引用本文： 張蘭, 徐源, 趙冰, 李軍濤. miR-92a在乳腺癌組織中表達及通過靶向調控KLF4影響乳腺癌細胞的遷移及侵襲行為. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(2): 173-178. doi: 10.7507/1007-9424.202105043 復制
乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一，發病率和病死率呈逐年上升趨勢。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為25 nt以內的內源性非編碼RNA，通過作用于靶基因，參與調控多種生理功能。miR-92a因與腫瘤的發生密切相關而受到廣泛關注，包括非小細胞肺癌、胃癌以及食管鱗癌[1-3]。鋅指蛋白轉錄因子4（kruppel-like factor 4，KLF4）是一種含鋅指修飾結構的蛋白，在多種腫瘤發生發展過程中發揮重要作用，KLF4上調促進肝癌細胞增殖、遷移和浸潤[4]。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞在某種刺激下，失去極性，喪失細胞間緊密性連接和黏附性連接，從而使細胞獲得浸潤和遷移的能力，它的激活是癌細胞獲得惡性表型的重要環節[5]。上皮鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）丟失以及神經鈣黏蛋白（N-cadherin，N-cad）表達是EMT的標志性變化。研究[6]發現，KLF4上調促進EMT過程，導致膀胱癌細胞發生EMT，遷移能力增強。但是，miR-92a是否可以通過調節KLF4逆轉EMT過程，從而抑制乳腺癌細胞增殖、浸潤和遷移，仍需進一步研究。本研究旨在探討miR-92a在乳腺癌細胞中的表達，以及是否可以通過調節KLF4逆轉EMT過程。
1 材料和方法
1.1 細胞系
人乳腺癌細胞系MCF-7購自美國ATCC公司。
1.2 標本采集
收集筆者所在醫院2017年5月至2019年10月期間122例乳腺癌患者的手術切除標本，所有患者均經組織活檢和病理學檢查確診，術前未接受過放化療，患者年齡25～65歲，中位年齡44.3歲；腫瘤直徑<5 cm患者71例，≥5 cm患者51例。 癌旁組織取自距肉眼可見腫瘤病灶至少5 cm處的組織，病理學檢查證實該組織未見腫瘤細胞。本研究征得患者同意并簽訂知情同意書，獲得鄭州大學附屬鄭州中心醫院倫理委員會的審批（批文編號：ZZZXYY20170424）。
1.3 試劑與儀器
miR-92a 模擬物（miR-92a mimic）、miR-92a拮抗劑（miR-92a inhibitor）和miRNA引物購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol試劑盒和逆轉錄試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；DMEM培養基購自美國Cibco公司；二甲基亞砜（dimethy1 sulfoxide，DMSO）購自美國Sigma公司；KLF4、E-cad、N-cad和GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司；CCK-8試劑盒購自上海貝博生物公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；酶標儀購自美國Thermo公司；熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。
1.4 qRT-PCR檢測miR-92a和KLF4 mRNA表達
取癌組織和癌旁組織置于液氮中研磨，Trizol試劑盒提取組織中總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書反轉錄出cDNA。以cDNA為模板，采用20 μL反應體系：SYBR green qPCR mix 10 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 2 μL和去離子水7.2 μL進行擴增，擴增條件為 95 ℃ 預變性5 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s，進行40個循環，72 ℃延伸10 min。miR-92a以U6為內參，KLF4以GAPDH為內參，采用2–△△CT法計算miR-92a和KLF4 mRNA相對表達水平。引物序列見表1。
表1
引物序列
1.5 細胞培養、分組和轉染
將MCF-7細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱中培養，傳至第4代后，取對數生長期的細胞用于實驗。
實驗分為對照組、模擬物-對照組、模擬物-miR-92a組、抑制劑-對照組和抑制劑-miR-92a組。取對數生長期的MCF-7細胞，制成細胞懸液，細胞密度為1×105個/mL，接種于96孔板，每孔1 mL。待細胞融合度達到80%時，按照Lipofectamine 2000說明書將模擬物或抑制劑分別轉染入對應組別的孔中，48 h后制成單細胞懸液，接種于96孔板，待細胞貼壁生長后用于以下實驗。對照組細胞僅更換新的培養基。
1.6 MTT法檢測細胞存活率
從培養箱中取出96孔板，每孔加入20 μL MTT液（5 mg/mL），孵育4 h后，棄去培養液，每孔加入200 μL DMSO，37 ℃避光孵育10 min，用酶標儀測定波長490 nm處吸光度值（A 值）。細胞存活率（%）=實驗組A值/對照組A值×100%。實驗重復5次。
1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力
從培養箱中取出96孔板，10 μL無菌槍頭均勻劃線，劃線0 h和48 h后，顯微鏡下觀察細胞修復情況，按照劃痕愈合率=（劃痕0 h的劃痕面積－劃痕后48 h的劃痕面積）/劃痕0 h的劃痕面積×100%，計算劃痕愈合率，細胞遷移能力與劃痕愈合率呈正相關。實驗重復5次。
1.8 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力
取各組MCF-7細胞以3×104個/mL的密度接種于Transwell小室表面，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，甲醛固定小室膜以下的細胞，0.2%結晶紫溶液染色10 min，顯微鏡下隨機取10個視野，并統計膜下細胞數。實驗重復 5 次。
1.9 雙熒光素酶報告基因檢測miR-92a與KLF-4的靶向關系
TargetScan軟件檢測到miR-92a和KLF4存在結合位點，將該序列片段克隆擴增，插入到熒光素酶報告基因質粒中，構建野生型KLF4報告基因質粒（KLF4-wt）和突變型KLF4報告基因質粒（KLF4-mut）。將兩種質粒分別與模擬物-miR-92a及陰性對照片段共轉染到MCF-7細胞中，共分為4組： 模擬物-對照+KLF4-wt組，模擬物-miR-92a+KLF4-wt組，模擬物-對照+KLF4-mut組以及模擬物-miR-92a+KLF4-mut組，每組設置5個復孔， 24 h后，3 000 r/min離心15 min（離心半徑8 cm），收集細胞，以熒光素酶試劑盒檢測熒光素酶活性。 結果以海腎熒光素酶的發光強度與螢火蟲熒光素酶發光強度的比值反映miR-92a與KLF4的結合強度。
1.10 蛋白印跡法檢測KLF4、E-cad和N-cad蛋白的表達
實驗分組以及細胞轉染方法同1.5項。48 h后，收集細胞，加入裂解液，放置于冰上靜置30 min。4 ℃ 12 000 r/min離心（離心半徑10 cm）15 min后，吸取上清液。BCA法檢測蛋白濃度，制備蛋白樣品。配制分離膠和濃縮膠，每孔20 μL蛋白樣品，120 V恒壓電泳2 h。取下凝膠，0.3 A恒流濕轉2 h，洗膜，室溫封閉1 h；KLF4、E-cad和N-cad蛋白一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜；二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，洗膜，ECL顯色。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復5次。
1.11 統計學方法
采用SPSS 21.0統計學軟件分析數據。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）描述，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；配對樣本或獨立樣本的計量資料比較采用配對t檢驗或獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 乳腺癌組織和癌旁組織中miR-92a和KLF4 mRNA相對表達量檢測結果
乳腺癌組織中miR-92a和KLF4 mRNA相對表達量均高于癌旁組織（P<0.05），見表2。
表2
miR-92a和KLF4 mRNA 相對表達量檢測結果（
）
2.2 細胞存活率檢測結果
乳腺癌MCF-7細胞存活率各組間比較差異有統計學意義（P<0.001）。分別與其他4組比較，抑制劑-miR-92a組的乳腺癌MCF-7細胞存活率均降低（均P<0.05），其他4組各組間比較乳腺癌MCF-7細胞存活率差異均無統計學意義（均P>0.05）。具體見表3。
表3
各組細胞存活率、劃痕愈合率和侵襲細胞數檢測結果（
，n=5）
2.3 細胞劃痕愈合率檢測結果
乳腺癌MCF-7細胞劃痕愈合率各組間比較差異有統計學意義（P<0.001）。分別與其他4組比較，抑制劑-miR-92a組的乳腺癌MCF-7細胞劃痕愈合率均降低（均P<0.05）；分別與其他4組比較，模擬物-miR-92a組乳腺癌MCF-7細胞劃痕愈合率升高（均P<0.05）。具體見表3和圖1。
圖1
示各組細胞遷移能力（劃痕實驗 ×100）和侵襲能力（結晶紫染色 ×200）檢測結果
2.4 膜下侵襲細胞數檢測結果
乳腺癌MCF-7細胞侵襲細胞數各組間比較差異具有統計學意義（P<0.001）。分別與其他4組相比較，抑制劑-miR-92a組的侵襲細胞數均減少（均P<0.05）；分別與其他4組相比較，模擬物-miR-92a組的侵襲細胞數均增多（均P<0.05）。具體見表3和圖1。
2.5 雙熒光素酶報告基因檢測結果
結果見表4和圖2。由表4和圖2可見：轉染模擬物-miR-92a可以降低KLF4野生型相對熒光素酶活性（P<0.001），但是對KLF4突變型無影響（P=0.928）。
表4
相對熒光素酶活性檢測結果（
，n=5）
圖2
示miR-92a和KLF4結合位點序列及突變序列
2.6 MCF-7細胞中KLF4、E-cad和N-cad蛋白相對表達量檢測結果
KLF4、E-cad和N-cad蛋白相對表達量各組間比較差異有統計學意義（P<0.001）。分別與其他4組比較，抑制劑-miR-92a組的KLF4和N-cad蛋白相對表達量降低，E-cad蛋白相對表達量升高（均P<0.05）；分別與其他4組比較，模擬物-miR-92a組的KLF4和N-cad蛋白相對表達量升高，E-cad蛋白相對表達量降低（均P<0.05）。具體見表5和圖3。
表5
各組MCF-7細胞中KLF4、E-cad和N-cad蛋白相對表達量檢測結果（
，n=5）
圖3
示各組MCF-7細胞中各蛋白表達的電泳圖
a： 對照組；b：模擬物-對照組；c：模擬物-miR-92a組；d：抑制劑-對照組；e：抑制劑-miR-92a組
3 討論
乳腺癌是危及女性生命健康最常見的惡性腫瘤之一，隨著生活節奏的加快和生活壓力的增大，乳腺癌患者逐步趨于年輕化，由于其高致死率和預后不良，嚴重威脅女性的生命健康和生活質量[7]。所以尋找有效的治療靶點和機制刻不容緩。
miR-92a是miR-17～92家族中的一員，食管癌、基底細胞癌和皮膚鱗狀細胞癌中該家族部分成員呈高表達[8-9]，而且可能是結腸癌的治療靶點[10]。另外，該家族成員還可以作為非小細胞肺癌的血清診斷標志物[11]。 miR-92a作為促癌因子而受到廣泛關注，既往研究[12-13]表明，miR-92a不僅可以作為早期胃癌的血清標志物，還可以作為結直腸癌預后的預測因子。 miR-92a表達上調，促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[14]。既往研究[15]表明，miR-92a-3p在乳腺癌組織中高表達，而且其高表達與乳腺癌患者TNM分期增高密切相關。Wu等[16]研究發現，長鏈非編碼RNA 金屬硫蛋白1J 可通過下調miR-92-3p發揮抗乳腺癌作用。本研究通過收集筆者所在醫院乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織，采用qRT-PCR法檢測到miR-92a mRNA在癌組織中呈高表達；通過上調或敲除MCF-7細胞中miR-92a的表達，檢測細胞存活率、細胞遷移能力和侵襲能力，結果表明：上調miR-92a表達對MCF-7細胞存活率無影響，細胞遷移能力和侵襲能力增強；敲除miR-92a表達后，MCF-7細胞存活率降低，細胞遷移能力和侵襲能力降低。該結果提示，miR-92a可促進乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲
KLF4是一種含鋅指結構的激活轉錄子，發揮調控細胞周期、增殖和凋亡的作用[17]。研究發現，RNA解旋酶DDX3X通過抑制乳腺癌中KLF4表達，阻滯細胞周期，從而在乳腺癌中發揮抗癌作用[18]。Zhou等[19]研究發現，肌肉萎縮相關基因1（FBXO32）通過使KLF4泛素化降解，抑制乳腺癌的發生發展。EMT導致上皮腫瘤細胞獲得間充質表型，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，E-cad和N-cad是EMT的關鍵性標志物[20]。E-cad通過與β-連環蛋白和細胞骨架蛋白的結合形成復合體，參與細胞間黏附，抑制腫瘤細胞的遷移和浸潤[21]。N-cad能夠促進腫瘤細胞和間質細胞的黏附性，從而促進腫瘤細胞遷移和侵襲[22]。研究[23-24]發現，miR-92a通過PTEN/AKT信號通路促進EMT過程，從而增強低轉移性肝癌細胞以及非小細胞肺癌的轉移和侵襲能力。有文獻[25]報道，膠質細胞瘤中miR-92a作用于KLF4，從而促進細胞的增殖和侵襲。本研究旨在探討miR-92a能否通過調節KLF4逆轉EMT過程，在乳腺癌中發揮抗癌作用。本研究通過檢測乳腺癌患者癌組織中KLF4 mRNA的表達，發現其表達上調；為了進一步探討miR-92a是否調控KLF4的表達，本研究通過熒光素酶報告基因法證明miR-92a直接靶向作用于KLF4，然后敲除或上調乳腺癌MCF-7細胞中miR-92a的表達，再以蛋白印跡法檢測KLF4、E-cad和N-cad蛋白表達情況，其結果顯示，miR-92a表達上調可增加KLF4和N-cad蛋白的相對表達量，降低E-cad蛋白的相對表達量；敲除miR-92a表達后，KLF4和N-cad蛋白的相對表達量降低，E-cad蛋白的相對表達量升高。該結果提示，miR-92a靶向調控KLF4表達，從而促進EMT過程，增強乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。
綜上所述，miR-92a敲除可有效抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，可能是通過抑制KLF4表達，逆轉EMT過程發揮調控作用，這為臨床治療乳腺癌提供了新的治療靶點。但本實驗存在不足之處：① 本研究發現，KLF4通過調控EMT進程，在乳腺癌的進展中發揮重要作用，但就KLF4是如何調控EMT過程，未進行探討。② 本研究僅探討了miR-92a在MCF-7細胞株中對KLF-4發揮調控作用，影響癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，未涉及其他乳腺癌細胞類型。因此，后續仍需深入探討KLF4調控EMT過程的具體機制以及miR-92a在其他乳腺癌細胞系中是否具有同樣的調控作用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們相互之間無競爭性利益關系。
作者貢獻聲明：本研究思路由張蘭和徐源設計；實驗操作、資料統計以及數據分析由徐源、趙冰和李軍濤完成；論文寫作由張蘭完成。
倫理聲明：本研究通過鄭州大學附屬鄭州中心醫院倫理委員會審批（倫理編號：ZZZXYY20170424）。
乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一，發病率和病死率呈逐年上升趨勢。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為25 nt以內的內源性非編碼RNA，通過作用于靶基因，參與調控多種生理功能。miR-92a因與腫瘤的發生密切相關而受到廣泛關注，包括非小細胞肺癌、胃癌以及食管鱗癌[1-3]。鋅指蛋白轉錄因子4（kruppel-like factor 4，KLF4）是一種含鋅指修飾結構的蛋白，在多種腫瘤發生發展過程中發揮重要作用，KLF4上調促進肝癌細胞增殖、遷移和浸潤[4]。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞在某種刺激下，失去極性，喪失細胞間緊密性連接和黏附性連接，從而使細胞獲得浸潤和遷移的能力，它的激活是癌細胞獲得惡性表型的重要環節[5]。上皮鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）丟失以及神經鈣黏蛋白（N-cadherin，N-cad）表達是EMT的標志性變化。研究[6]發現，KLF4上調促進EMT過程，導致膀胱癌細胞發生EMT，遷移能力增強。但是，miR-92a是否可以通過調節KLF4逆轉EMT過程，從而抑制乳腺癌細胞增殖、浸潤和遷移，仍需進一步研究。本研究旨在探討miR-92a在乳腺癌細胞中的表達，以及是否可以通過調節KLF4逆轉EMT過程。
1 材料和方法
1.1 細胞系
人乳腺癌細胞系MCF-7購自美國ATCC公司。
1.2 標本采集
收集筆者所在醫院2017年5月至2019年10月期間122例乳腺癌患者的手術切除標本，所有患者均經組織活檢和病理學檢查確診，術前未接受過放化療，患者年齡25～65歲，中位年齡44.3歲；腫瘤直徑<5 cm患者71例，≥5 cm患者51例。 癌旁組織取自距肉眼可見腫瘤病灶至少5 cm處的組織，病理學檢查證實該組織未見腫瘤細胞。本研究征得患者同意并簽訂知情同意書，獲得鄭州大學附屬鄭州中心醫院倫理委員會的審批（批文編號：ZZZXYY20170424）。
1.3 試劑與儀器
miR-92a 模擬物（miR-92a mimic）、miR-92a拮抗劑（miR-92a inhibitor）和miRNA引物購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol試劑盒和逆轉錄試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；DMEM培養基購自美國Cibco公司；二甲基亞砜（dimethy1 sulfoxide，DMSO）購自美國Sigma公司；KLF4、E-cad、N-cad和GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司；CCK-8試劑盒購自上海貝博生物公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；酶標儀購自美國Thermo公司；熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。
1.4 qRT-PCR檢測miR-92a和KLF4 mRNA表達
取癌組織和癌旁組織置于液氮中研磨，Trizol試劑盒提取組織中總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書反轉錄出cDNA。以cDNA為模板，采用20 μL反應體系：SYBR green qPCR mix 10 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 2 μL和去離子水7.2 μL進行擴增，擴增條件為 95 ℃ 預變性5 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s，進行40個循環，72 ℃延伸10 min。miR-92a以U6為內參，KLF4以GAPDH為內參，采用2–△△CT法計算miR-92a和KLF4 mRNA相對表達水平。引物序列見表1。
表1
引物序列
1.5 細胞培養、分組和轉染
將MCF-7細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱中培養，傳至第4代后，取對數生長期的細胞用于實驗。
實驗分為對照組、模擬物-對照組、模擬物-miR-92a組、抑制劑-對照組和抑制劑-miR-92a組。取對數生長期的MCF-7細胞，制成細胞懸液，細胞密度為1×105個/mL，接種于96孔板，每孔1 mL。待細胞融合度達到80%時，按照Lipofectamine 2000說明書將模擬物或抑制劑分別轉染入對應組別的孔中，48 h后制成單細胞懸液，接種于96孔板，待細胞貼壁生長后用于以下實驗。對照組細胞僅更換新的培養基。
1.6 MTT法檢測細胞存活率
從培養箱中取出96孔板，每孔加入20 μL MTT液（5 mg/mL），孵育4 h后，棄去培養液，每孔加入200 μL DMSO，37 ℃避光孵育10 min，用酶標儀測定波長490 nm處吸光度值（A 值）。細胞存活率（%）=實驗組A值/對照組A值×100%。實驗重復5次。
1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力
從培養箱中取出96孔板，10 μL無菌槍頭均勻劃線，劃線0 h和48 h后，顯微鏡下觀察細胞修復情況，按照劃痕愈合率=（劃痕0 h的劃痕面積－劃痕后48 h的劃痕面積）/劃痕0 h的劃痕面積×100%，計算劃痕愈合率，細胞遷移能力與劃痕愈合率呈正相關。實驗重復5次。
1.8 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力
取各組MCF-7細胞以3×104個/mL的密度接種于Transwell小室表面，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，甲醛固定小室膜以下的細胞，0.2%結晶紫溶液染色10 min，顯微鏡下隨機取10個視野，并統計膜下細胞數。實驗重復 5 次。
1.9 雙熒光素酶報告基因檢測miR-92a與KLF-4的靶向關系
TargetScan軟件檢測到miR-92a和KLF4存在結合位點，將該序列片段克隆擴增，插入到熒光素酶報告基因質粒中，構建野生型KLF4報告基因質粒（KLF4-wt）和突變型KLF4報告基因質粒（KLF4-mut）。將兩種質粒分別與模擬物-miR-92a及陰性對照片段共轉染到MCF-7細胞中，共分為4組： 模擬物-對照+KLF4-wt組，模擬物-miR-92a+KLF4-wt組，模擬物-對照+KLF4-mut組以及模擬物-miR-92a+KLF4-mut組，每組設置5個復孔， 24 h后，3 000 r/min離心15 min（離心半徑8 cm），收集細胞，以熒光素酶試劑盒檢測熒光素酶活性。 結果以海腎熒光素酶的發光強度與螢火蟲熒光素酶發光強度的比值反映miR-92a與KLF4的結合強度。
1.10 蛋白印跡法檢測KLF4、E-cad和N-cad蛋白的表達
實驗分組以及細胞轉染方法同1.5項。48 h后，收集細胞，加入裂解液，放置于冰上靜置30 min。4 ℃ 12 000 r/min離心（離心半徑10 cm）15 min后，吸取上清液。BCA法檢測蛋白濃度，制備蛋白樣品。配制分離膠和濃縮膠，每孔20 μL蛋白樣品，120 V恒壓電泳2 h。取下凝膠，0.3 A恒流濕轉2 h，洗膜，室溫封閉1 h；KLF4、E-cad和N-cad蛋白一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜；二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，洗膜，ECL顯色。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復5次。
1.11 統計學方法
采用SPSS 21.0統計學軟件分析數據。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）描述，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；配對樣本或獨立樣本的計量資料比較采用配對t檢驗或獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 乳腺癌組織和癌旁組織中miR-92a和KLF4 mRNA相對表達量檢測結果
乳腺癌組織中miR-92a和KLF4 mRNA相對表達量均高于癌旁組織（P<0.05），見表2。
表2
miR-92a和KLF4 mRNA 相對表達量檢測結果（）
2.2 細胞存活率檢測結果
乳腺癌MCF-7細胞存活率各組間比較差異有統計學意義（P<0.001）。分別與其他4組比較，抑制劑-miR-92a組的乳腺癌MCF-7細胞存活率均降低（均P<0.05），其他4組各組間比較乳腺癌MCF-7細胞存活率差異均無統計學意義（均P>0.05）。具體見表3。
表3
各組細胞存活率、劃痕愈合率和侵襲細胞數檢測結果（，n=5）
2.3 細胞劃痕愈合率檢測結果
乳腺癌MCF-7細胞劃痕愈合率各組間比較差異有統計學意義（P<0.001）。分別與其他4組比較，抑制劑-miR-92a組的乳腺癌MCF-7細胞劃痕愈合率均降低（均P<0.05）；分別與其他4組比較，模擬物-miR-92a組乳腺癌MCF-7細胞劃痕愈合率升高（均P<0.05）。具體見表3和圖1。
圖1
示各組細胞遷移能力（劃痕實驗 ×100）和侵襲能力（結晶紫染色 ×200）檢測結果
2.4 膜下侵襲細胞數檢測結果
乳腺癌MCF-7細胞侵襲細胞數各組間比較差異具有統計學意義（P<0.001）。分別與其他4組相比較，抑制劑-miR-92a組的侵襲細胞數均減少（均P<0.05）；分別與其他4組相比較，模擬物-miR-92a組的侵襲細胞數均增多（均P<0.05）。具體見表3和圖1。
2.5 雙熒光素酶報告基因檢測結果
結果見表4和圖2。由表4和圖2可見：轉染模擬物-miR-92a可以降低KLF4野生型相對熒光素酶活性（P<0.001），但是對KLF4突變型無影響（P=0.928）。
表4
相對熒光素酶活性檢測結果（，n=5）
圖2
示miR-92a和KLF4結合位點序列及突變序列
2.6 MCF-7細胞中KLF4、E-cad和N-cad蛋白相對表達量檢測結果
KLF4、E-cad和N-cad蛋白相對表達量各組間比較差異有統計學意義（P<0.001）。分別與其他4組比較，抑制劑-miR-92a組的KLF4和N-cad蛋白相對表達量降低，E-cad蛋白相對表達量升高（均P<0.05）；分別與其他4組比較，模擬物-miR-92a組的KLF4和N-cad蛋白相對表達量升高，E-cad蛋白相對表達量降低（均P<0.05）。具體見表5和圖3。
表5
各組MCF-7細胞中KLF4、E-cad和N-cad蛋白相對表達量檢測結果（，n=5）
圖3
示各組MCF-7細胞中各蛋白表達的電泳圖
a： 對照組；b：模擬物-對照組；c：模擬物-miR-92a組；d：抑制劑-對照組；e：抑制劑-miR-92a組
3 討論
乳腺癌是危及女性生命健康最常見的惡性腫瘤之一，隨著生活節奏的加快和生活壓力的增大，乳腺癌患者逐步趨于年輕化，由于其高致死率和預后不良，嚴重威脅女性的生命健康和生活質量[7]。所以尋找有效的治療靶點和機制刻不容緩。
miR-92a是miR-17～92家族中的一員，食管癌、基底細胞癌和皮膚鱗狀細胞癌中該家族部分成員呈高表達[8-9]，而且可能是結腸癌的治療靶點[10]。另外，該家族成員還可以作為非小細胞肺癌的血清診斷標志物[11]。 miR-92a作為促癌因子而受到廣泛關注，既往研究[12-13]表明，miR-92a不僅可以作為早期胃癌的血清標志物，還可以作為結直腸癌預后的預測因子。 miR-92a表達上調，促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[14]。既往研究[15]表明，miR-92a-3p在乳腺癌組織中高表達，而且其高表達與乳腺癌患者TNM分期增高密切相關。Wu等[16]研究發現，長鏈非編碼RNA 金屬硫蛋白1J 可通過下調miR-92-3p發揮抗乳腺癌作用。本研究通過收集筆者所在醫院乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織，采用qRT-PCR法檢測到miR-92a mRNA在癌組織中呈高表達；通過上調或敲除MCF-7細胞中miR-92a的表達，檢測細胞存活率、細胞遷移能力和侵襲能力，結果表明：上調miR-92a表達對MCF-7細胞存活率無影響，細胞遷移能力和侵襲能力增強；敲除miR-92a表達后，MCF-7細胞存活率降低，細胞遷移能力和侵襲能力降低。該結果提示，miR-92a可促進乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲
KLF4是一種含鋅指結構的激活轉錄子，發揮調控細胞周期、增殖和凋亡的作用[17]。研究發現，RNA解旋酶DDX3X通過抑制乳腺癌中KLF4表達，阻滯細胞周期，從而在乳腺癌中發揮抗癌作用[18]。Zhou等[19]研究發現，肌肉萎縮相關基因1（FBXO32）通過使KLF4泛素化降解，抑制乳腺癌的發生發展。EMT導致上皮腫瘤細胞獲得間充質表型，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，E-cad和N-cad是EMT的關鍵性標志物[20]。E-cad通過與β-連環蛋白和細胞骨架蛋白的結合形成復合體，參與細胞間黏附，抑制腫瘤細胞的遷移和浸潤[21]。N-cad能夠促進腫瘤細胞和間質細胞的黏附性，從而促進腫瘤細胞遷移和侵襲[22]。研究[23-24]發現，miR-92a通過PTEN/AKT信號通路促進EMT過程，從而增強低轉移性肝癌細胞以及非小細胞肺癌的轉移和侵襲能力。有文獻[25]報道，膠質細胞瘤中miR-92a作用于KLF4，從而促進細胞的增殖和侵襲。本研究旨在探討miR-92a能否通過調節KLF4逆轉EMT過程，在乳腺癌中發揮抗癌作用。本研究通過檢測乳腺癌患者癌組織中KLF4 mRNA的表達，發現其表達上調；為了進一步探討miR-92a是否調控KLF4的表達，本研究通過熒光素酶報告基因法證明miR-92a直接靶向作用于KLF4，然后敲除或上調乳腺癌MCF-7細胞中miR-92a的表達，再以蛋白印跡法檢測KLF4、E-cad和N-cad蛋白表達情況，其結果顯示，miR-92a表達上調可增加KLF4和N-cad蛋白的相對表達量，降低E-cad蛋白的相對表達量；敲除miR-92a表達后，KLF4和N-cad蛋白的相對表達量降低，E-cad蛋白的相對表達量升高。該結果提示，miR-92a靶向調控KLF4表達，從而促進EMT過程，增強乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。
綜上所述，miR-92a敲除可有效抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，可能是通過抑制KLF4表達，逆轉EMT過程發揮調控作用，這為臨床治療乳腺癌提供了新的治療靶點。但本實驗存在不足之處：① 本研究發現，KLF4通過調控EMT進程，在乳腺癌的進展中發揮重要作用，但就KLF4是如何調控EMT過程，未進行探討。② 本研究僅探討了miR-92a在MCF-7細胞株中對KLF-4發揮調控作用，影響癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，未涉及其他乳腺癌細胞類型。因此，后續仍需深入探討KLF4調控EMT過程的具體機制以及miR-92a在其他乳腺癌細胞系中是否具有同樣的調控作用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們相互之間無競爭性利益關系。
作者貢獻聲明：本研究思路由張蘭和徐源設計；實驗操作、資料統計以及數據分析由徐源、趙冰和李軍濤完成；論文寫作由張蘭完成。
倫理聲明：本研究通過鄭州大學附屬鄭州中心醫院倫理委員會審批（倫理編號：ZZZXYY20170424）。
