖更為明顯，結果進一步證實了OGN對乳腺癌細胞的抑制可能是通過上調ER的表達而發揮作用，而ER的表達又受到乳腺癌相關信號通路的影響。
ER的表達與磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）通路密切相關，超過1/3的ER陽性乳腺癌患者存在PI3K基因激活突變[17-18]，PI3K根據結構不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中Ⅰ型研究最多，其由調節亞基p85和催化亞基p110組成，p110由癌基因PIK3CA編碼，PI3K的活化是二磷酸磷脂酰肌醇被磷酸化為三磷酸磷脂酰肌醇，從而促進Akt磷酸化激活發揮效應，促使ERα突變，反過來突變的ERα又可激活PI3K/Akt信號通路，該雙向調節決定了乳腺癌的進展及對治療的反應[19]。美國食品藥品監督管理局（FDA）已于2019年5月24日批準諾華制藥的PI3K通路抑制劑阿博利布（alpelisib）與氟維司群聯用治療Luminal型、HER2陰性、PIK3CA基因變異型晚期乳腺癌，SOLAR-1臨床隨機試驗納入572例內分泌治療無效的Luminal型、HER2陰性的晚期或轉移性乳腺癌患者，發現接受阿博利布與氟維司群治療的患者中位無進展生存期明顯延長[20]。PI3K通路被PI3K抑制劑BYL719完全抑制后出現ERα表達失調是其產生耐藥性的關鍵[21]，而PI3K/Akt信號通路下游效應分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantarget of rapamycin，mTOR）的抑制劑卻能克服晚期乳腺癌對PI3K抑制劑的抗性[22-23]。ERα的表達也與mTOR復合物相關，mTOR是乳腺癌細胞中雌激素信號轉導的關鍵節點[24]。mTOR是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可作為PI3K/Akt通路的下游效應分子被激活，更重要的是，mTOR是ERα活性的關鍵激活劑，mTOR效應分子40S核糖體S6激酶1（S6K1）介導ERα Ser118、Ser167的磷酸化，而沉默mTOR可促進Forkhead box O3（FOXO3a）向細胞核轉移，從而上調ERα表達，與增強內分泌治療敏感性和克服耐藥性相關[25]。mTOR和ERα信號通路之間的這種關系為FDA批準將mTOR抑制劑（如依維莫司）與內分泌藥物聯合用于晚期ER陽性乳腺癌的治療提供了依據。在前期實驗研究[10]中發現，OGN抑制PI3K/Akt/mTOR與ER表達密切相關。
基于以上研究結果提示，Luminal型乳腺癌組織中OGN表達降低。OGN過表達可誘導ER表達上調，進而發揮抑制Luminal型乳腺癌細胞增殖的作用，并且猜想OGN的抑癌活性以及對ER表達的調控是通過其對Luminal型乳腺癌中PI3K/Akt途徑的影響而體現出來的，有待于本研究團隊通過后續實驗進行驗證。本研究可能為Luminal型乳腺癌的治療及耐藥研究提供一種新的思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：章銳參與實驗設計及實驗研究；杜秋麗及阮劍參與部分數據的統計分許；趙建國參與文章的設計、校對及修改。
倫理聲明：本研究通過了武漢市第一醫院倫理委員會審批，批文編號：【2020】IEC（A021）號。
