引用本文： 韓志偉, 張德智, 趙玉鵬. 西地尼布抑制HIF-1α/VEGF通路對肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(2): 167-172. doi: 10.7507/1007-9424.202106004 復制
肝癌是一種常見的消化系統惡性腫瘤，嚴重威脅人們健康，其增殖速度快、轉移范圍廣以及復發率高的特點是導致肝癌患者死亡的主要原因。因此，對肝癌侵襲和轉移機制的相關研究一直是醫學科研的難點和熱點。在惡性腫瘤的生長過程中，會因其增生過快而導致局部組織缺氧，此時缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）會調節腫瘤細胞發生適應性變化[1-2]。HIF-1α是決定HIF-1活性的亞單位，在腫瘤細胞增殖、轉移、維持代謝以及新生血管生成過程中發揮重要作用[3-4]。 形成新生血管是腫瘤細胞實現侵襲和轉移的關鍵，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）則是新生血管生成的重要調節因子，能夠促進內皮細胞增殖和遷移，增加新生血管的通透性[5-6]。有研究[7-8]表明，缺氧刺激可誘導腫瘤細胞HIF-1α的表達和活化，進而上調VEGF的表達，使其在腫瘤血管生成中發揮誘導和調控作用。研究[9]報道，西地尼布（cediranib）可靶向抑制血管生成，無論是作為單一療法，還是與化學治療、免疫治療相結合，都可在卵巢癌的治療中獲得較好的療效。目前，關于西地尼布作用于肝癌細胞的相關研究較少。本研究擬通過體外細胞實驗，探討西地尼布對HIF-1α/VEGF通路的影響以及對肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用，為抗腫瘤血管生成以治療肝癌的臨床研究提供一定的理論和實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
人肝癌細胞HepG2購自上海ATCC細胞庫；4～5周齡雄性SPF級BALB/c-Nude裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2016-0011，動物使用許可證號SYXK（京）2016-0025。在實驗過程中按照動物使用的“3R”原則給予人道主義關懷，符合動物倫理學標準。本研究通過了義馬煤業集團股份有限公司總醫院醫學倫理委員會動物實驗倫理審批（批文編號：201800103）。西地尼布購自上海瀚香生物科技有限公司；氯化鈷（CoCl2）購自默克化工技術（上海）有限公司；細胞培養板和DMEM培養基購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；0.2% 胰蛋白酶溶液、噻唑藍（MTT）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；全蛋白抽提試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白質免疫印跡（western blot，WB）二抗購自上海碧云天生物技術公司；兔抗HIF-1α抗體、兔抗VEGF抗體和兔抗CD34抗體購自艾博抗（上海）貿易有限公司；免疫組織化學（簡稱免疫組化）試劑盒購自北京中山生物技術有限公司。超凈工作臺購自蘇州凈化設備公司；CO2培養箱購自日本SANYO公司；臺式高速冷凍離心機和各量程移液槍購自德國Eppendorf公司；酶標儀、電泳儀、蛋白轉膜儀和凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 實驗模型的建立及分組
實驗模型建立：取對數生長期的人肝癌HepG2細胞，胰酶消化后制成2×104個/mL的細胞懸液，接種于6孔板。向HepG2細胞中分別加入含0、50、100、200和400 μmol/L CoCl2的培養基培養24 h，以模擬腫瘤內缺氧微環境，結合各濃度CoCl2處理細胞后HIF-1α和VEGF蛋白表達的變化，最后選取200 μmol/L CoCl2培養液進行后續試驗。實驗分組：對照組，不含西地尼布的CoCl2培養液培養HepG2細胞24 h；不同濃度的西地尼布組，分別給予含1.25、2.5、5和10 μmol/L西地尼布的CoCl2培養液培養HepG2細胞24 h。
1.2.2 MTT法檢測各組HepG2細胞的增殖率
將HepG2細胞以1×105個/mL的密度接種于96孔板中培養24 h，按照1.2.1 項中的分組進行處理。以20 μL/孔的量加入MTT溶液，在培養箱中孵育4 h，吸去孔內上清液，加入150 μL/孔的DMSO，避光振蕩10 min，使用酶標儀讀取每孔細胞在570 nm處的吸光度（A）值。細胞增殖率=（實驗組A值－空白組A值）/（對照組A值－空白組A值）×100%。空白組A值表示150 μL DMSO于570 nm處的A值，以排除本底A值對結果的影響。每組均設置6個復孔。
1.2.3 動物實驗
取1×106個/mL HepG2細胞懸液0.2 mL注射于裸鼠右側腋窩皮下，清潔無菌飼養，待接種部位腫瘤生長至約5 mm × 5 mm × 5 mm大時，無菌處死裸鼠取出腫瘤，將腫瘤切成約1 mm見方的組織塊，分別接種于實驗組裸鼠右側腋窩皮下，清潔無菌飼養，待瘤塊長大約5 mm × 5 mm × 5 mm大時，按以下分組分別給予相應的處理。取24只體質量和瘤塊大小均相近的裸鼠，按隨機數字法分為4組（n=6），即對照組、西地尼布低劑量組 ［西地尼布3 mg/（kg?次）］、西地尼布中劑量組 ［西地尼布6 mg/（kg?次）］ 和西地尼布高劑量組 ［西地尼布12 mg/（kg?次）］；采用腹腔注射，給藥1次/2 d，共給藥8次；對照組注射等體積生理鹽水。隔天稱重，游標卡尺測量瘤體長徑和短徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積=1/2短徑2×長徑。
1.2.4 免疫組化標記CD34以測定腫瘤血管密度（microvessel density，MVD）
將各實驗組裸鼠處死，剝取瘤組織并進行包埋，組織切片后脫蠟，高溫修復抗原并封閉，加入稀釋的CD34抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（phos-phate buffered saline，PBS）洗滌，加入稀釋二抗孵育30 min，PBS洗滌并染色，光鏡下觀察并拍照。判斷標準：CD34被染成棕黃色，標記內皮細胞位置，由內皮細胞構成的管腔<8個紅細胞面積且無較厚平滑肌包繞即可判斷為微血管。每張切片取6個熱點區域進行微血管計數，取平均值作為MVD計數。
1.2.5 細胞免疫組化染色
取HepG2細胞以5×104個/mL的密度接種于24孔板（已預置無菌蓋玻片）培養24 h，按照1.2.1項中的分組處理細胞。棄去培養基，細胞經多聚甲醛固定和PBS洗滌后，加入HIF-1α抗體和VEGF抗體于4 ℃條件下孵育過夜，同時設立PBS為陰性對照。加入稀釋二抗孵育30 min，PBS洗滌并進行免疫組化染色，光鏡下觀察并拍照。判斷標準：HIF-1α蛋白陽性表達為細胞核和細胞漿呈棕黃色著色，VEGF蛋白陽性表達為細胞漿呈棕黃色著色。著色強度評分：無顯色計為0分，淺棕黃色計為1分，棕黃色計為2分，深棕黃色計為3分。以所有細胞的著色強度評分均值代表HIF-1α蛋白和VEGF蛋白的表達水平。
1.2.6 Transwell小室法檢測HepG2細胞的遷移和侵襲能力
按照說明書稀釋基質膠，加入到Transwell上室面底部37 ℃過夜包被，隨后用于細胞侵襲能力的檢測。無基質膠包被的Transwell小室用于細胞遷移能力的檢測。取2×104個/mL的HepG2單細胞懸液1 mL接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，按照1.2.1項中的分組處理細胞，棄去培養基并用胰蛋白酶消化細胞。3 000 r/min離心（離心半徑10 cm）10 min收集細胞并重懸為1×105個/mL的單細胞懸液，取100 μL加入到Transwell上室，Transwell下室中加入500 μL含10 %胎牛血清的細胞培養基，將其置于細胞培養箱中培養24 h 后，取出Transwell小室，擦去上室細胞后固定、染色，置于顯微鏡下觀察并記錄細胞遷移數和侵襲數。
1.3 統計學方法
采用SPSS 20.0軟件行數據統計學分析。計量資料經Shapiro-Wilk檢驗均符合正態分布，以均數±標準差（
±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，進一步2組間比較行SNK-q檢驗，種植瘤體積行雙因素重復測量方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 西地尼布對HepG2細胞增殖的影響
對照組HepG2細胞增殖率為（100.00±0.00）%，不同濃度（1.25、2.5、5 和10 μmol/L）西地尼布處理組的HepG2細胞增殖率分別為（87.96±6.42）%、（79.73±3.65）%、（62.56±6.58）%和（48.67±3.12）%，各組間比較F=115.758，P<0.001；各濃度西地尼布處理組的HepG2細胞增殖率分別與對照組比較均降低，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2 西地尼布對裸鼠種植瘤體積增長的影響
結果顯示：對照組裸鼠腫瘤體積隨接種時間延長不斷增大，同時點各西地尼布處理組裸鼠的腫瘤體積均減小（P<0.05），腫瘤生長受到抑制，且西地尼布劑量越大，抑制效果越明顯；各時點西地尼布高劑量組與西地尼布低劑量組比較差異有統計學意義（P<0.05）。且時間作用的F=2 871.183，P<0.001；時間與組別交互作用的 F=261.844，P<0.001；組別作用的 F=2 745.263，P<0.001。具體見圖1和表1。
表1
各組裸鼠種植瘤體積及MVD檢測結果（
，n=6）
圖1
示各組種植瘤體積隨時間的變化趨勢
2.3 西地尼布對腫瘤組織中血管生成的影響
結果顯示，與對照組相比，不同劑量西地尼布處理組裸鼠腫瘤組織中棕黃色染色微血管分布較稀疏，MVD計數減少（P<0.05），具體見表1和圖2。
圖2
示各組裸鼠種植瘤MVD的免疫組化檢測結果（免疫組化染色 ×100）
a：對照組； b：西地尼布低劑量組；c：西地尼布中劑量組；d：西地尼布高劑量組
2.4 西地尼布對HepG2細胞HIF-1α和VEGF蛋白表達的影響
細胞免疫組化染色結果顯示，對照組HepG2細胞HIF-1α蛋白表達呈棕黃色著色，分布于細胞核和細胞漿中，VEGF蛋白表達呈棕黃色染色，分布于細胞漿中。不同濃度（1.25、2.5、5 和10 μmol/L）西地尼布處理組的HepG2細胞中HIF-1α和VEGF蛋白的表達評分均低于對照組（P<0.05），且隨藥物濃度增加評分逐漸降低，部分濃度組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。詳見圖2和表2。
表2
各組HepG2細胞的HIF-1α和VEGF蛋白表達及其遷移和侵襲能力檢測結果（
，n=6）
2.5 西地尼布對HepG2細胞遷移和侵襲能力的影響
結果顯示，不同濃度（1.25、2.5、5 和10 μmol/L）西地尼布處理組的HepG2細胞侵襲數和遷移數均較對照組少（P<0.05），且隨藥物濃度的增加HepG2細胞侵襲數和遷移數逐漸減少，各濃度組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。具體見圖3和表2。
圖3
各組HepG2細胞HIF-1α和VEGF蛋白表達（細胞免疫組化染色 ×400）以及HepG2細胞遷移和侵襲能力檢測結果（結晶紫染色 ×200）
3 討論
肝癌是發病率與病死率均較高的一種惡性腫瘤，易復發和轉移，專家學者們針對肝癌細胞增殖及侵襲相關機制的研究正在逐年深入，以期尋找安全高效的肝癌治療策略[10-11]。
西地尼布具有廣泛的抗腫瘤作用，可抗腫瘤組織血管生成，抑制腫瘤的生長和擴散。Momeny等[12]研究發現，西地尼布可抑制前列腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移。Morikawa等[13]研究發現，在移植瘤模型中，西地尼布抑制腫瘤生長，可能作為轉移性小細胞肺癌的一個有效治療策略。本研究結果顯示，與對照組相比，不同濃度西地尼布處理組的肝癌細胞HepG2的增殖率均降低，HepG2細胞的侵襲和遷移能力降低且裸鼠移植瘤的生長體積也隨西地尼布作用濃度的增加而縮小，提示西地尼布可抑制肝癌細胞HepG2的增殖、侵襲和裸鼠移植瘤的生長。肝癌細胞在增殖發展過程中需要氧氣和營養成分的供給，當腫瘤組織增長到一定程度時，會從原發部位向鄰近組織侵犯、占領并破壞鄰近組織，即發生侵襲。侵襲使得腫瘤細胞脫離原發部位從而轉移到遠隔部位繼續增殖生長，在此過程中為了滿足向外浸潤性生長的需要，肝癌組織會在已有血管系統中生成新的血管，給腫瘤細胞提供氧氣和養分用于生長[14-15]。Melsens等[16]研究發現，在結直腸癌異種移植模型中，西地尼布可抑制VEGF誘導的血管生成，抑制腫瘤的生長。本研究發現，西地尼布作用下的裸鼠移植瘤中微血管分布明顯較對照組稀疏，與前人[16]在結直腸癌模型中的研究結果一致，提示西地尼布可抑制腫瘤組織中新生血管的生成。
研究[17-19]表明，HIF-1/VEGF通路在肝癌新生血管的形成中發揮關鍵的調控作用，促進肝癌組織的生長和轉移。HIF-1普遍存在于哺乳動物細胞內，由HIF-1α和HIF-1β組成，HIF-1α可感受缺氧并傳遞缺氧信號，調控一系列缺氧相關基因的表達，處于機體維持氧自穩平衡的核心位置[20-21]。研究[22-24]證實，在乳腺癌、膽囊癌、宮頸癌等腫瘤中均可檢測到HIF-1α/VEGF通路相關蛋白表達的上調。Guo等[25]采集肝癌患者的腫瘤組織、非腫瘤組織和血液標本，檢測到HIF-1α/VEGF通路蛋白的高表達，并且與腫瘤分期和轉移顯著相關。推測當肝癌細胞增殖過程中缺氧時，HIF-1α會與缺氧增強子堿基序列結合，啟動并增強VEGF的表達，誘導和調控血管的生成。本研究結果顯示，西地尼布作用后，肝癌細胞中HIF-1α/VEGF通路蛋白表達水平降低，提示西地尼布可抑制HIF-1α/VEGF通路的激活，結合西地尼布抑制腫瘤組織新生血管生成的實驗結果，推測西地尼布可能通過HIF-1α/VEGF信號通路調控血管生成過程，進而影響肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。
綜上所述，西地尼布可能通過抑制HIF-1α/VEGF信號通路，進而抑制肝癌組織新生血管生成，對肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲產生抑制作用。本研究結果為抗肝癌組織侵襲轉移相關研究提供了一定依據，但腫瘤轉移過程涉及多個信號通路的共同協作，明確其中機制還需更進一步的研究。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：韓志偉參與實驗設計、實驗研究并撰寫論文；張德智參與部分實驗研究及數據統計分析；趙玉鵬參與文章校對及修改。
倫理聲明：本研究已通過義馬煤業集團股份有限公司總醫院醫學倫理委員會的審核批準（批文編號：201800103）。
肝癌是一種常見的消化系統惡性腫瘤，嚴重威脅人們健康，其增殖速度快、轉移范圍廣以及復發率高的特點是導致肝癌患者死亡的主要原因。因此，對肝癌侵襲和轉移機制的相關研究一直是醫學科研的難點和熱點。在惡性腫瘤的生長過程中，會因其增生過快而導致局部組織缺氧，此時缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）會調節腫瘤細胞發生適應性變化[1-2]。HIF-1α是決定HIF-1活性的亞單位，在腫瘤細胞增殖、轉移、維持代謝以及新生血管生成過程中發揮重要作用[3-4]。 形成新生血管是腫瘤細胞實現侵襲和轉移的關鍵，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）則是新生血管生成的重要調節因子，能夠促進內皮細胞增殖和遷移，增加新生血管的通透性[5-6]。有研究[7-8]表明，缺氧刺激可誘導腫瘤細胞HIF-1α的表達和活化，進而上調VEGF的表達，使其在腫瘤血管生成中發揮誘導和調控作用。研究[9]報道，西地尼布（cediranib）可靶向抑制血管生成，無論是作為單一療法，還是與化學治療、免疫治療相結合，都可在卵巢癌的治療中獲得較好的療效。目前，關于西地尼布作用于肝癌細胞的相關研究較少。本研究擬通過體外細胞實驗，探討西地尼布對HIF-1α/VEGF通路的影響以及對肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用，為抗腫瘤血管生成以治療肝癌的臨床研究提供一定的理論和實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
人肝癌細胞HepG2購自上海ATCC細胞庫；4～5周齡雄性SPF級BALB/c-Nude裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2016-0011，動物使用許可證號SYXK（京）2016-0025。在實驗過程中按照動物使用的“3R”原則給予人道主義關懷，符合動物倫理學標準。本研究通過了義馬煤業集團股份有限公司總醫院醫學倫理委員會動物實驗倫理審批（批文編號：201800103）。西地尼布購自上海瀚香生物科技有限公司；氯化鈷（CoCl2）購自默克化工技術（上海）有限公司；細胞培養板和DMEM培養基購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；0.2% 胰蛋白酶溶液、噻唑藍（MTT）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；全蛋白抽提試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白質免疫印跡（western blot，WB）二抗購自上海碧云天生物技術公司；兔抗HIF-1α抗體、兔抗VEGF抗體和兔抗CD34抗體購自艾博抗（上海）貿易有限公司；免疫組織化學（簡稱免疫組化）試劑盒購自北京中山生物技術有限公司。超凈工作臺購自蘇州凈化設備公司；CO2培養箱購自日本SANYO公司；臺式高速冷凍離心機和各量程移液槍購自德國Eppendorf公司；酶標儀、電泳儀、蛋白轉膜儀和凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 實驗模型的建立及分組
實驗模型建立：取對數生長期的人肝癌HepG2細胞，胰酶消化后制成2×104個/mL的細胞懸液，接種于6孔板。向HepG2細胞中分別加入含0、50、100、200和400 μmol/L CoCl2的培養基培養24 h，以模擬腫瘤內缺氧微環境，結合各濃度CoCl2處理細胞后HIF-1α和VEGF蛋白表達的變化，最后選取200 μmol/L CoCl2培養液進行后續試驗。實驗分組：對照組，不含西地尼布的CoCl2培養液培養HepG2細胞24 h；不同濃度的西地尼布組，分別給予含1.25、2.5、5和10 μmol/L西地尼布的CoCl2培養液培養HepG2細胞24 h。
1.2.2 MTT法檢測各組HepG2細胞的增殖率
將HepG2細胞以1×105個/mL的密度接種于96孔板中培養24 h，按照1.2.1 項中的分組進行處理。以20 μL/孔的量加入MTT溶液，在培養箱中孵育4 h，吸去孔內上清液，加入150 μL/孔的DMSO，避光振蕩10 min，使用酶標儀讀取每孔細胞在570 nm處的吸光度（A）值。細胞增殖率=（實驗組A值－空白組A值）/（對照組A值－空白組A值）×100%。空白組A值表示150 μL DMSO于570 nm處的A值，以排除本底A值對結果的影響。每組均設置6個復孔。
1.2.3 動物實驗
取1×106個/mL HepG2細胞懸液0.2 mL注射于裸鼠右側腋窩皮下，清潔無菌飼養，待接種部位腫瘤生長至約5 mm × 5 mm × 5 mm大時，無菌處死裸鼠取出腫瘤，將腫瘤切成約1 mm見方的組織塊，分別接種于實驗組裸鼠右側腋窩皮下，清潔無菌飼養，待瘤塊長大約5 mm × 5 mm × 5 mm大時，按以下分組分別給予相應的處理。取24只體質量和瘤塊大小均相近的裸鼠，按隨機數字法分為4組（n=6），即對照組、西地尼布低劑量組 ［西地尼布3 mg/（kg?次）］、西地尼布中劑量組 ［西地尼布6 mg/（kg?次）］ 和西地尼布高劑量組 ［西地尼布12 mg/（kg?次）］；采用腹腔注射，給藥1次/2 d，共給藥8次；對照組注射等體積生理鹽水。隔天稱重，游標卡尺測量瘤體長徑和短徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積=1/2短徑2×長徑。
1.2.4 免疫組化標記CD34以測定腫瘤血管密度（microvessel density，MVD）
將各實驗組裸鼠處死，剝取瘤組織并進行包埋，組織切片后脫蠟，高溫修復抗原并封閉，加入稀釋的CD34抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（phos-phate buffered saline，PBS）洗滌，加入稀釋二抗孵育30 min，PBS洗滌并染色，光鏡下觀察并拍照。判斷標準：CD34被染成棕黃色，標記內皮細胞位置，由內皮細胞構成的管腔<8個紅細胞面積且無較厚平滑肌包繞即可判斷為微血管。每張切片取6個熱點區域進行微血管計數，取平均值作為MVD計數。
1.2.5 細胞免疫組化染色
取HepG2細胞以5×104個/mL的密度接種于24孔板（已預置無菌蓋玻片）培養24 h，按照1.2.1項中的分組處理細胞。棄去培養基，細胞經多聚甲醛固定和PBS洗滌后，加入HIF-1α抗體和VEGF抗體于4 ℃條件下孵育過夜，同時設立PBS為陰性對照。加入稀釋二抗孵育30 min，PBS洗滌并進行免疫組化染色，光鏡下觀察并拍照。判斷標準：HIF-1α蛋白陽性表達為細胞核和細胞漿呈棕黃色著色，VEGF蛋白陽性表達為細胞漿呈棕黃色著色。著色強度評分：無顯色計為0分，淺棕黃色計為1分，棕黃色計為2分，深棕黃色計為3分。以所有細胞的著色強度評分均值代表HIF-1α蛋白和VEGF蛋白的表達水平。
1.2.6 Transwell小室法檢測HepG2細胞的遷移和侵襲能力
按照說明書稀釋基質膠，加入到Transwell上室面底部37 ℃過夜包被，隨后用于細胞侵襲能力的檢測。無基質膠包被的Transwell小室用于細胞遷移能力的檢測。取2×104個/mL的HepG2單細胞懸液1 mL接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，按照1.2.1項中的分組處理細胞，棄去培養基并用胰蛋白酶消化細胞。3 000 r/min離心（離心半徑10 cm）10 min收集細胞并重懸為1×105個/mL的單細胞懸液，取100 μL加入到Transwell上室，Transwell下室中加入500 μL含10 %胎牛血清的細胞培養基，將其置于細胞培養箱中培養24 h 后，取出Transwell小室，擦去上室細胞后固定、染色，置于顯微鏡下觀察并記錄細胞遷移數和侵襲數。
1.3 統計學方法
采用SPSS 20.0軟件行數據統計學分析。計量資料經Shapiro-Wilk檢驗均符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，進一步2組間比較行SNK-q檢驗，種植瘤體積行雙因素重復測量方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 西地尼布對HepG2細胞增殖的影響
對照組HepG2細胞增殖率為（100.00±0.00）%，不同濃度（1.25、2.5、5 和10 μmol/L）西地尼布處理組的HepG2細胞增殖率分別為（87.96±6.42）%、（79.73±3.65）%、（62.56±6.58）%和（48.67±3.12）%，各組間比較F=115.758，P<0.001；各濃度西地尼布處理組的HepG2細胞增殖率分別與對照組比較均降低，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2 西地尼布對裸鼠種植瘤體積增長的影響
結果顯示：對照組裸鼠腫瘤體積隨接種時間延長不斷增大，同時點各西地尼布處理組裸鼠的腫瘤體積均減小（P<0.05），腫瘤生長受到抑制，且西地尼布劑量越大，抑制效果越明顯；各時點西地尼布高劑量組與西地尼布低劑量組比較差異有統計學意義（P<0.05）。且時間作用的F=2 871.183，P<0.001；時間與組別交互作用的 F=261.844，P<0.001；組別作用的 F=2 745.263，P<0.001。具體見圖1和表1。
表1
各組裸鼠種植瘤體積及MVD檢測結果（，n=6）
圖1
示各組種植瘤體積隨時間的變化趨勢
2.3 西地尼布對腫瘤組織中血管生成的影響
結果顯示，與對照組相比，不同劑量西地尼布處理組裸鼠腫瘤組織中棕黃色染色微血管分布較稀疏，MVD計數減少（P<0.05），具體見表1和圖2。
圖2
示各組裸鼠種植瘤MVD的免疫組化檢測結果（免疫組化染色 ×100）
a：對照組； b：西地尼布低劑量組；c：西地尼布中劑量組；d：西地尼布高劑量組
2.4 西地尼布對HepG2細胞HIF-1α和VEGF蛋白表達的影響
細胞免疫組化染色結果顯示，對照組HepG2細胞HIF-1α蛋白表達呈棕黃色著色，分布于細胞核和細胞漿中，VEGF蛋白表達呈棕黃色染色，分布于細胞漿中。不同濃度（1.25、2.5、5 和10 μmol/L）西地尼布處理組的HepG2細胞中HIF-1α和VEGF蛋白的表達評分均低于對照組（P<0.05），且隨藥物濃度增加評分逐漸降低，部分濃度組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。詳見圖2和表2。
表2
各組HepG2細胞的HIF-1α和VEGF蛋白表達及其遷移和侵襲能力檢測結果（，n=6）
2.5 西地尼布對HepG2細胞遷移和侵襲能力的影響
結果顯示，不同濃度（1.25、2.5、5 和10 μmol/L）西地尼布處理組的HepG2細胞侵襲數和遷移數均較對照組少（P<0.05），且隨藥物濃度的增加HepG2細胞侵襲數和遷移數逐漸減少，各濃度組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。具體見圖3和表2。
圖3
各組HepG2細胞HIF-1α和VEGF蛋白表達（細胞免疫組化染色 ×400）以及HepG2細胞遷移和侵襲能力檢測結果（結晶紫染色 ×200）
3 討論
肝癌是發病率與病死率均較高的一種惡性腫瘤，易復發和轉移，專家學者們針對肝癌細胞增殖及侵襲相關機制的研究正在逐年深入，以期尋找安全高效的肝癌治療策略[10-11]。
西地尼布具有廣泛的抗腫瘤作用，可抗腫瘤組織血管生成，抑制腫瘤的生長和擴散。Momeny等[12]研究發現，西地尼布可抑制前列腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移。Morikawa等[13]研究發現，在移植瘤模型中，西地尼布抑制腫瘤生長，可能作為轉移性小細胞肺癌的一個有效治療策略。本研究結果顯示，與對照組相比，不同濃度西地尼布處理組的肝癌細胞HepG2的增殖率均降低，HepG2細胞的侵襲和遷移能力降低且裸鼠移植瘤的生長體積也隨西地尼布作用濃度的增加而縮小，提示西地尼布可抑制肝癌細胞HepG2的增殖、侵襲和裸鼠移植瘤的生長。肝癌細胞在增殖發展過程中需要氧氣和營養成分的供給，當腫瘤組織增長到一定程度時，會從原發部位向鄰近組織侵犯、占領并破壞鄰近組織，即發生侵襲。侵襲使得腫瘤細胞脫離原發部位從而轉移到遠隔部位繼續增殖生長，在此過程中為了滿足向外浸潤性生長的需要，肝癌組織會在已有血管系統中生成新的血管，給腫瘤細胞提供氧氣和養分用于生長[14-15]。Melsens等[16]研究發現，在結直腸癌異種移植模型中，西地尼布可抑制VEGF誘導的血管生成，抑制腫瘤的生長。本研究發現，西地尼布作用下的裸鼠移植瘤中微血管分布明顯較對照組稀疏，與前人[16]在結直腸癌模型中的研究結果一致，提示西地尼布可抑制腫瘤組織中新生血管的生成。
研究[17-19]表明，HIF-1/VEGF通路在肝癌新生血管的形成中發揮關鍵的調控作用，促進肝癌組織的生長和轉移。HIF-1普遍存在于哺乳動物細胞內，由HIF-1α和HIF-1β組成，HIF-1α可感受缺氧并傳遞缺氧信號，調控一系列缺氧相關基因的表達，處于機體維持氧自穩平衡的核心位置[20-21]。研究[22-24]證實，在乳腺癌、膽囊癌、宮頸癌等腫瘤中均可檢測到HIF-1α/VEGF通路相關蛋白表達的上調。Guo等[25]采集肝癌患者的腫瘤組織、非腫瘤組織和血液標本，檢測到HIF-1α/VEGF通路蛋白的高表達，并且與腫瘤分期和轉移顯著相關。推測當肝癌細胞增殖過程中缺氧時，HIF-1α會與缺氧增強子堿基序列結合，啟動并增強VEGF的表達，誘導和調控血管的生成。本研究結果顯示，西地尼布作用后，肝癌細胞中HIF-1α/VEGF通路蛋白表達水平降低，提示西地尼布可抑制HIF-1α/VEGF通路的激活，結合西地尼布抑制腫瘤組織新生血管生成的實驗結果，推測西地尼布可能通過HIF-1α/VEGF信號通路調控血管生成過程，進而影響肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。
綜上所述，西地尼布可能通過抑制HIF-1α/VEGF信號通路，進而抑制肝癌組織新生血管生成，對肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲產生抑制作用。本研究結果為抗肝癌組織侵襲轉移相關研究提供了一定依據，但腫瘤轉移過程涉及多個信號通路的共同協作，明確其中機制還需更進一步的研究。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：韓志偉參與實驗設計、實驗研究并撰寫論文；張德智參與部分實驗研究及數據統計分析；趙玉鵬參與文章校對及修改。
倫理聲明：本研究已通過義馬煤業集團股份有限公司總醫院醫學倫理委員會的審核批準（批文編號：201800103）。
