引用本文： 王宗樾, 張宛越, 孟凡杰, 葛萬靈, 劉傳亮, 袁青領. 甲狀腺乳頭狀癌組織 BMP4 和 Smad4 表達與臨床病理特征的相關性研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(12): 1587-1592. doi: 10.7507/1007-9424.202104025 復制
甲狀腺癌（thyroid cancer，TC）是最常見的內分泌惡性腫瘤，也是少數女性比男性更常見的腫瘤之一[1]。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是 TC 的主要類型，約占所有病例的 85% 以上，近年來通過超聲篩查發現，PTC 的年發病率顯著增加[2-3]。雖然 PTC 患者預后一般較好，但也有一部分患者發生淋巴結轉移，對全身治療沒有反應，存在對放射性碘治療的抵抗[4]。PTC 的發生受到遺傳、環境等多種因素的影響，臨床病理特征多樣，目前尚不清楚致病因子與臨床病理特征的關系，因此探究 PTC 致病因素與臨床病理特征的關系，可能有助于開發新的治療靶點。骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是轉化生長因子 β 家族成員，在維持成年神經干細胞群體、調節自我更新和分化方面發揮著重要作用[5-6]。越來越多的證據表明，BMP4 是人類腫瘤發生的調節因子，在正常生理條件下，BMP4 是一種對上皮細胞（包括甲狀腺濾泡細胞）的有效抑制劑，具有抗腫瘤增殖活性的作用[7]。Smad 同源物 4（sma and mad homologue 4，Smad4）是 BMP4 信號通路的重要效應因子，當 BMP4 配體與其受體結合，會導致 Smad1/5/8 的磷酸化，形成一個三聚體，并進一步與 Smad4 相互作用形成新的復合物，該復合物轉移至細胞核以調節 BMP4 反應基因[8]。研究[9]顯示，Smad4 基因在甲狀腺腫瘤患者中經常被異常剪接突變和失調，可能是甲狀腺腫瘤發生的早期事件。本研究通過檢測 PTC 患者癌組織及其癌旁組織中 BMP4 和 Smad4 表達情況，分析二者與 PTC 臨床病理特征的關系，期望為臨床治療 PTC 尋找新的作用靶點。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取 2018 年 3 月至 2020 年 3 月期間于平頂山市第二人民醫院接受治療并經病理學檢查證實為 PTC 的患者 80 例作為研究對象，收集 PTC 患者術中切除的癌組織及其癌旁組織，其中男 24 例，女 56 例；年齡 25～79 歲，中位年齡為 54.7 歲；伴淋巴結轉移 45 例。根據美國癌癥聯合委員會第 8 版分化型甲狀腺癌 TNM 分期[10]：Ⅰ期 26 例，Ⅱ期 15 例，Ⅲ期 21 例，Ⅳ期 18 例。
病例納入標準：① 所有病例均符合 2016 版中國《甲狀腺微小乳頭狀癌診斷與治療專家共識》診斷標準[11]；② 未經放化療等抗腫瘤治療；③ 對本研究內容知情，同意參加本次試驗；④ 臨床資料完整。排除標準：① 合并甲狀旁腺癌、肺癌等其他惡性腫瘤患者；② 合并自身免疫性疾病、肝臟疾病及腎臟疾病患者；③ 患有下丘腦、垂體功能障礙患者；④ 妊娠期女性。本研究經筆者所在醫院倫理委員會批準后實施（批文編號：20180111-1401），所有研究對象及家屬均簽署知情同意書，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。
1.2 主要試劑與儀器
Trizol 試劑（貨號 15596026，美國 Invirotrogen 公司）；反轉錄試劑盒（貨號 RP1105-50T，上海吉至生化科技有限公司）；SYBR Premix Ex Taq TM real-time PCR 試劑盒（大連 TaKaRa 公司）；BMP4 和 Smad4 兔抗人一抗及羊抗兔 IgG 二抗（貨號 ab124715、ab40759、ab6721，英國 Abcam 公司）；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（streptavidin-peroxidase linkage method，SP）試劑盒（貨號 KIT-9710，福建邁新生物技術開發有限公司）；二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（貨號 DAB002，合肥康源生物科技研究所）；實時熒光定量 PCR 儀（qRT-PCR，型號 7300 型，美國 Applied biosygtems 公司）；奧林巴斯顯微鏡（型號 BX51、TSX40086V，日本奧林巴斯株式會社）；引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成。
1.3 研究方法
1.3.1 樣品采集及保存
所有樣本均為手術中切除的新鮮組織樣本，取 50 mg 組織經 10% 甲醛固定 4～6 h，梯度脫水，組織浸蠟，石蠟包埋；剩余組織保存于–80 ℃ 冰箱備用。
1.3.2 qRT-PCR 法檢測 PTC 癌組織及其癌旁組織中 BMP4 和 Smad4 mRNA 的表達
用 Trizol 法提取新鮮 PTC 組織及其癌旁組織總 RNA，分光光度計測定總 RNA 純度及濃度，根據逆轉錄試劑盒說明將 RNA 反轉錄為 cDNA。參照 SYBR Premix Ex Taq TM 試劑盒說明書進行 qRT-PCR 反應，內參選用 GAPDH 基因，BMP4、Smad4 及 GAPDH 引物序列見表 1。反應條件為：95 ℃，10 min；40 個 PCR 循環（95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，15 s）。采用 2–ΔΔCt 方法計算 PTC 癌組織及其癌旁組織中 BMP4 及 Smad4 的 mRNA 相對表達量。
表1
qRT-PCR 引物序列
1.3.3 免疫組化法檢測 PTC 癌組織及其癌旁組織中 BMP4 和 Smad4 蛋白的表達
免疫組化 S-P 法進行染色，使用奧林巴斯 BX51 型顯微鏡閱片。結果由兩名病理醫師雙盲條件、高倍鏡（×400）下觀察腫瘤細胞，以出現黃色或棕黃色顆粒為陽性表達。陽性細胞表達百分比評分：0 分（<5%），1 分（5%～25%），2 分（25%～50%），3 分（50%～75%），4 分（>75%）；染色強度評分：0 分（無著色或著色不清），1 分（淺黃色），2 分（棕黃色），3 分（深褐色）。按照陽性細胞表達百分比和染色強度評分的乘積即染色指數（staining index，SI）作為最終結果的判定標準，SI<2 為陰性表達，SI≥2 為陽性表達。
1.4 統計學方法
應用 SPSS 22.0 進行統計學分析。計量資料進行正態分布檢驗（K-S檢驗），均符合正態分布，以均數±標準差（
±s）表示，行配對樣本 t 檢驗；計數資料或等級資料用 ［例（%）］ 表示，采用配對 χ2檢驗、成組 χ2 檢驗或非參數秩和檢驗；用 Pearson 法分析 BMP4 mRNA 與 Smad4 mRNA 表達水平的相關性。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 PTC 組織中 BMP4 mRNA 和 Smad4 mRNA 表達水平檢測結果
80 例 PTC 癌組織及其癌旁組織中 BMP4 mRNA 相對表達量分別為 0.68±0.15 和 1.05±0.19，Smad4 mRNA 的相對表達量分別為 0.42±0.09 和 1.08±0.11。癌組織中的 BMP4 mRNA 和 Smad4 mRNA 相對表達量低于癌旁組織，經配對樣本t檢驗，其差異有統計學意義（t=13.671，P<0.001；t=41.535，P<0.001）。
2.2 PTC 癌組織中 BMP4 mRNA 和 Smad4 mRNA 表達水平的相關性分析結果
Pearson 法分析結果顯示，BMP4 mRNA 與 Smad4 mRNA 表達水平呈正相關（r=0.660，P<0.05），見圖 1。
圖1
示 PTC 癌組織中 BMP4 mRNA 與 Smad4 mRNA 表達水平相關性分析的散點圖
2.3 免疫組化檢測 PTC 癌組織及其癌旁組織中 BMP4 和 Smad4 蛋白表達檢測結果
BMP4 和 Smad4 蛋白表達均定位于細胞漿，胞漿呈黃色或棕黃色染色，見圖 2。免疫組化結果顯示：PTC 癌組織中 BMP4 蛋白表達陽性率為 18.8%（15/80），低于癌旁組織的表達（97.5%，78/80），其差異有統計學意義（χ2=101.916，P<0.05）；PTC 癌組織中 Smad4 蛋白表達陽性率為 11.3%（9/80），也低于癌旁組織的表達（93.8%，75/80），其差異有統計學意義（χ2=109.173，P<0.05）。
圖2
示 BMP4 蛋白在 PTC 癌組織（a）及其癌旁組織（b）以及 Smad4 蛋白在 PTC 癌組織（c）及其癌旁組織（d）中的表達（S-P 法 ×400）
2.4 PTC 癌組織中 BMP4 及 Smad4 蛋白表達與其臨床病理特征的關系
以 SI<2 判為陰性表達，SI≥2 判為陽性表達，分別將 BMP4 和 Smad4 蛋白的表達分為陰性組和陽性組。PTC 癌組織中 BMP4 和 Smad4 蛋白的表達與腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結轉移、浸潤程度和是否為多發灶有關（P<0.05），二者的表達與患者性別、年齡和腫瘤組織學分型無關（P>0.05）。具體見表 2。
表2
80 例 PTC 患者癌組織中 BMP4 和 Smad4 蛋白表達與患者臨床病理特征的關系（例）
3 討論
PTC 是世界上發病率增長迅速的惡性腫瘤，也是 TC 最常見的組織學類型，可發生在任何年齡段，雖然大多數患者預后良好，但仍有部分患者術后因癌復發、轉移而死亡[12]。PTC 通常在患者生命的第 30～50 年被發現，平均年齡為 40 歲。PTC 的發病率隨著年齡的增長而增加，女性比男性更容易患病[13]。盡管 PTC 通常可以通過外科甲狀腺切除術來緩解和治愈，但是一部分未被及時診斷的患者，會逐漸發展到晚期，出現肺部等遠處轉移，是導致患者死亡的重要原因。研究[14]發現，在 20%～90% 的患者中，PTC 淋巴結轉移很常見，且淋巴結轉移與復發有關，可能影響 PTC 患者尤其是老年患者的生存。因此，探究 PTC 的臨床病理特征及其發生的影響因素可能對于防治 PTC 具有重要意義。
BMP4 是轉化生長因子 β 家族的分泌型細胞因子，負責多種細胞的增殖、分化、凋亡、遷移以及腫瘤的發生和發展過程，在許多腫瘤中被觀察到其異常表達[15-17]。Smad4 由 552 個氨基酸組成，分子量為 60×103，是將細胞外信號直接轉導至細胞核的一種蛋白質，也是 BMP 轉導通路的中心介質[18-20]。BMP4/Smad4 通路在早期階段起著抑癌作用，主要是通過誘導細胞周期停滯和凋亡。相反，缺少 Smad4 的細胞不能通過 BMP4 的誘導發生凋亡，結果就會出現細胞生長失控[21]。本研究發現，PTC 癌組組織中 BMP4 和 Smad4 mRNA 表達水平低于癌旁組織，提示二者可能與 PTC 的發生有關。事實上，BMP4 表達水平在腫瘤中不盡相同，如在乳腺癌中，BMP4 被證明能夠促進癌細胞的遷移和侵襲，是乳腺癌中最常見的因子之一。但有研究[22]發現，乳腺癌細胞中加入 BMP4 拮抗劑 Coco，卻增強了腫瘤細胞的肺內轉移，提高癌細胞的自我更新能力，并且在人乳腺癌細胞中敲除 Coco 基因可以阻止肺轉移。有研究[23]認為，BMP4 在腫瘤發生中具有雙重功能，在腫瘤形成的早期階段，其通過誘導細胞周期停滯和凋亡而發揮抑制作用；后來，隨著腫瘤的進展，腫瘤細胞逐漸變得對其不敏感，分泌的 BMP4 蛋白增強了腫瘤的免疫抑制作用，并促進了腫瘤血管生成、侵襲和轉移。近年的研究[24]證明，Smad4 是 BMP4 誘導的遷移和侵襲的調節因子，對 BMP4 在腫瘤發生中的功能轉換具有重要作用。本研究經 Pearson 法分析顯示，BMP4 與 Smad4 mRNA 表達水平呈正相關關系，提示二者存在正向調節，共同參與了 PTC 的發生發展過程。進一步經免疫組化檢測發現，BMP4 和 Smad4 蛋白表達均呈胞漿染色，PTC 癌組織中的 BMP4 和 Smad4 蛋白表達陽性率均低于癌旁組織，亦提示二者在 PTC 的致病進程中具有協同作用，可能共同導致 PTC 的發生。Eckhardt 等[25]的研究提示，靶向 BMP4-Smad7 信號軸對治療轉移性乳腺癌有幫助。本研究進一步分析發現，PTC 患者癌組織中 BMP4 和 Smad4 蛋白表達與腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結轉移、浸潤程度以及是否為多發灶有關，未發現二者的表達與患者性別和年齡有關。提示二者可能與 PTC 的發生發展及腫瘤細胞的侵襲、轉移有關，可能作為新的治療靶點，控制 PTC 的進展，與 Eckhardt 等[25]的研究結果相似。
綜上所述，PTC 患者癌組織中 BMP4 和 Smad4 mRNA 表達水平低于癌旁組織，二者呈正相關關系，其蛋白表達與腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結轉移等有關，可能作為治療 PTC 的新靶點。本研究只是在蛋白表達上分析了 BMP4 和 Smad4 與 PTC 臨床病理特征的關系，今后可以通過檢測二者基因的改變探究其在 PTC 中的致病作用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文不涉及任何利益沖突。
作者貢獻聲明：王宗樾、葛萬靈和劉傳亮完成研究設計、參與論文寫作；張宛越、孟凡杰和葛萬靈完成數據收集、整理并統計；袁青領參與研究指導。
倫理聲明：本研究通過了平頂山市第二人民醫院倫理委員會的審批（批文編號：20180111-1401）
甲狀腺癌（thyroid cancer，TC）是最常見的內分泌惡性腫瘤，也是少數女性比男性更常見的腫瘤之一[1]。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是 TC 的主要類型，約占所有病例的 85% 以上，近年來通過超聲篩查發現，PTC 的年發病率顯著增加[2-3]。雖然 PTC 患者預后一般較好，但也有一部分患者發生淋巴結轉移，對全身治療沒有反應，存在對放射性碘治療的抵抗[4]。PTC 的發生受到遺傳、環境等多種因素的影響，臨床病理特征多樣，目前尚不清楚致病因子與臨床病理特征的關系，因此探究 PTC 致病因素與臨床病理特征的關系，可能有助于開發新的治療靶點。骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是轉化生長因子 β 家族成員，在維持成年神經干細胞群體、調節自我更新和分化方面發揮著重要作用[5-6]。越來越多的證據表明，BMP4 是人類腫瘤發生的調節因子，在正常生理條件下，BMP4 是一種對上皮細胞（包括甲狀腺濾泡細胞）的有效抑制劑，具有抗腫瘤增殖活性的作用[7]。Smad 同源物 4（sma and mad homologue 4，Smad4）是 BMP4 信號通路的重要效應因子，當 BMP4 配體與其受體結合，會導致 Smad1/5/8 的磷酸化，形成一個三聚體，并進一步與 Smad4 相互作用形成新的復合物，該復合物轉移至細胞核以調節 BMP4 反應基因[8]。研究[9]顯示，Smad4 基因在甲狀腺腫瘤患者中經常被異常剪接突變和失調，可能是甲狀腺腫瘤發生的早期事件。本研究通過檢測 PTC 患者癌組織及其癌旁組織中 BMP4 和 Smad4 表達情況，分析二者與 PTC 臨床病理特征的關系，期望為臨床治療 PTC 尋找新的作用靶點。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取 2018 年 3 月至 2020 年 3 月期間于平頂山市第二人民醫院接受治療并經病理學檢查證實為 PTC 的患者 80 例作為研究對象，收集 PTC 患者術中切除的癌組織及其癌旁組織，其中男 24 例，女 56 例；年齡 25～79 歲，中位年齡為 54.7 歲；伴淋巴結轉移 45 例。根據美國癌癥聯合委員會第 8 版分化型甲狀腺癌 TNM 分期[10]：Ⅰ期 26 例，Ⅱ期 15 例，Ⅲ期 21 例，Ⅳ期 18 例。
病例納入標準：① 所有病例均符合 2016 版中國《甲狀腺微小乳頭狀癌診斷與治療專家共識》診斷標準[11]；② 未經放化療等抗腫瘤治療；③ 對本研究內容知情，同意參加本次試驗；④ 臨床資料完整。排除標準：① 合并甲狀旁腺癌、肺癌等其他惡性腫瘤患者；② 合并自身免疫性疾病、肝臟疾病及腎臟疾病患者；③ 患有下丘腦、垂體功能障礙患者；④ 妊娠期女性。本研究經筆者所在醫院倫理委員會批準后實施（批文編號：20180111-1401），所有研究對象及家屬均簽署知情同意書，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。
1.2 主要試劑與儀器
Trizol 試劑（貨號 15596026，美國 Invirotrogen 公司）；反轉錄試劑盒（貨號 RP1105-50T，上海吉至生化科技有限公司）；SYBR Premix Ex Taq TM real-time PCR 試劑盒（大連 TaKaRa 公司）；BMP4 和 Smad4 兔抗人一抗及羊抗兔 IgG 二抗（貨號 ab124715、ab40759、ab6721，英國 Abcam 公司）；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（streptavidin-peroxidase linkage method，SP）試劑盒（貨號 KIT-9710，福建邁新生物技術開發有限公司）；二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（貨號 DAB002，合肥康源生物科技研究所）；實時熒光定量 PCR 儀（qRT-PCR，型號 7300 型，美國 Applied biosygtems 公司）；奧林巴斯顯微鏡（型號 BX51、TSX40086V，日本奧林巴斯株式會社）；引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成。
1.3 研究方法
1.3.1 樣品采集及保存
所有樣本均為手術中切除的新鮮組織樣本，取 50 mg 組織經 10% 甲醛固定 4～6 h，梯度脫水，組織浸蠟，石蠟包埋；剩余組織保存于–80 ℃ 冰箱備用。
1.3.2 qRT-PCR 法檢測 PTC 癌組織及其癌旁組織中 BMP4 和 Smad4 mRNA 的表達
用 Trizol 法提取新鮮 PTC 組織及其癌旁組織總 RNA，分光光度計測定總 RNA 純度及濃度，根據逆轉錄試劑盒說明將 RNA 反轉錄為 cDNA。參照 SYBR Premix Ex Taq TM 試劑盒說明書進行 qRT-PCR 反應，內參選用 GAPDH 基因，BMP4、Smad4 及 GAPDH 引物序列見表 1。反應條件為：95 ℃，10 min；40 個 PCR 循環（95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，15 s）。采用 2–ΔΔCt 方法計算 PTC 癌組織及其癌旁組織中 BMP4 及 Smad4 的 mRNA 相對表達量。
表1
qRT-PCR 引物序列
1.3.3 免疫組化法檢測 PTC 癌組織及其癌旁組織中 BMP4 和 Smad4 蛋白的表達
免疫組化 S-P 法進行染色，使用奧林巴斯 BX51 型顯微鏡閱片。結果由兩名病理醫師雙盲條件、高倍鏡（×400）下觀察腫瘤細胞，以出現黃色或棕黃色顆粒為陽性表達。陽性細胞表達百分比評分：0 分（<5%），1 分（5%～25%），2 分（25%～50%），3 分（50%～75%），4 分（>75%）；染色強度評分：0 分（無著色或著色不清），1 分（淺黃色），2 分（棕黃色），3 分（深褐色）。按照陽性細胞表達百分比和染色強度評分的乘積即染色指數（staining index，SI）作為最終結果的判定標準，SI<2 為陰性表達，SI≥2 為陽性表達。
1.4 統計學方法
應用 SPSS 22.0 進行統計學分析。計量資料進行正態分布檢驗（K-S檢驗），均符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示，行配對樣本 t 檢驗；計數資料或等級資料用 ［例（%）］ 表示，采用配對 χ2檢驗、成組 χ2 檢驗或非參數秩和檢驗；用 Pearson 法分析 BMP4 mRNA 與 Smad4 mRNA 表達水平的相關性。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 PTC 組織中 BMP4 mRNA 和 Smad4 mRNA 表達水平檢測結果
80 例 PTC 癌組織及其癌旁組織中 BMP4 mRNA 相對表達量分別為 0.68±0.15 和 1.05±0.19，Smad4 mRNA 的相對表達量分別為 0.42±0.09 和 1.08±0.11。癌組織中的 BMP4 mRNA 和 Smad4 mRNA 相對表達量低于癌旁組織，經配對樣本t檢驗，其差異有統計學意義（t=13.671，P<0.001；t=41.535，P<0.001）。
2.2 PTC 癌組織中 BMP4 mRNA 和 Smad4 mRNA 表達水平的相關性分析結果
Pearson 法分析結果顯示，BMP4 mRNA 與 Smad4 mRNA 表達水平呈正相關（r=0.660，P<0.05），見圖 1。
圖1
示 PTC 癌組織中 BMP4 mRNA 與 Smad4 mRNA 表達水平相關性分析的散點圖
2.3 免疫組化檢測 PTC 癌組織及其癌旁組織中 BMP4 和 Smad4 蛋白表達檢測結果
BMP4 和 Smad4 蛋白表達均定位于細胞漿，胞漿呈黃色或棕黃色染色，見圖 2。免疫組化結果顯示：PTC 癌組織中 BMP4 蛋白表達陽性率為 18.8%（15/80），低于癌旁組織的表達（97.5%，78/80），其差異有統計學意義（χ2=101.916，P<0.05）；PTC 癌組織中 Smad4 蛋白表達陽性率為 11.3%（9/80），也低于癌旁組織的表達（93.8%，75/80），其差異有統計學意義（χ2=109.173，P<0.05）。
圖2
示 BMP4 蛋白在 PTC 癌組織（a）及其癌旁組織（b）以及 Smad4 蛋白在 PTC 癌組織（c）及其癌旁組織（d）中的表達（S-P 法 ×400）
2.4 PTC 癌組織中 BMP4 及 Smad4 蛋白表達與其臨床病理特征的關系
以 SI<2 判為陰性表達，SI≥2 判為陽性表達，分別將 BMP4 和 Smad4 蛋白的表達分為陰性組和陽性組。PTC 癌組織中 BMP4 和 Smad4 蛋白的表達與腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結轉移、浸潤程度和是否為多發灶有關（P<0.05），二者的表達與患者性別、年齡和腫瘤組織學分型無關（P>0.05）。具體見表 2。
表2
80 例 PTC 患者癌組織中 BMP4 和 Smad4 蛋白表達與患者臨床病理特征的關系（例）
3 討論
PTC 是世界上發病率增長迅速的惡性腫瘤，也是 TC 最常見的組織學類型，可發生在任何年齡段，雖然大多數患者預后良好，但仍有部分患者術后因癌復發、轉移而死亡[12]。PTC 通常在患者生命的第 30～50 年被發現，平均年齡為 40 歲。PTC 的發病率隨著年齡的增長而增加，女性比男性更容易患病[13]。盡管 PTC 通常可以通過外科甲狀腺切除術來緩解和治愈，但是一部分未被及時診斷的患者，會逐漸發展到晚期，出現肺部等遠處轉移，是導致患者死亡的重要原因。研究[14]發現，在 20%～90% 的患者中，PTC 淋巴結轉移很常見，且淋巴結轉移與復發有關，可能影響 PTC 患者尤其是老年患者的生存。因此，探究 PTC 的臨床病理特征及其發生的影響因素可能對于防治 PTC 具有重要意義。
BMP4 是轉化生長因子 β 家族的分泌型細胞因子，負責多種細胞的增殖、分化、凋亡、遷移以及腫瘤的發生和發展過程，在許多腫瘤中被觀察到其異常表達[15-17]。Smad4 由 552 個氨基酸組成，分子量為 60×103，是將細胞外信號直接轉導至細胞核的一種蛋白質，也是 BMP 轉導通路的中心介質[18-20]。BMP4/Smad4 通路在早期階段起著抑癌作用，主要是通過誘導細胞周期停滯和凋亡。相反，缺少 Smad4 的細胞不能通過 BMP4 的誘導發生凋亡，結果就會出現細胞生長失控[21]。本研究發現，PTC 癌組組織中 BMP4 和 Smad4 mRNA 表達水平低于癌旁組織，提示二者可能與 PTC 的發生有關。事實上，BMP4 表達水平在腫瘤中不盡相同，如在乳腺癌中，BMP4 被證明能夠促進癌細胞的遷移和侵襲，是乳腺癌中最常見的因子之一。但有研究[22]發現，乳腺癌細胞中加入 BMP4 拮抗劑 Coco，卻增強了腫瘤細胞的肺內轉移，提高癌細胞的自我更新能力，并且在人乳腺癌細胞中敲除 Coco 基因可以阻止肺轉移。有研究[23]認為，BMP4 在腫瘤發生中具有雙重功能，在腫瘤形成的早期階段，其通過誘導細胞周期停滯和凋亡而發揮抑制作用；后來，隨著腫瘤的進展，腫瘤細胞逐漸變得對其不敏感，分泌的 BMP4 蛋白增強了腫瘤的免疫抑制作用，并促進了腫瘤血管生成、侵襲和轉移。近年的研究[24]證明，Smad4 是 BMP4 誘導的遷移和侵襲的調節因子，對 BMP4 在腫瘤發生中的功能轉換具有重要作用。本研究經 Pearson 法分析顯示，BMP4 與 Smad4 mRNA 表達水平呈正相關關系，提示二者存在正向調節，共同參與了 PTC 的發生發展過程。進一步經免疫組化檢測發現，BMP4 和 Smad4 蛋白表達均呈胞漿染色，PTC 癌組織中的 BMP4 和 Smad4 蛋白表達陽性率均低于癌旁組織，亦提示二者在 PTC 的致病進程中具有協同作用，可能共同導致 PTC 的發生。Eckhardt 等[25]的研究提示，靶向 BMP4-Smad7 信號軸對治療轉移性乳腺癌有幫助。本研究進一步分析發現，PTC 患者癌組織中 BMP4 和 Smad4 蛋白表達與腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結轉移、浸潤程度以及是否為多發灶有關，未發現二者的表達與患者性別和年齡有關。提示二者可能與 PTC 的發生發展及腫瘤細胞的侵襲、轉移有關，可能作為新的治療靶點，控制 PTC 的進展，與 Eckhardt 等[25]的研究結果相似。
綜上所述，PTC 患者癌組織中 BMP4 和 Smad4 mRNA 表達水平低于癌旁組織，二者呈正相關關系，其蛋白表達與腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結轉移等有關，可能作為治療 PTC 的新靶點。本研究只是在蛋白表達上分析了 BMP4 和 Smad4 與 PTC 臨床病理特征的關系，今后可以通過檢測二者基因的改變探究其在 PTC 中的致病作用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文不涉及任何利益沖突。
作者貢獻聲明：王宗樾、葛萬靈和劉傳亮完成研究設計、參與論文寫作；張宛越、孟凡杰和葛萬靈完成數據收集、整理并統計；袁青領參與研究指導。
倫理聲明：本研究通過了平頂山市第二人民醫院倫理委員會的審批（批文編號：20180111-1401）
