引用本文： 劉可峰, 王偉, 范永剛, 于英杰. FOXA1 調控 Notch 通路對結腸癌細胞增殖及侵襲影響的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(4): 444-449. doi: 10.7507/1007-9424.202105038 復制
結腸癌是一種高致死性的消化系統惡性腫瘤，侵襲性較強，其發病率及病死率在世界惡性腫瘤中排名第 3 位[1-2]。盡管隨著醫學科技手段的發展，結腸癌的病死率有所下降，但對處于中晚期或轉移階段的患者實施放射和（或）化學治療等效果并不滿意，因此，有必要尋找新的治療方法以提高其生存幾率。目前靶基因治療方法是一大研究熱點。叉頭框蛋白（forkhead box protein，FOX）A1作為FOX家族成員之一，與胚胎發育、疾病進程有關。有研究[3-4]發現，FOXA1 在結腸癌組織及細胞系中表達異常增加，其參與了結腸癌的發生和發展。Notch 信號通路在調節細胞增殖、分化、干細胞維持中具有重要作用且在結腸癌等多種癌細胞中極其活躍，其激活能促進腫瘤的轉移[5-6]。有研究[7]發現，子宮內膜癌細胞中 FOXA1 可調控 Notch 通路并誘導其激活。FOXA1 在結腸癌細胞中的作用機制是否與其調控 Notch 信號通路有關還不清楚，因此，本研究通過對其探究以期為結腸癌的治療及發生機制的研究提供參考和數據支持。
1 材料與方法
1.1 研究對象
1.1.1 臨床病例
收集河南科技大學第一附屬醫院 2019 年 6 月至 2021 年 2 月期間收治的 45 例結腸癌患者的結腸癌組織及其相應距癌組織2 cm處的癌旁組織，均經術后病理學檢測結果確認。納入標準：首次確診且符合結腸癌診斷標準；術前未行放射和（或）化學治療。排除標準：進行過抗腫瘤藥物治療；患有其他腫瘤疾病患者；其他器官衰竭患者。本研究已經河南科技大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準；所有患者均知情同意。
1.1.2 SW480 細胞
結腸癌 SW480 細胞（貨號：YCL-0223）購自武漢益普生物科技有限公司。將經過復蘇的 SW480 細胞接種到 DMEM 培養基于 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養至細胞融合至 80% 左右時消化傳代。
1.2 主要試劑和儀器
Lipofectamine? 2000 轉染試劑（貨號為Q1429）購自上海遠慕生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒（貨號為CD-13559-ML）購自武漢純度生物科技有限公司；Notch 通路激活劑丙戊酸鈉（貨號為B26893-100 mg）購自上海源葉生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG 二抗抗體和BCA 蛋白檢測試劑盒（貨號分別為JN0200-GLH、HR0329-ZHV）購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗 β-actin、c-Myc、FOXA1、Notch1、波形蛋白（Vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體（貨號分別為 4967、5605、58613、3608、5741、13116）購自 Cell Signaling Technology；兔抗 Hes-1 抗體（貨號為DF7569）購自 Affinity Biosciences；cyclinD1（貨號為orb77046）購自 Biorbyt；兔抗E-cadherin、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP） 9、MMP2 抗體（貨號分別為20874-1-AP、10375-2-AP、10373-2-AP）購自 Proteintech。shRNA-NC、sh-FOXA1由賽默飛世爾科技合成。CFX384? Touch實時熒光定量PCR（real-timefluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）系統購自伯樂公司；Invitrogen凝膠成像系統購自賽默飛世爾。
1.3 實驗方法
1.3.1 細胞轉染與分組
將密度為 2×106 個/mL 的 SW480 細胞接種到 6 孔板中（1 mL）培養至貼壁，根據 Lipofectamine? 2000 使用說明書按5 nmol/L的終濃度將shRNA-NC和sh-FOXA1慢病毒分別轉染入SW480細胞中（分別為 shRNA-NC組及sh-FOXA1組），sh-FOXA1+丙戊酸鈉組在sh-FOXA1組的基礎上即刻加入 8 mmol/L 丙戊酸鈉，另外設置未經任何特殊處理的細胞作為對照組。各組細胞培養 48 h 后用于實驗。
1.3.2 免疫組織化學法檢測組織中 FOXA1 蛋白表達
結腸癌組織及癌旁組織經多聚甲醛固定、石蠟包埋切片（4 μm）、脫蠟水化后添加檸檬酸鹽緩沖液（1 000 mL）修復抗原，過氧化氫靜置（10 min）除去內源性過氧化物酶后加兔抗FOXA1一抗過夜，Envision二抗-酶標多聚物孵育 30 min，DAB 顯色液染色、復染、透明、封片觀察[8]，出現黃褐色染色的細胞即為陽性染色細胞。采用Image-Pro Plus 6.0 分析光密度值/視野面積即為 FOXA1 蛋白表達水平，取均值。
1.3.3 qRT-PCR法檢測組織和細胞中FOXA1 mRNA表達
通過RNA提取試劑盒提取組織及各組細胞（重復5孔）內總RNA后檢測其濃度，以所得RNA為模板，根據反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA后再進行 qRT-PCR擴增。FOXA1上游引物為5′-ATGTTCGAGTCACAGAGGATCG-3′，下游引物為5′-TGGTGCTGGTGAGCTGAAT-3′，擴增片段長度為306 bp；GAPDH 上游引物為5′-GGACTCATGGTATGAGAGCTGG-3′，下游引物為5′-GATGGCATGGACTGTGGTCT-3′，擴增片段長度為258 bp。用GAPDH作為內參對FOXA1進行標準化，結果用 2???Ct分析FOXA1表達水平[8]。
1.3.4 MTT 法檢測 SW480 細胞活力
各組SW480細胞以5×103個/孔的密度（每孔100 μL）接種于96孔板中培養（重復5孔），24 h后添加 MTT（5 mg/mL，20 μL/孔），4 h后棄上清并添加二甲基亞砜（150 μL/孔），于 470 nm處測定吸光度（absorbance，A）值，SW480細胞存活率（%）=（A處理組–A空白對照組）/（A對照組–A空白對照組）×100%，其中處理組是指shRNA-NC 組、sh-FOXA1 組及sh-FOXA1+丙戊酸鈉組，對照組是指細胞未經任何特殊處理組，空白對照組是指未加入細胞組。
1.3.5 克隆形成實驗
將各組SW480細胞以4×102個/孔的密度接種于6孔板中培養至克隆細胞肉眼可見后棄培養液，多聚甲醛固定后1%結晶紫溶液染色，磷酸鹽緩沖鹽溶液沖洗晾干，進行克隆細胞計數（重復5孔）。
1.3.6 Transwell 法檢測 SW480 細胞侵襲和遷移能力
① 侵襲實驗：用無血清培養基將 Matrigel 稀釋至 200 mg/L 后用 200 μg/cm2 包被 Transwell 小室上室進行 24 h 孵育，將各組 SW480 細胞（1×105 個/mL）接種于小室上室（200 μL）并在下室加入 DMEM 培養基（600 μL）培養 24 h 后磷酸鹽緩沖鹽溶液清洗，棉球擦去上室未穿膜 SW480 細胞，依次進行甲醇固定及結晶紫染色，選取 5 個視野觀察計數。② 遷移實驗：除上室未被 Matrigel 膠所包被之外，其余步驟與侵襲實驗相同。
1.3.7 Western blot 法檢測 SW480 細胞中與增殖（c-Myc、 cyclinD1） 、侵襲和遷移（MMP9、 MMP2）、上皮間充質轉化（Vimentin、N-cadherin、E-cadherin）及 Notch 通路（Notch-1、Hes-1）相關蛋白的表達情況
RIPA 裂解液裂解各組細胞后提取總蛋白，經 BCA 法檢測總蛋白含量；取上樣緩沖液與蛋白混勻后 100 ℃ 進行 5 min 變性，以每孔 40 μg 的量進行 SDS-PAGE 凝膠電泳（重復 5 孔），低溫轉移蛋白至 PVDF 膜上，5% 的脫脂奶粉封閉（1 h）后加入一抗（1∶1 000）孵育（4 ℃）過夜，次日早晨加入二抗（1∶3 000）孵育2 h后ECL 進行顯色，蛋白凝膠成像儀觀察，半定量分析各蛋白含量[8]。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 23.0 統計學軟件進行數據分析，柱狀圖采用 Origin軟件進行制作。對于符合正態分布的計量數據用均數±標準差（
±s）進行描述，2 組間比較采用配對 t 檢驗；多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK-q 檢驗，檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 FOXA1 在結腸癌組織和結腸癌細胞中的表達情況
2.1.1 FOXA1 蛋白表達
免疫組織化學法檢測 FOXA1 蛋白陽性表達定位于細胞核，見圖 1a、1b。定量結果顯示，FOXA1 蛋白表達水平在結腸癌組織及其相應的癌旁組織中分別為 0.085±0.028 和 0.034±0.010，前者高于后者（t=11.036，P<0.001）。
圖1
示主要結果圖片
a、b：FOXA1 蛋白在結腸癌組織（a）及其相應的癌旁組織（b）中的表達情況（Envision法 ×100）。c~f：對照組（c）、shRNA-NC 組（d）、sh-FOXA1 組（e）、sh-FOXA1+丙戊酸鈉組（f）SW480 細胞克隆形成能力。g：FOXA1 對 SW480 細胞增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力的影響（與對照組和 shRNA-NC 組比較，*
2.1.2 FOXA1 mRNA 表達
結果見表 1。從表 1 可見，FOXA1 mRNA 表達水平在結腸癌組織中高于其相應的癌旁組織（t=11.671，P<0.001）；在細胞實驗中發現，FOXA1 mRNA 在 sh-FOXA1 組中的表達水平低于對照組（t=5.442，P=0.001）和 shRNA-NC 組（t=5.951，P<0.001），而其在對照組和 shRNA-NC 組間比較差異無統計學意義（t=0.349，P=0.736），其在 sh-FOXA1+丙戊酸鈉組和 sh-FOXA1 組間比較差異無統計學意義（t=0.099，P=0.924）。
表1
FOXA1 mRNA在結腸組織和細胞中的表達情況（
）
2.2 FOXA1 對 SW480 細胞活力、克隆形成、侵襲和遷移能力的影響
FOXA1 對 SW480 細胞克隆形成能力的影響可見紫色細胞集落，見圖 1c~1f。細胞存活率（F=38.005，P<0.001）、克隆細胞數（F=26.284，P<0.001）、遷移細胞數（F=8.088，P=0.002）、侵襲細胞數（F=15.758，P<0.001）在 4 組間總體比較差異均有統計學意義，這些指標在 sh-FOXA1 組均低于對照組（P<0.05）和 shRNA-NC 組（P<0.05），sh-FOXA1+丙戊酸鈉組均高于 sh-FOXA1 組（P<0.05）且與其他組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 1g。
2.3 Western blot 法檢測各組 SW480 細胞中的蛋白表達情況
Western blot 法檢測各組 SW480 細胞中蛋白表達的定性結果見圖 1h~1k，半定量結果見圖 1l。4 組 SW480 細胞中的 c-Myc（F=12.627，P<0.001）、cyclinD1（F=9.164，P<0.001）、MMP9（F=11.271，P<0.001）、MMP2（F=7.656，P=0.002）、E-cadherin（F=26.645，P<0.001）、Vimentin（F=11.923，P<0.001）、N-cadherin（F=9.812，P=0.001）、Notch-1（F=8.605，P=0.001）、Hes-1（F=10.529，P<0.001）蛋白表達情況在 4 組間總體比較差異均有統計學意義。與對照組和 shRNA-NC 組相比，沉默 FOXA1 表達后即sh-FOXA1 組細胞中與增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力及通路有關的蛋白 c-Myc、cyclinD1、MMP9、MMP2、Vimentin、N-cadherin、Notch-1、Hes-1 蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）、E-cadherin 蛋白表達水平明顯升高（P<0.05）；加入 Notch 通路激活劑丙戊酸鈉后即 sh-FOXA1+丙戊酸鈉組這些蛋白表達水平較之 sh-FOXA1 組發生相應的逆轉（P<0.05）。
3 討論
結腸癌是世界范圍內惡性腫瘤相關死亡的主要原因之一。隨著人們生活方式的改變，結腸癌的發病率逐年增加，飲酒、肥胖、吸煙、糖尿病等均被認為是其發生的危險因素，但結腸癌的發生機制仍不清楚[9-11]。結腸癌具有的高侵襲性和轉移性是其治療的主要障礙。目前結腸癌的有效治療手段是放射和（或）化學治療及手術，但對于晚期結腸癌患者的療效不佳，因此有必要尋找新的治療方法以提高患者存活率及延長生存期[10, 12-14]。
FOXA1 作為一種轉錄因子，與胚胎發育及上皮分化密切相關。有研究[3, 7, 15-16]表明，FOXA1 參與腫瘤的發生和發展，調節包括細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移在內的一系列生物學過程。FOXA1 在直腸癌、子宮內膜癌等惡性腫瘤中異常高表達，并且還影響大量與代謝過程和細胞周期調控相關的基因表達[7, 17-18]。有研究[19]發現，miR-760 靶向抑制 FOXA1 表達可抑制宮頸鱗狀細胞癌 SiHa 細胞的增殖、侵襲和遷移以及上皮間質轉化進程。上皮間質轉化與癌細胞浸潤有關，其給予癌細胞持續侵襲的能力，是腫瘤轉變為惡性的重要環節之一，在該過程中 E-cadherin 表達異常降低，而 Vimentin 和N-cadherin 表達異常增加，抑制 Vimentin 和 N-cadherin 表達或增加 E-cadherin 表達可抑制上皮間質轉化[2, 20-21]。在結腸癌細胞中，FOXA1 的表達異常增加，沉默其表達可通過抑制人第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物/蛋白激酶信號通路抑制癌細胞增殖、集落形成、侵襲和遷移能力[3]。c-Myc、cyclinD1 作為常見的增殖相關蛋白，抑制其表達可抑制腫瘤的增殖，而 MMP9、MMP2 與腫瘤的侵襲密切相關，促進二者表達，可促進腫瘤的侵襲和遷移[3]。在本研究中發現，臨床病例結腸癌組織中 FOXA1 蛋白表達水平較其相應的癌旁組織中增高；此外，在細胞實驗中發現，通過 sh-FOXA1 轉染 SW480 細胞后，sh-FOXA1 組的細胞存活率、克隆細胞數、侵襲和遷移細胞數、c-Myc、cyclinD1、MMP9、MMP2、Vimentin、N-cadherin蛋白表達水平均降低（P<0.05），E-cadherin 表達水平增高（P<0.05）。與前人研究[3]結果基本一致。結果提示，FOXA1 可能參與結腸癌的發生和發展，沉默其表達可抑制癌細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化進程。
Notch 是單個跨膜蛋白，當 Notch 與相鄰細胞的配體結合時可被激活。近年來有證據[22-25]表明，Notch 異常激活與腫瘤進程有關。Notch1的激活是導致上皮間質轉化發生的重要原因，Jagged1介導的Notch1激活會誘導Snail表達，抑制E-cadherin 表達，最終導致上皮間質轉化的發生[22, 26]。Notch1 及其分子靶點 Hes-1 在晚期結腸腫瘤中的表達水平顯著高于早期腫瘤[22]。Notch 通路激活可促進結腸癌的發生、維持及轉移[26]。有研究[7]發現，FOXA1 通過促進雄激素受體表達來促進子宮內膜癌細胞的增殖并激活 Notch 信號通路。在本研究中發現，與對照組相比，sh-FOXA1 組 Notch1 和 Hes-1 表達水平顯著降低；與 sh-FOXA1 組相比，sh-FOXA1+丙戊酸鈉組細胞存活率、克隆細胞數、侵襲和遷移細胞數、c-Myc、cyclinD1、MMP9、MMP2、Vimentin、N-cadherin、Notch-1和 Hes-1蛋白表達水平均增高（P<0.05），E-cadherin蛋白表達水平降低（P<0.05）。該結果提示，FOXA1 表達沉默對結腸癌細胞增殖、侵襲、遷移及上皮間質轉化的抑制作用可能與其抑制 Notch通路有關，而Notch激活可逆轉FOXA1表達沉默對腫瘤的抑制作用。
綜上所述，沉默FOXA1表達可能通過抑制Notch通路來抑制結腸癌細胞增殖、侵襲、遷移及上皮間質轉化進程。本研究結果可能為結腸癌治療機制的研究提供一定的數據參考，但在未來的研究中，還需對 FOXA1調控Notch通路的下游機制進行深入探究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉可峰、范永剛完成實驗設計；王偉、于英杰進行實驗、收集數據并做統計分析；劉可峰、于英杰、王偉、范永剛和于英杰共同完成論文寫作。
倫理聲明：本研究通過了河南科技大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（批文編號：2019-06-L29）。
結腸癌是一種高致死性的消化系統惡性腫瘤，侵襲性較強，其發病率及病死率在世界惡性腫瘤中排名第 3 位[1-2]。盡管隨著醫學科技手段的發展，結腸癌的病死率有所下降，但對處于中晚期或轉移階段的患者實施放射和（或）化學治療等效果并不滿意，因此，有必要尋找新的治療方法以提高其生存幾率。目前靶基因治療方法是一大研究熱點。叉頭框蛋白（forkhead box protein，FOX）A1作為FOX家族成員之一，與胚胎發育、疾病進程有關。有研究[3-4]發現，FOXA1 在結腸癌組織及細胞系中表達異常增加，其參與了結腸癌的發生和發展。Notch 信號通路在調節細胞增殖、分化、干細胞維持中具有重要作用且在結腸癌等多種癌細胞中極其活躍，其激活能促進腫瘤的轉移[5-6]。有研究[7]發現，子宮內膜癌細胞中 FOXA1 可調控 Notch 通路并誘導其激活。FOXA1 在結腸癌細胞中的作用機制是否與其調控 Notch 信號通路有關還不清楚，因此，本研究通過對其探究以期為結腸癌的治療及發生機制的研究提供參考和數據支持。
1 材料與方法
1.1 研究對象
1.1.1 臨床病例
收集河南科技大學第一附屬醫院 2019 年 6 月至 2021 年 2 月期間收治的 45 例結腸癌患者的結腸癌組織及其相應距癌組織2 cm處的癌旁組織，均經術后病理學檢測結果確認。納入標準：首次確診且符合結腸癌診斷標準；術前未行放射和（或）化學治療。排除標準：進行過抗腫瘤藥物治療；患有其他腫瘤疾病患者；其他器官衰竭患者。本研究已經河南科技大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準；所有患者均知情同意。
1.1.2 SW480 細胞
結腸癌 SW480 細胞（貨號：YCL-0223）購自武漢益普生物科技有限公司。將經過復蘇的 SW480 細胞接種到 DMEM 培養基于 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養至細胞融合至 80% 左右時消化傳代。
1.2 主要試劑和儀器
Lipofectamine? 2000 轉染試劑（貨號為Q1429）購自上海遠慕生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒（貨號為CD-13559-ML）購自武漢純度生物科技有限公司；Notch 通路激活劑丙戊酸鈉（貨號為B26893-100 mg）購自上海源葉生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG 二抗抗體和BCA 蛋白檢測試劑盒（貨號分別為JN0200-GLH、HR0329-ZHV）購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗 β-actin、c-Myc、FOXA1、Notch1、波形蛋白（Vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體（貨號分別為 4967、5605、58613、3608、5741、13116）購自 Cell Signaling Technology；兔抗 Hes-1 抗體（貨號為DF7569）購自 Affinity Biosciences；cyclinD1（貨號為orb77046）購自 Biorbyt；兔抗E-cadherin、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP） 9、MMP2 抗體（貨號分別為20874-1-AP、10375-2-AP、10373-2-AP）購自 Proteintech。shRNA-NC、sh-FOXA1由賽默飛世爾科技合成。CFX384? Touch實時熒光定量PCR（real-timefluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）系統購自伯樂公司；Invitrogen凝膠成像系統購自賽默飛世爾。
1.3 實驗方法
1.3.1 細胞轉染與分組
將密度為 2×106 個/mL 的 SW480 細胞接種到 6 孔板中（1 mL）培養至貼壁，根據 Lipofectamine? 2000 使用說明書按5 nmol/L的終濃度將shRNA-NC和sh-FOXA1慢病毒分別轉染入SW480細胞中（分別為 shRNA-NC組及sh-FOXA1組），sh-FOXA1+丙戊酸鈉組在sh-FOXA1組的基礎上即刻加入 8 mmol/L 丙戊酸鈉，另外設置未經任何特殊處理的細胞作為對照組。各組細胞培養 48 h 后用于實驗。
1.3.2 免疫組織化學法檢測組織中 FOXA1 蛋白表達
結腸癌組織及癌旁組織經多聚甲醛固定、石蠟包埋切片（4 μm）、脫蠟水化后添加檸檬酸鹽緩沖液（1 000 mL）修復抗原，過氧化氫靜置（10 min）除去內源性過氧化物酶后加兔抗FOXA1一抗過夜，Envision二抗-酶標多聚物孵育 30 min，DAB 顯色液染色、復染、透明、封片觀察[8]，出現黃褐色染色的細胞即為陽性染色細胞。采用Image-Pro Plus 6.0 分析光密度值/視野面積即為 FOXA1 蛋白表達水平，取均值。
1.3.3 qRT-PCR法檢測組織和細胞中FOXA1 mRNA表達
通過RNA提取試劑盒提取組織及各組細胞（重復5孔）內總RNA后檢測其濃度，以所得RNA為模板，根據反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA后再進行 qRT-PCR擴增。FOXA1上游引物為5′-ATGTTCGAGTCACAGAGGATCG-3′，下游引物為5′-TGGTGCTGGTGAGCTGAAT-3′，擴增片段長度為306 bp；GAPDH 上游引物為5′-GGACTCATGGTATGAGAGCTGG-3′，下游引物為5′-GATGGCATGGACTGTGGTCT-3′，擴增片段長度為258 bp。用GAPDH作為內參對FOXA1進行標準化，結果用 2???Ct分析FOXA1表達水平[8]。
1.3.4 MTT 法檢測 SW480 細胞活力
各組SW480細胞以5×103個/孔的密度（每孔100 μL）接種于96孔板中培養（重復5孔），24 h后添加 MTT（5 mg/mL，20 μL/孔），4 h后棄上清并添加二甲基亞砜（150 μL/孔），于 470 nm處測定吸光度（absorbance，A）值，SW480細胞存活率（%）=（A處理組–A空白對照組）/（A對照組–A空白對照組）×100%，其中處理組是指shRNA-NC 組、sh-FOXA1 組及sh-FOXA1+丙戊酸鈉組，對照組是指細胞未經任何特殊處理組，空白對照組是指未加入細胞組。
1.3.5 克隆形成實驗
將各組SW480細胞以4×102個/孔的密度接種于6孔板中培養至克隆細胞肉眼可見后棄培養液，多聚甲醛固定后1%結晶紫溶液染色，磷酸鹽緩沖鹽溶液沖洗晾干，進行克隆細胞計數（重復5孔）。
1.3.6 Transwell 法檢測 SW480 細胞侵襲和遷移能力
① 侵襲實驗：用無血清培養基將 Matrigel 稀釋至 200 mg/L 后用 200 μg/cm2 包被 Transwell 小室上室進行 24 h 孵育，將各組 SW480 細胞（1×105 個/mL）接種于小室上室（200 μL）并在下室加入 DMEM 培養基（600 μL）培養 24 h 后磷酸鹽緩沖鹽溶液清洗，棉球擦去上室未穿膜 SW480 細胞，依次進行甲醇固定及結晶紫染色，選取 5 個視野觀察計數。② 遷移實驗：除上室未被 Matrigel 膠所包被之外，其余步驟與侵襲實驗相同。
1.3.7 Western blot 法檢測 SW480 細胞中與增殖（c-Myc、 cyclinD1） 、侵襲和遷移（MMP9、 MMP2）、上皮間充質轉化（Vimentin、N-cadherin、E-cadherin）及 Notch 通路（Notch-1、Hes-1）相關蛋白的表達情況
RIPA 裂解液裂解各組細胞后提取總蛋白，經 BCA 法檢測總蛋白含量；取上樣緩沖液與蛋白混勻后 100 ℃ 進行 5 min 變性，以每孔 40 μg 的量進行 SDS-PAGE 凝膠電泳（重復 5 孔），低溫轉移蛋白至 PVDF 膜上，5% 的脫脂奶粉封閉（1 h）后加入一抗（1∶1 000）孵育（4 ℃）過夜，次日早晨加入二抗（1∶3 000）孵育2 h后ECL 進行顯色，蛋白凝膠成像儀觀察，半定量分析各蛋白含量[8]。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 23.0 統計學軟件進行數據分析，柱狀圖采用 Origin軟件進行制作。對于符合正態分布的計量數據用均數±標準差（±s）進行描述，2 組間比較采用配對 t 檢驗；多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK-q 檢驗，檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 FOXA1 在結腸癌組織和結腸癌細胞中的表達情況
2.1.1 FOXA1 蛋白表達
免疫組織化學法檢測 FOXA1 蛋白陽性表達定位于細胞核，見圖 1a、1b。定量結果顯示，FOXA1 蛋白表達水平在結腸癌組織及其相應的癌旁組織中分別為 0.085±0.028 和 0.034±0.010，前者高于后者（t=11.036，P<0.001）。
圖1
示主要結果圖片
a、b：FOXA1 蛋白在結腸癌組織（a）及其相應的癌旁組織（b）中的表達情況（Envision法 ×100）。c~f：對照組（c）、shRNA-NC 組（d）、sh-FOXA1 組（e）、sh-FOXA1+丙戊酸鈉組（f）SW480 細胞克隆形成能力。g：FOXA1 對 SW480 細胞增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力的影響（與對照組和 shRNA-NC 組比較，*
2.1.2 FOXA1 mRNA 表達
結果見表 1。從表 1 可見，FOXA1 mRNA 表達水平在結腸癌組織中高于其相應的癌旁組織（t=11.671，P<0.001）；在細胞實驗中發現，FOXA1 mRNA 在 sh-FOXA1 組中的表達水平低于對照組（t=5.442，P=0.001）和 shRNA-NC 組（t=5.951，P<0.001），而其在對照組和 shRNA-NC 組間比較差異無統計學意義（t=0.349，P=0.736），其在 sh-FOXA1+丙戊酸鈉組和 sh-FOXA1 組間比較差異無統計學意義（t=0.099，P=0.924）。
表1
FOXA1 mRNA在結腸組織和細胞中的表達情況（）
2.2 FOXA1 對 SW480 細胞活力、克隆形成、侵襲和遷移能力的影響
FOXA1 對 SW480 細胞克隆形成能力的影響可見紫色細胞集落，見圖 1c~1f。細胞存活率（F=38.005，P<0.001）、克隆細胞數（F=26.284，P<0.001）、遷移細胞數（F=8.088，P=0.002）、侵襲細胞數（F=15.758，P<0.001）在 4 組間總體比較差異均有統計學意義，這些指標在 sh-FOXA1 組均低于對照組（P<0.05）和 shRNA-NC 組（P<0.05），sh-FOXA1+丙戊酸鈉組均高于 sh-FOXA1 組（P<0.05）且與其他組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 1g。
2.3 Western blot 法檢測各組 SW480 細胞中的蛋白表達情況
Western blot 法檢測各組 SW480 細胞中蛋白表達的定性結果見圖 1h~1k，半定量結果見圖 1l。4 組 SW480 細胞中的 c-Myc（F=12.627，P<0.001）、cyclinD1（F=9.164，P<0.001）、MMP9（F=11.271，P<0.001）、MMP2（F=7.656，P=0.002）、E-cadherin（F=26.645，P<0.001）、Vimentin（F=11.923，P<0.001）、N-cadherin（F=9.812，P=0.001）、Notch-1（F=8.605，P=0.001）、Hes-1（F=10.529，P<0.001）蛋白表達情況在 4 組間總體比較差異均有統計學意義。與對照組和 shRNA-NC 組相比，沉默 FOXA1 表達后即sh-FOXA1 組細胞中與增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力及通路有關的蛋白 c-Myc、cyclinD1、MMP9、MMP2、Vimentin、N-cadherin、Notch-1、Hes-1 蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）、E-cadherin 蛋白表達水平明顯升高（P<0.05）；加入 Notch 通路激活劑丙戊酸鈉后即 sh-FOXA1+丙戊酸鈉組這些蛋白表達水平較之 sh-FOXA1 組發生相應的逆轉（P<0.05）。
3 討論
結腸癌是世界范圍內惡性腫瘤相關死亡的主要原因之一。隨著人們生活方式的改變，結腸癌的發病率逐年增加，飲酒、肥胖、吸煙、糖尿病等均被認為是其發生的危險因素，但結腸癌的發生機制仍不清楚[9-11]。結腸癌具有的高侵襲性和轉移性是其治療的主要障礙。目前結腸癌的有效治療手段是放射和（或）化學治療及手術，但對于晚期結腸癌患者的療效不佳，因此有必要尋找新的治療方法以提高患者存活率及延長生存期[10, 12-14]。
FOXA1 作為一種轉錄因子，與胚胎發育及上皮分化密切相關。有研究[3, 7, 15-16]表明，FOXA1 參與腫瘤的發生和發展，調節包括細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移在內的一系列生物學過程。FOXA1 在直腸癌、子宮內膜癌等惡性腫瘤中異常高表達，并且還影響大量與代謝過程和細胞周期調控相關的基因表達[7, 17-18]。有研究[19]發現，miR-760 靶向抑制 FOXA1 表達可抑制宮頸鱗狀細胞癌 SiHa 細胞的增殖、侵襲和遷移以及上皮間質轉化進程。上皮間質轉化與癌細胞浸潤有關，其給予癌細胞持續侵襲的能力，是腫瘤轉變為惡性的重要環節之一，在該過程中 E-cadherin 表達異常降低，而 Vimentin 和N-cadherin 表達異常增加，抑制 Vimentin 和 N-cadherin 表達或增加 E-cadherin 表達可抑制上皮間質轉化[2, 20-21]。在結腸癌細胞中，FOXA1 的表達異常增加，沉默其表達可通過抑制人第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物/蛋白激酶信號通路抑制癌細胞增殖、集落形成、侵襲和遷移能力[3]。c-Myc、cyclinD1 作為常見的增殖相關蛋白，抑制其表達可抑制腫瘤的增殖，而 MMP9、MMP2 與腫瘤的侵襲密切相關，促進二者表達，可促進腫瘤的侵襲和遷移[3]。在本研究中發現，臨床病例結腸癌組織中 FOXA1 蛋白表達水平較其相應的癌旁組織中增高；此外，在細胞實驗中發現，通過 sh-FOXA1 轉染 SW480 細胞后，sh-FOXA1 組的細胞存活率、克隆細胞數、侵襲和遷移細胞數、c-Myc、cyclinD1、MMP9、MMP2、Vimentin、N-cadherin蛋白表達水平均降低（P<0.05），E-cadherin 表達水平增高（P<0.05）。與前人研究[3]結果基本一致。結果提示，FOXA1 可能參與結腸癌的發生和發展，沉默其表達可抑制癌細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化進程。
Notch 是單個跨膜蛋白，當 Notch 與相鄰細胞的配體結合時可被激活。近年來有證據[22-25]表明，Notch 異常激活與腫瘤進程有關。Notch1的激活是導致上皮間質轉化發生的重要原因，Jagged1介導的Notch1激活會誘導Snail表達，抑制E-cadherin 表達，最終導致上皮間質轉化的發生[22, 26]。Notch1 及其分子靶點 Hes-1 在晚期結腸腫瘤中的表達水平顯著高于早期腫瘤[22]。Notch 通路激活可促進結腸癌的發生、維持及轉移[26]。有研究[7]發現，FOXA1 通過促進雄激素受體表達來促進子宮內膜癌細胞的增殖并激活 Notch 信號通路。在本研究中發現，與對照組相比，sh-FOXA1 組 Notch1 和 Hes-1 表達水平顯著降低；與 sh-FOXA1 組相比，sh-FOXA1+丙戊酸鈉組細胞存活率、克隆細胞數、侵襲和遷移細胞數、c-Myc、cyclinD1、MMP9、MMP2、Vimentin、N-cadherin、Notch-1和 Hes-1蛋白表達水平均增高（P<0.05），E-cadherin蛋白表達水平降低（P<0.05）。該結果提示，FOXA1 表達沉默對結腸癌細胞增殖、侵襲、遷移及上皮間質轉化的抑制作用可能與其抑制 Notch通路有關，而Notch激活可逆轉FOXA1表達沉默對腫瘤的抑制作用。
綜上所述，沉默FOXA1表達可能通過抑制Notch通路來抑制結腸癌細胞增殖、侵襲、遷移及上皮間質轉化進程。本研究結果可能為結腸癌治療機制的研究提供一定的數據參考，但在未來的研究中，還需對 FOXA1調控Notch通路的下游機制進行深入探究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉可峰、范永剛完成實驗設計；王偉、于英杰進行實驗、收集數據并做統計分析；劉可峰、于英杰、王偉、范永剛和于英杰共同完成論文寫作。
倫理聲明：本研究通過了河南科技大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（批文編號：2019-06-L29）。
