引用本文： 努爾麥麥提·葉爾遜, 白潔. 長鏈非編碼RNA MACC1-AS1調控AKT/mTOR通路介導胃癌順鉑耐藥的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(4): 458-464. doi: 10.7507/1007-9424.202106074 復制
胃癌是消化系統常見惡性腫瘤之一，近年來胃癌發病率逐年升高，很多患者確診時已出現淋巴結轉移或遠處轉移，失去最佳治療時機[1]。化學治療（以下簡稱化療）是晚期胃癌最重要的治療方法，但腫瘤容易出現耐藥，因此如何提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性成為研究的熱點。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類內源性非編碼RNA，在腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移及耐藥中發揮重要作用[2-4]。結腸癌相關轉移基因1（metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1）屬于MACC1 mRNA的反義RNA（MACC1-antisense RNA，MACC1-AS1），在多種腫瘤組織中高表達，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲等[5-7]，但MACC1-AS1與胃癌化療藥物抵抗的關系鮮有文獻報道。He等[8]研究發現，MACC1-AS1可促進胃癌細胞的耐藥，但具體機制尚不清楚。基于此，本研究探討了MACC1-AS1對人胃癌細胞順鉑耐藥性的影響及其可能機制，希望為逆轉胃癌的耐藥提供靶點。
1 材料和方法
1.1 主要試劑、細胞株及儀器
主要包括人胃癌BGC823細胞株（上海生命科學研究所）；RPMI 1640培養液和Trizol（江蘇寶萊生物科技有限公司）；胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)和胰蛋白酶（上海昱都生物科技有限公司）；引物序列和si-MACC1-AS1、si-NC、pcDNA-MACC1-AS1及pcDNA-NC質粒（上海吉康生物科技有限公司）；順鉑（北京博爾邁生物技術有限公司）；兔抗人B淋巴細胞瘤-2（B lymphocytoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、磷酸化 mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、磷酸化 AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）及肌動蛋白（β-actin）多克隆一抗和鼠抗兔單克隆二抗（Sigma公司，美國）；RNA提取試劑盒及轉染試劑盒（武漢博士德生物公司）；熒光素酶檢測試劑盒（BioVision公司，美國）；碘化丙啶（propidium iodide，PI）和CCK-8試劑盒（武漢博士德生物公司）；PCR試劑盒（大連寶生物有限公司）；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（twelve sodium sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及轉移裝置（上海優寧維生物科技股份有限公司）；LAS400凝膠成像系統（GE公司，美國）；ABI 7900 PCR擴增儀和FACS流式細胞儀（上海儀電分析儀器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養、轉染和分組
使用RPMI 1640培養基（10%胎牛血清、10×104 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素），于37 ℃、5% CO2飽和濕度的保溫箱培養細胞，定期更換培養基；逐步遞增順鉑濃度誘導順鉑耐藥胃癌細胞。取對數生長期的BGC823細胞，用0.05 μg/mL濃度的順鉑培養細胞，然后逐步遞增順鉑濃度繼續培養存活細胞，直到BGC823細胞在順鉑濃度為2 μg/mL的培養基中可穩定傳代培養，將該細胞命名為順鉑耐藥胃癌細胞（BGC823/DDP）。然后選取BGC823/DDP細胞進行轉染，分為陰性對照組（si-NC組，轉染si-NC空質粒）和MACC1-AS1基因沉默組（si-MACC1-AS1組，轉染si-MACC1-AS1質粒）。另選取BGC823細胞進行轉染，分為陽性對照組（pcDNA-NC組，轉染pcDNA-NC空質粒）和MACC1-AS1基因過表達組（pcDNA-MACC1-AS1組，轉染pcDNA-MACC1-AS1質粒）；未做任何處理的BGC823/DDP細胞及BGC823細胞作為空白對照組，分別定義為BGC823/DDP空白對照組和BGC823空白對照組。轉染的細胞繼續培養，用于后續實驗。
1.2.2 采用MTT法檢測細胞增殖抑制
采用MTT法檢測si-NC組、si-MACC1-AS1組、pcDNA-NC組和pcDNA-MACC1-AS1組的細胞增殖抑制情況并計算順鉑對細胞的半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）。分別取上述4 組的細胞1×105個/mL用10 μg/mL濃度的順鉑培養48 h，然后胰酶消化接種至96孔板繼續培養，每組設3個復孔。分別在培養至24、36和48 h時加入10 μL的 CCK-8試劑，2 h后于450 nm處檢測吸光度（absorbance，A）值，計算細胞生長抑制率，生長抑制率=（1–轉染組A450 nm值/空白對照組A450 nm值）×100%。取對數生長期的各組細胞1×105個/mL，分別用0、5、10、15、20和 25 μg/mL的順鉑培養細胞48 h，每組設3個復孔，于450 nm處檢測A值，通過Graphpad繪制函數曲線后得到順鉑對細胞的IC50。上述各實驗均重復3次。
1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡
取1.2.1中6組對數生長期的細胞1×105個/mL于完全培養基中培養48 h后收集細胞，0.25%胰酶消化，1 000 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，PBS洗滌3遍，再次1 000 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，PBS重懸，室溫培養1 h，75%乙醇固定20 min，PBS洗滌3遍，加入10 μL PI避光條件下4 ℃孵育1 h。流式細胞儀測定波長488 nm處的熒光強度。 流式細胞圖中第2、4象限中細胞數量為凋亡細胞數量。
1.2.4 RT-PCR檢測細胞中MACC1-AS1、Bax、Bcl-2、p-mTOR、mTOR、AKT及p-AKT的mRNA表達
分別選取對數生長期的6組細胞1×105個/mL，去培養液，PBS洗滌3遍，加入胰酶消化，1 000 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，去上清，加入TRIzol試劑1 mL提取總RNA，上機檢測RNA濃度和純度，使用TaqMan?miRNA試劑盒進行逆轉錄合成cDNA，反應體系：10 mmol/L dNTP 1.5 μL，5×PCR buffer 5 μL，反轉錄酶1 μL，加焦碳酸二乙酯（DEPC）水至25 μL。然后進行PCR擴增，反應體系：SYBR? Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL+上下游引物10 μmol/L 各1 μL，DEPC水11.5 μL，總體積25 μL。循環條件為95 ℃ 預變性10 min，然后95 ℃變性15 s、60 ℃退火60 s、68 ℃延伸30 s，共40個循環，75 ℃構建溶解曲線。2–ΔΔCt法計算目標引物mRNA的相對表達量。結果重復3次。選取U6作為內參。引物序列見表1。
表1
引物序列
1.2.5 Western blot法檢測Bax、Bcl-2、p-mTOR、mTOR、AKT及p-AKT蛋白的表達
取對數生長期的6組細胞1×105個/mL，胰酶消化，PBS清洗，加入裂解液，冰浴30 min，40 ℃ 1 500 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，去上清，超聲波破核，再次1 500 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，取上層液體10 μL待測。按照說明書檢測蛋白濃度，配膠，SDS-PAGE電泳2 h，清洗，轉膜，5%脫脂牛奶4 ℃封閉2 h，清洗，按1∶1 000分別加入Bax、Bcl-2、p-mTOR、mTOR、AKT、p-AKT及β-actin，清洗，加入二抗，孵育2 h，清洗，ECL法曝光，Image J軟件分析處理，結果用目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示各蛋白的相對表達量。
1.3 統計學方法
本實驗數據使用SPSS 11.0軟件分析。基于偏度和峰度檢驗法對數據進行正態分布檢驗，計量資料符合正態分布時用均數±標準差（
±s）表示， 2組間樣本均數比較采用成組ｔ檢驗，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 各組細胞中MACC1-AS1 mRNA表達檢測結果
結果見圖1a。從圖1a可見，BGC823/DDP空白對照組細胞中MACC1-AS1 mRNA的相對表達量高于BGC823空白對照組胃癌細胞，差異具有統計學意義（P<0.01）；si-NC組與BGC823/DDP空白對照組細胞以及pcDNA-NC組與BGC823空白對照組細胞中MACC1-AS1 mRNA的相對表達量比較差異均無統計學意義（P>0.05）。si-MACC1-AS1組細胞中MACC1-AS1 mRNA的相對表達量低于si-NC組（P<0.001），pcDNA-MACC1-AS1組細胞中MACC1-AS1 mRNA的相對表達量高于pcDNA-NC組（P<0.000 1），提示轉染成功。
圖1
示各組細胞中MACC1-AS1 mRNA的相對表達量（a）、細胞抑制率（b）和細胞IC50
2.2 各組細胞的抑制率和IC50檢測結果
本研究檢測了si-NC組、si-MACC1-AS1組、pcDNA-NC組和pcDNA-MACC1-AS1組細胞的抑制情況和IC50，結果見圖1b和圖1c。 由圖1b和圖1c可見，在3個時間點si-MACC1-AS1組細胞的抑制率和IC50值均高于si-NC組，差異具有統計學意義（P<0.001）；pcDNA-MACC1-AS1組細胞的抑制率和IC50值均低于pcDNA-NC組，差異具有統計學意義（P<0.001）。提示MACC1-AS1可增強胃癌細胞對順鉑的耐藥性。
2.3 各組細胞凋亡情況檢測結果
細胞凋亡率BGC823/DDP空白對照組低于BGC823空白對照組（P<0.01），si-MACC1-AS1組高于si-NC組和BGC823/DDP空白對照組，差異具有統計學意義（P<0.01），pcDNA-MACC1-AS1組低于pcDNA-NC組和BGC823空白對照組，差異具有統計學意義（P<0.01）。具體見圖2。
圖2
示各組細胞凋亡情況的流式細胞圖（a）和細胞凋亡率（b）
2.4 各組細胞中Bax、Bcl-2、p-mTOR/mTOR和p-AKT/AKT蛋白和mRNA表達水平檢測結果
pcDNA-MACC1-AS1組細胞Bcl-2 蛋白和mRNA的表達量高于pcDNA-NC組（P<0.01），pcDNA-MACC1-AS1組細胞Bax 蛋白和mRNA的表達量低于pcDNA-NC組（P<0.01）；si-MACC1-AS1組細胞Bcl-2 蛋白和mRNA的表達量低于si-NC組（P<0.01），Bax蛋白和mRNA表達量高于si-NC組（P<0.01）。具體見圖3a～3c。 pcDNA-MACC1-AS1組細胞p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR的蛋白和mRNA表達量的比值高于pcDNA-NC組（P<0.01），si-MACC1-AS1組細胞p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR的蛋白和mRNA表達量的比值低于si-NC組（P<0.01）。具體見圖3d～3f。
圖3
示各組細胞Bax、Bcl-2、p-mTOR/mTOR及p-AKT/AKT 的蛋白表達電泳圖（a、d）和相對表達量（b、e）以及mRNA表達水平（c、f）檢測結果
3 討論
胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤，化療是治療晚期胃癌最重要的方法。但耐藥性嚴重影響了患者預后[9]，因此逆腫瘤細胞的耐藥性成為腫瘤治療的關鍵。lncRNA 是一類內源性非編碼RNA，與腫瘤的惡性生物學行為、耐藥等有關[10-13]，是胃癌潛在治療靶點。
MACC1-AS1屬于MACC1 mRNA的反義RNA，Zhao等[14]研究表明，MACC1-AS1可通過腺苷酸活化蛋白激酶/Lin28通路穩定MACC1的表達，進而促進胃癌細胞的增殖、侵襲等生物學行為。另外研究結果[15]顯示，MACC1-AS1/MACC1通過調節代謝可塑性促進膠質瘤的進展。MACC1-AS1不但調控腫瘤細胞生物學行為，同時對腫瘤細胞的耐藥性也具有調控作用，如Xue等[16]研究發現，MACC1-AS1和FOXD2-AS1可調控核受體結合SET結構域蛋白2介導的食管鱗癌順鉑耐藥。目前已經發現多種lncRNA參與了胃癌細胞的耐藥[17-18]，但MACC1-AS1與胃癌細胞耐藥性的關系鮮有文獻報道。本研究發現，順鉑耐藥的胃癌細胞高表達MACC1-AS1，提示MACC1-AS1可能與胃癌順鉑耐藥性有關。本研究還發現，si-MACC1-AS1組細胞的抑制率和IC50值均高于si-NC組，pcDNA-MACC1-AS1組細胞的抑制率和IC50值均低于pcDNA-NC組（P均<0.01），說明低表達MACC1-AS1增強胃癌細胞對順鉑的敏感性，過表達MACC1-AS1增強胃癌細胞對順鉑的耐藥性，進一步證實了MACC1-AS1對胃癌順鉑耐藥性的影響。
細胞凋亡是細胞正常死亡過程，腫瘤細胞凋亡受阻是腫瘤耐藥的關鍵因素， lncRNA通過調控多種信號通路抑制腫瘤細胞的凋亡，產生耐藥。Dong等[19]研究發現，lncRNA SNHG14 可通過凋亡信號通路促進乳腺癌對曲妥珠單抗的敏感性。另外研究[20]發現，丙泊酚通過lncRNA-MALAT1/miR-30e/ATG5軸介導的細胞自噬促進胃癌對順鉑的敏感性。本研究結果顯示：與pcDNA-NC組比較，pcDNA-MACC1-AS1組胃癌細胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax蛋白表達水平下降；與si-NC組比較，si-MACC1-AS1組細胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達水平升高。該結果提示過表達MACC1-AS1抑制了胃癌細胞的凋亡。
AKT/mTOR是細胞內一條重要的信號轉導通路， p-AKT是AKT的活化形式，mTOR是p-AKT的直接下游信號分子，mTOR磷酸化后被激活，參與腫瘤細胞的凋亡、增殖和侵襲[21]，因此p-AKT和p-mTOR水平升高提示AKT/mTOR信號通路的活化。研究[22]發現，AKT/mTOR 通路的激活與化療藥物及化療耐藥有密切關系。沈二棟等[23]研究發現，衣霉素可調控AKT/mTOR 相關通路抑制人食管癌細胞凋亡，增強細胞對奧沙利鉑的敏感性。此外，胡桃醌可抑制AKT/mTOR信號通路，進而增強胃癌細胞對順鉑的敏感性[24]。本研究結果顯示，pcDNA-MACC1-AS1組細胞p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR蛋白和mRNA表達的比值高于pcDNA-NC組（P<0.01），si-MACC1-AS1組細胞p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR蛋白和mRNA表達的比值低于si-NC組（P<0.01），提示MACC1-AS1可能通過激活AKT/mTOR通路促進胃癌細胞對順鉑的耐藥。Wu等[25]研究發現， lncRNA FOXD1-AS1通過激活AKT/mTOR通路促進胃癌細胞對順鉑的耐藥。 這一結果也間接驗證了MACC1-AS1通過AKT/mTOR通路增強胃癌細胞對順鉑耐藥的結論。
本研究存在一定的局限性，本研究是體外細胞實驗，缺乏體內實驗，下一步擬將進行動物體內實驗，進一步明確MACC1-AS1在順鉑耐藥中的作用。
綜上所述，MACC1-AS1在順鉑耐藥的胃癌細胞中高表達，MACC1-AS1過表達調控AKT/mTOR通路介導的細胞凋亡增強胃癌細胞對順鉑的耐藥性，為腫瘤耐藥研究提供參考依據。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：努爾麥麥提?葉爾遜負責本課題的實驗設計、實驗操作、數據統計及文章的撰寫；白潔協助完成相關實驗及數據的收集和整理。
胃癌是消化系統常見惡性腫瘤之一，近年來胃癌發病率逐年升高，很多患者確診時已出現淋巴結轉移或遠處轉移，失去最佳治療時機[1]。化學治療（以下簡稱化療）是晚期胃癌最重要的治療方法，但腫瘤容易出現耐藥，因此如何提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性成為研究的熱點。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類內源性非編碼RNA，在腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移及耐藥中發揮重要作用[2-4]。結腸癌相關轉移基因1（metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1）屬于MACC1 mRNA的反義RNA（MACC1-antisense RNA，MACC1-AS1），在多種腫瘤組織中高表達，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲等[5-7]，但MACC1-AS1與胃癌化療藥物抵抗的關系鮮有文獻報道。He等[8]研究發現，MACC1-AS1可促進胃癌細胞的耐藥，但具體機制尚不清楚。基于此，本研究探討了MACC1-AS1對人胃癌細胞順鉑耐藥性的影響及其可能機制，希望為逆轉胃癌的耐藥提供靶點。
1 材料和方法
1.1 主要試劑、細胞株及儀器
主要包括人胃癌BGC823細胞株（上海生命科學研究所）；RPMI 1640培養液和Trizol（江蘇寶萊生物科技有限公司）；胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)和胰蛋白酶（上海昱都生物科技有限公司）；引物序列和si-MACC1-AS1、si-NC、pcDNA-MACC1-AS1及pcDNA-NC質粒（上海吉康生物科技有限公司）；順鉑（北京博爾邁生物技術有限公司）；兔抗人B淋巴細胞瘤-2（B lymphocytoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、磷酸化 mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、磷酸化 AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）及肌動蛋白（β-actin）多克隆一抗和鼠抗兔單克隆二抗（Sigma公司，美國）；RNA提取試劑盒及轉染試劑盒（武漢博士德生物公司）；熒光素酶檢測試劑盒（BioVision公司，美國）；碘化丙啶（propidium iodide，PI）和CCK-8試劑盒（武漢博士德生物公司）；PCR試劑盒（大連寶生物有限公司）；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（twelve sodium sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及轉移裝置（上海優寧維生物科技股份有限公司）；LAS400凝膠成像系統（GE公司，美國）；ABI 7900 PCR擴增儀和FACS流式細胞儀（上海儀電分析儀器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養、轉染和分組
使用RPMI 1640培養基（10%胎牛血清、10×104 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素），于37 ℃、5% CO2飽和濕度的保溫箱培養細胞，定期更換培養基；逐步遞增順鉑濃度誘導順鉑耐藥胃癌細胞。取對數生長期的BGC823細胞，用0.05 μg/mL濃度的順鉑培養細胞，然后逐步遞增順鉑濃度繼續培養存活細胞，直到BGC823細胞在順鉑濃度為2 μg/mL的培養基中可穩定傳代培養，將該細胞命名為順鉑耐藥胃癌細胞（BGC823/DDP）。然后選取BGC823/DDP細胞進行轉染，分為陰性對照組（si-NC組，轉染si-NC空質粒）和MACC1-AS1基因沉默組（si-MACC1-AS1組，轉染si-MACC1-AS1質粒）。另選取BGC823細胞進行轉染，分為陽性對照組（pcDNA-NC組，轉染pcDNA-NC空質粒）和MACC1-AS1基因過表達組（pcDNA-MACC1-AS1組，轉染pcDNA-MACC1-AS1質粒）；未做任何處理的BGC823/DDP細胞及BGC823細胞作為空白對照組，分別定義為BGC823/DDP空白對照組和BGC823空白對照組。轉染的細胞繼續培養，用于后續實驗。
1.2.2 采用MTT法檢測細胞增殖抑制
采用MTT法檢測si-NC組、si-MACC1-AS1組、pcDNA-NC組和pcDNA-MACC1-AS1組的細胞增殖抑制情況并計算順鉑對細胞的半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）。分別取上述4 組的細胞1×105個/mL用10 μg/mL濃度的順鉑培養48 h，然后胰酶消化接種至96孔板繼續培養，每組設3個復孔。分別在培養至24、36和48 h時加入10 μL的 CCK-8試劑，2 h后于450 nm處檢測吸光度（absorbance，A）值，計算細胞生長抑制率，生長抑制率=（1–轉染組A450 nm值/空白對照組A450 nm值）×100%。取對數生長期的各組細胞1×105個/mL，分別用0、5、10、15、20和 25 μg/mL的順鉑培養細胞48 h，每組設3個復孔，于450 nm處檢測A值，通過Graphpad繪制函數曲線后得到順鉑對細胞的IC50。上述各實驗均重復3次。
1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡
取1.2.1中6組對數生長期的細胞1×105個/mL于完全培養基中培養48 h后收集細胞，0.25%胰酶消化，1 000 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，PBS洗滌3遍，再次1 000 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，PBS重懸，室溫培養1 h，75%乙醇固定20 min，PBS洗滌3遍，加入10 μL PI避光條件下4 ℃孵育1 h。流式細胞儀測定波長488 nm處的熒光強度。 流式細胞圖中第2、4象限中細胞數量為凋亡細胞數量。
1.2.4 RT-PCR檢測細胞中MACC1-AS1、Bax、Bcl-2、p-mTOR、mTOR、AKT及p-AKT的mRNA表達
分別選取對數生長期的6組細胞1×105個/mL，去培養液，PBS洗滌3遍，加入胰酶消化，1 000 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，去上清，加入TRIzol試劑1 mL提取總RNA，上機檢測RNA濃度和純度，使用TaqMan?miRNA試劑盒進行逆轉錄合成cDNA，反應體系：10 mmol/L dNTP 1.5 μL，5×PCR buffer 5 μL，反轉錄酶1 μL，加焦碳酸二乙酯（DEPC）水至25 μL。然后進行PCR擴增，反應體系：SYBR? Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL+上下游引物10 μmol/L 各1 μL，DEPC水11.5 μL，總體積25 μL。循環條件為95 ℃ 預變性10 min，然后95 ℃變性15 s、60 ℃退火60 s、68 ℃延伸30 s，共40個循環，75 ℃構建溶解曲線。2–ΔΔCt法計算目標引物mRNA的相對表達量。結果重復3次。選取U6作為內參。引物序列見表1。
表1
引物序列
1.2.5 Western blot法檢測Bax、Bcl-2、p-mTOR、mTOR、AKT及p-AKT蛋白的表達
取對數生長期的6組細胞1×105個/mL，胰酶消化，PBS清洗，加入裂解液，冰浴30 min，40 ℃ 1 500 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，去上清，超聲波破核，再次1 500 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，取上層液體10 μL待測。按照說明書檢測蛋白濃度，配膠，SDS-PAGE電泳2 h，清洗，轉膜，5%脫脂牛奶4 ℃封閉2 h，清洗，按1∶1 000分別加入Bax、Bcl-2、p-mTOR、mTOR、AKT、p-AKT及β-actin，清洗，加入二抗，孵育2 h，清洗，ECL法曝光，Image J軟件分析處理，結果用目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示各蛋白的相對表達量。
1.3 統計學方法
本實驗數據使用SPSS 11.0軟件分析。基于偏度和峰度檢驗法對數據進行正態分布檢驗，計量資料符合正態分布時用均數±標準差（±s）表示， 2組間樣本均數比較采用成組ｔ檢驗，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 各組細胞中MACC1-AS1 mRNA表達檢測結果
結果見圖1a。從圖1a可見，BGC823/DDP空白對照組細胞中MACC1-AS1 mRNA的相對表達量高于BGC823空白對照組胃癌細胞，差異具有統計學意義（P<0.01）；si-NC組與BGC823/DDP空白對照組細胞以及pcDNA-NC組與BGC823空白對照組細胞中MACC1-AS1 mRNA的相對表達量比較差異均無統計學意義（P>0.05）。si-MACC1-AS1組細胞中MACC1-AS1 mRNA的相對表達量低于si-NC組（P<0.001），pcDNA-MACC1-AS1組細胞中MACC1-AS1 mRNA的相對表達量高于pcDNA-NC組（P<0.000 1），提示轉染成功。
圖1
示各組細胞中MACC1-AS1 mRNA的相對表達量（a）、細胞抑制率（b）和細胞IC50
2.2 各組細胞的抑制率和IC50檢測結果
本研究檢測了si-NC組、si-MACC1-AS1組、pcDNA-NC組和pcDNA-MACC1-AS1組細胞的抑制情況和IC50，結果見圖1b和圖1c。 由圖1b和圖1c可見，在3個時間點si-MACC1-AS1組細胞的抑制率和IC50值均高于si-NC組，差異具有統計學意義（P<0.001）；pcDNA-MACC1-AS1組細胞的抑制率和IC50值均低于pcDNA-NC組，差異具有統計學意義（P<0.001）。提示MACC1-AS1可增強胃癌細胞對順鉑的耐藥性。
2.3 各組細胞凋亡情況檢測結果
細胞凋亡率BGC823/DDP空白對照組低于BGC823空白對照組（P<0.01），si-MACC1-AS1組高于si-NC組和BGC823/DDP空白對照組，差異具有統計學意義（P<0.01），pcDNA-MACC1-AS1組低于pcDNA-NC組和BGC823空白對照組，差異具有統計學意義（P<0.01）。具體見圖2。
圖2
示各組細胞凋亡情況的流式細胞圖（a）和細胞凋亡率（b）
2.4 各組細胞中Bax、Bcl-2、p-mTOR/mTOR和p-AKT/AKT蛋白和mRNA表達水平檢測結果
pcDNA-MACC1-AS1組細胞Bcl-2 蛋白和mRNA的表達量高于pcDNA-NC組（P<0.01），pcDNA-MACC1-AS1組細胞Bax 蛋白和mRNA的表達量低于pcDNA-NC組（P<0.01）；si-MACC1-AS1組細胞Bcl-2 蛋白和mRNA的表達量低于si-NC組（P<0.01），Bax蛋白和mRNA表達量高于si-NC組（P<0.01）。具體見圖3a～3c。 pcDNA-MACC1-AS1組細胞p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR的蛋白和mRNA表達量的比值高于pcDNA-NC組（P<0.01），si-MACC1-AS1組細胞p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR的蛋白和mRNA表達量的比值低于si-NC組（P<0.01）。具體見圖3d～3f。
圖3
示各組細胞Bax、Bcl-2、p-mTOR/mTOR及p-AKT/AKT 的蛋白表達電泳圖（a、d）和相對表達量（b、e）以及mRNA表達水平（c、f）檢測結果
3 討論
胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤，化療是治療晚期胃癌最重要的方法。但耐藥性嚴重影響了患者預后[9]，因此逆腫瘤細胞的耐藥性成為腫瘤治療的關鍵。lncRNA 是一類內源性非編碼RNA，與腫瘤的惡性生物學行為、耐藥等有關[10-13]，是胃癌潛在治療靶點。
MACC1-AS1屬于MACC1 mRNA的反義RNA，Zhao等[14]研究表明，MACC1-AS1可通過腺苷酸活化蛋白激酶/Lin28通路穩定MACC1的表達，進而促進胃癌細胞的增殖、侵襲等生物學行為。另外研究結果[15]顯示，MACC1-AS1/MACC1通過調節代謝可塑性促進膠質瘤的進展。MACC1-AS1不但調控腫瘤細胞生物學行為，同時對腫瘤細胞的耐藥性也具有調控作用，如Xue等[16]研究發現，MACC1-AS1和FOXD2-AS1可調控核受體結合SET結構域蛋白2介導的食管鱗癌順鉑耐藥。目前已經發現多種lncRNA參與了胃癌細胞的耐藥[17-18]，但MACC1-AS1與胃癌細胞耐藥性的關系鮮有文獻報道。本研究發現，順鉑耐藥的胃癌細胞高表達MACC1-AS1，提示MACC1-AS1可能與胃癌順鉑耐藥性有關。本研究還發現，si-MACC1-AS1組細胞的抑制率和IC50值均高于si-NC組，pcDNA-MACC1-AS1組細胞的抑制率和IC50值均低于pcDNA-NC組（P均<0.01），說明低表達MACC1-AS1增強胃癌細胞對順鉑的敏感性，過表達MACC1-AS1增強胃癌細胞對順鉑的耐藥性，進一步證實了MACC1-AS1對胃癌順鉑耐藥性的影響。
細胞凋亡是細胞正常死亡過程，腫瘤細胞凋亡受阻是腫瘤耐藥的關鍵因素， lncRNA通過調控多種信號通路抑制腫瘤細胞的凋亡，產生耐藥。Dong等[19]研究發現，lncRNA SNHG14 可通過凋亡信號通路促進乳腺癌對曲妥珠單抗的敏感性。另外研究[20]發現，丙泊酚通過lncRNA-MALAT1/miR-30e/ATG5軸介導的細胞自噬促進胃癌對順鉑的敏感性。本研究結果顯示：與pcDNA-NC組比較，pcDNA-MACC1-AS1組胃癌細胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax蛋白表達水平下降；與si-NC組比較，si-MACC1-AS1組細胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達水平升高。該結果提示過表達MACC1-AS1抑制了胃癌細胞的凋亡。
AKT/mTOR是細胞內一條重要的信號轉導通路， p-AKT是AKT的活化形式，mTOR是p-AKT的直接下游信號分子，mTOR磷酸化后被激活，參與腫瘤細胞的凋亡、增殖和侵襲[21]，因此p-AKT和p-mTOR水平升高提示AKT/mTOR信號通路的活化。研究[22]發現，AKT/mTOR 通路的激活與化療藥物及化療耐藥有密切關系。沈二棟等[23]研究發現，衣霉素可調控AKT/mTOR 相關通路抑制人食管癌細胞凋亡，增強細胞對奧沙利鉑的敏感性。此外，胡桃醌可抑制AKT/mTOR信號通路，進而增強胃癌細胞對順鉑的敏感性[24]。本研究結果顯示，pcDNA-MACC1-AS1組細胞p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR蛋白和mRNA表達的比值高于pcDNA-NC組（P<0.01），si-MACC1-AS1組細胞p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR蛋白和mRNA表達的比值低于si-NC組（P<0.01），提示MACC1-AS1可能通過激活AKT/mTOR通路促進胃癌細胞對順鉑的耐藥。Wu等[25]研究發現， lncRNA FOXD1-AS1通過激活AKT/mTOR通路促進胃癌細胞對順鉑的耐藥。 這一結果也間接驗證了MACC1-AS1通過AKT/mTOR通路增強胃癌細胞對順鉑耐藥的結論。
本研究存在一定的局限性，本研究是體外細胞實驗，缺乏體內實驗，下一步擬將進行動物體內實驗，進一步明確MACC1-AS1在順鉑耐藥中的作用。
綜上所述，MACC1-AS1在順鉑耐藥的胃癌細胞中高表達，MACC1-AS1過表達調控AKT/mTOR通路介導的細胞凋亡增強胃癌細胞對順鉑的耐藥性，為腫瘤耐藥研究提供參考依據。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：努爾麥麥提?葉爾遜負責本課題的實驗設計、實驗操作、數據統計及文章的撰寫；白潔協助完成相關實驗及數據的收集和整理。
