引用本文： 劉傳緒, 鑒謐, 姚增武, 胡金晨, 崔洪銘, 于彬, 趙揚, 姜立新. 長鏈非編碼 RNA H19、HOTTIP 預測可切除局部進展期胃癌新輔助化療療效的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(1): 59-66. doi: 10.7507/1007-9424.202105019 復制
胃癌是最常見的惡行腫瘤之一，居惡性腫瘤死亡原因的第 3 位，早期無明顯癥狀，發現時往往已經是中晚期，5 年生存率低于 30%[1]。我國的局部進展期胃癌占比超過 70%，亟需提高中國胃癌整體 5 年生存率[2-3]，如何降低這部分患者的復發率和轉移率、延長其術后生存時間是所有普外科醫師需要共同面對的一個難題。現有的胃癌診斷和預后生物標志物的靈敏度和特異度較低，尋求新的腫瘤標志物成了提高胃癌診斷率的關鍵[4]。有研究[5-8]表明，部分長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在腫瘤細胞中高表達且可以分泌到外周血中，外周血中的 lncRNA 可能是胃癌潛在的腫瘤標志物，其診斷價值可能比傳統腫瘤標志物要高。目前已有研究[9-11]報道，H19、HOTTIP 可能與胃癌的發生、進展及耐藥有關，并且能夠在外周血中出現差異性表達。但目前尚未明確外周血中的 H19 和 HOTTIP 是否能夠作為一種非侵入性指標預測新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）的療效。近些年來NAC取得了重大進展，為胃癌患者尤其是進展期胃癌患者提供了更好的治療方案，改善了患者手術預后[12]。決定是否行 NAC 和 NAC 用藥取決于患者對化療的敏感性和化療效果，本研究通過檢測患者治療前后血漿中 H19、HOTTIP 的表達水平情況，以分析 H19、HOTTIP 對胃癌的診斷及其對 NAC 治療效果的預測價值。
1 資料與方法
1.1 納入和排除標準
本研究前瞻性納入 2020 年 8 月至 2021 年 5 月期間于青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院就診的胃癌患者和胃良性疾病患者如胃息肉、胃良性腫瘤等，每組均 40 例患者，均已簽署受試者知情同意書。納入標準：① T3～4aN+M0 期需行 NAC 治療的胃癌患者；② 均經胃鏡檢查并經病理組織學活檢結果確診為胃癌；③ 入院前未行任何治療；④ 既往無其他惡性腫瘤史；⑤ 臨床病理資料完整者。排除標準：① 行放射、免疫、生物等治療者；② 合并其他系統惡性腫瘤或癌前病變；③ 既往有其他腫瘤病史；④ 復發后再治療及非腫瘤因素死亡的患者；⑤ 合并有炎癥患者；⑥ 臨床病理資料不全。
1.2 方法
1.2.1 治療
NAC 治療前完善胃鏡、超聲、多層螺旋 CT 或磁共振等檢查，同時檢測患者血漿中的 H19、HOTTIP 表達水平。化療方案為 CAPEOX 方案：卡培他濱（1 000 mg/m2，口服，2 次/d，持續2 周）+奧沙利鉑（130 mg/m2，靜脈滴注，第 1 天），間隔 1 周，即每 3 周為 1 個周期。完成 2 個及以上周期 NAC 治療后再次檢測患者血漿中的 H19、HOTTIP 表達水平，同時行胃鏡、超聲、多層螺旋 CT 或磁共振等檢查評估，并根據 RECIST 1.1 評分標準對 NAC 療效進行評估[13]，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩定（SD）、疾病進展（PD），將CR和PR歸為客觀緩解，CR、PR和SD歸為疾病控制。對于客觀緩解的患者均直接行腹腔鏡下胃癌根治術，SD的患者繼續行1～2周期化療方案后再次評估患者考慮是否行手術處理或直接行胃癌根治術，PD患者繼續化療或行姑息性手術。
1.2.2 H19、HOTTIP 檢測方法
于清晨空腹狀態下收集患者靜脈血，將其放于 EDTA 管中并在 2 h 內于離心機中離心（4 000×g）20 min，離心完成后取其血漿于凍存管中立即放置于–80 ℃ 環境中儲存。采用 HiPure Serum/Plasma miRNA Kit 試劑盒并用硅基質吸附柱法從人血漿組織樣本中抽提 RNA，采用 BeyoRT? cDNA 第一鏈合成試劑盒（RNase H–）對所提取的 RNA 進行逆轉錄處理，采用 BeyoFast? SYBR Green qPCR Mix 進行熒光定量 PCR。H19 的正向引物為 5′-CCACCACCTCCCTCTTCTTC-3′，反向引物為 5′-GCCGTCTCCACAACTCCAA-3′，擴增片段長度為 169 bp；HOTTIP 的正向引物為 5′-TTCCTGCCTTCCCCTCAA-3′，反向引物為 5′-CAGCACCAACACCCTACCAT-3′，擴增片段長度為 142 bp；內參 GAPDH 的正向引物為 5′-TCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，反向引物為 5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′，擴增片段長度為 118 bp。采用 2–ΔΔCt法（Livak 法）計算血漿中 H19 和 HOTTIP 的相對表達量。
1.3 收集資料
① 人口學資料：年齡、性別；② 臨床病理資料：腫瘤的位置、分化程度（參照日本《胃癌處理規約》第 15 版規定）、浸潤深度、淋巴結轉移、外周血中的癌胚抗原（CEA）、CA19-9、CA724、CA125 的表達水平等。
1.4 統計學方法
采用 IBM SPSS 25.0 統計軟件對數據進行分析。采用 Kolmogornov-Smirnov 對計量數據進行正態分布檢驗，符合正態分布數據以均數±標準差（
±s）表示并用配對t檢驗，偏態分布數據用中位數（M）和上下四分位數間距（IQR）表示并用 Mann-Whitney U 檢驗或 Kruskal-Wallis H 檢驗；計數資料采用頻數和百分率表示并采用 χ2 檢驗。采用受試者操作特征（ROC）曲線及其曲線下面積（AUC）評估 H19 和 HOTTIP 對胃癌的診斷價值。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 納入患者的基本情況
本研究共納入40例進展期胃癌患者（胃癌組），其中男27例，女13例；年齡 20～85歲、中位年齡66歲；納入40例如胃良性腫物、胃息肉等良性疾病患者（非胃癌組），其中男25例，女15例；年齡31～91歲、中位年齡61歲。2 組患者的人口學特征及治療前血漿H19和HOTTIP相對表達量及腫瘤標志物比較結果見表 1。從表 1可見，2組的性別和年齡比較差異無統計學意義（P>0.05），胃癌組患者 NAC 治療前的H19、HOTTIP相對表達量和CEA、CA19-9陽性率均高于非胃癌組（P<0.05），2組間CA724、CA125腫瘤標志物陽性率比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
表1
胃癌組與非胃癌組患者的人口學特征及 NAC 治療前血漿中 H19、HOTTIP 及腫瘤標志物情況
2.2 NAC 治療前 lncRNA 指標和腫瘤標志物診斷胃癌的價值
ROC 曲線（圖 1）評估 lncRNA 指標和腫瘤標志物診斷胃癌的價值見表 2。從表 2 可見，lncRNA 指標無論單獨或是聯合，其AUC值均>0.70，具有較好的診斷價值。腫瘤標志物僅 CA724 和 CEA+CA19-9+CA724+CA125 聯合的AUC值>0.70。
圖1
示lncRNA 指標（a）和腫瘤標志物（b）診斷胃癌的 ROC 曲線
表2
NAC 治療前lncRNA指標和腫瘤標志物對胃癌的診斷價值
2.3 NAC 治療前血漿中 lncRNA 指標與胃癌患者臨床病理特征的關系
NAC 治療前血漿中 H19 相對表達量與胃癌患者的分化程度和浸潤深度有關（P<0.05），與性別、年齡、腫瘤位置、淋巴結轉移等臨床病理因素無關（P>0.05）；血漿中 HOTTIP 相對表達量與胃癌患者性別、年齡、分化程度、腫瘤位置、浸潤深度、淋巴結轉移等臨床病理因素均無關（P>0.05）。見表 3。
表3
NAC 治療前血漿中H19、HOTTIP相對表達量與胃癌患者臨床病理特征的關系
2.4 NAC 治療效果
40 例進展期胃癌患者接受 NAC 治療后，T 降期 13 例，T 未降期 27 例；CR 1 例、PR 24 例、SD 10 例、PD 5 例，客觀緩解 25 例（62.5%）、疾病控制 35 例（87.5%）。術后病理評估結果為 CR、PR、SD 和 PD 患者 NAC 治療前后的 CT 檢查結果見圖 2。
圖2
示術后病理評估結果為 CR、PR、SD 和 PD 患者 NAC 治療前后的CT結果
a–h：分別為 CR、PR、SD 和 PD 患者 NAC 治療前（a、c、e、g）和 NAC 治療后（b、d、f、h）的情況，分別見 NAC 治療后胃癌及腫大淋巴結基本消失（b）、明顯縮小（d）、無明顯增大或縮小（f）及明顯增大（h）。圖中箭頭所指為胃癌或腫大淋巴結
2.5 NAC 治療前血漿 H19 和 HOTTIP 表達量與 NAC 治療療效的關系
在 T 降期患者中，H19 和 HOTTIP 相對表達量均分別低于 T 未降期患者 ［H19：Z=–2.960、P=0.002，HOTTIP：Z=–2.310、P=0.019］。H19 和 HOTTIP 的相對表達量在 CR、PR、SD、PD 患者中依次遞增（H19：H=23.524，P<0.001；HOTTIP：H=16.686，P=0.001），即在療效較好的患者中 H19 和 HOTTIP 的相對表達量較低，在療效較差的患者中 H19 和 HOTTIP 的相對表達量較高。見表 4。
表4
NAC 前血漿 H19 和 HOTTIP 相對表達量與 NAC 療效的關系
2.6 NAC 治療后胃癌患者血漿中 H19 和 HOTTIP 的表達量以及其 NAC 治療前后表達量變化的差值
40例進展期胃癌患者NAC治療后血漿中H19和HOTTIP相對表達量分別為1.12（0.40）和1.30（0.67），均分別低于NAC治療前 ［分別為 1.42（0.64）、2.15（1.48），Z=–3.965、P<0.001；Z=–4.839、P<0.001］，二者在 NAC 治療前后變化情況見圖 3a、3b。NAC 治療前后胃癌患者血漿中 H19 和 HOTTIP 相對表達量變化量在 T 降期和 T 未降期患者中比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 3c、3d；二者在疾病控制患者和 PD 患者中比較差異亦無統計學意義（P>0.05），見圖 3e、3f。
圖3
NAC 治療前后胃癌患者血漿中 H19 和 HOTTIP 的表達量變化情況
a、b：H19（a）和 HOTTIP（b）在胃癌患者中NAC治療前后的變化情況；c、d：H19（c）和 HOTTIP（d）在T降期和T未降期患者中的變化量；e、f：H19（e）和 HOTTIP（f）在疾病控制和PD患者中的變化量
3 討論
我國的進展期胃癌占大多數[2]。對進展期胃癌而言，單純手術效果較差，對其采用 NAC 治療可以使腫瘤縮小、降低腫瘤分期、減少脈管癌栓和神經浸潤，為手術治療選擇提供機會，可減少術后并發癥發生和縮短住院時間[14]。但是 NAC 治療的療效因個體差異而不同，與胃癌患者的病情及不同臨床病理因素有關[15]，亟需探索預測 NAC 治療效果的客觀指標。
已有研究[16-17]發現，許多 lncRNA 可能參與了多種腫瘤的化療耐藥性。lncRNA 是一類長度>200 nt、缺乏開放閱讀框、具有調節功能的非編碼 RNA。有研究[5, 18]發現，lncRNA 從多種途徑參與調節基因的表達，與腫瘤的發生與發展有密切關系。另外，lncRNA 不僅在腫瘤細胞中表達，還能從腫瘤細胞中分泌到循環系統中從而在外周血中表現出來，這就使得 lncRNA 作為腫瘤的診斷和檢測病情變化的標志物成為可能[19-20]。目前已有研究[21-23]發現，lncRNA H19 和 HOTTIP 可在多種腫瘤患者的外周血中表達上調，其中 H19 位于染色體 11p15.5上，不僅在生長發育方面起重要的調節作用，同時其在腫瘤細胞的侵襲和轉移方面可能也具有調節作用[21]；HOTTIP 位于 7 號染色體上，是從 HOXA 簇的 5′ 末端轉錄，與多種腫瘤有密切的關系[22-23]。多項研究[24-28]已經表明 H19 和 HOTTIP 與腫瘤密切相關，其表達水平的高低可能與多種腫瘤組織的分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移相關，而且 H19 和 HOTTIP 可能通過多種途徑參與腫瘤的致病機制，可能還是結腸癌、胰腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的潛在腫瘤標志物。目前也有較多的研究[6-8, 29-32]在胃癌患者的外周血中發現了lncRNA H19和 HOTTIP表達且指出其可能與胃癌的發生、發展及化療耐藥相關，其可能成為胃癌的一種潛在腫瘤標志物[31-32]。基于已發表的文獻研究，本研究探討了血漿中 H19 和 HOTTIP 表達情況對胃癌的診斷價值及其對 NAC 治療效果的預測意義。
本研究中檢測了 NAC 治療前胃癌患者和胃良性疾病患者外周血中 H19 和 HOTTIP 相對表達量，結果發現，NAC治療前二者的相對表達量在胃癌中均高于胃良性疾病患者（P<0.05），結果提示，其可能具有區分胃癌和胃良性疾病的作用。為此，本研究采用 ROC 曲線分析血漿中 H19 和 HOTTIP 相對表達量對胃癌的診斷價值，同時評估傳統腫瘤標志物 CEA、CA19-9、CA724、CA125 等對胃癌的診斷價值，結果發現，H19 和 HOTTIP 的 AUC 值高于 CEA、CA19-9、CA724、CA125 的 AUC 值，H19 和 HOTTIP 作為診斷胃癌的價值可能優于這些傳統的腫瘤標志物，同時本研究還進一步研究了 H19 和 HOTTIP 的聯合診斷價值，發現其價值要高于 CEA、CA19-9、CA724、CA125 聯合對胃癌的診斷價值。結果提示，H19 和 HOTTIP 可能是胃癌的潛在腫瘤標志物。但本研究的胃癌患者均為進展期胃癌，尚未納入早期胃癌，有待納入早期胃癌患者進行探討。
分析 NAC 治療后不同療效反應患者 NAC 治療前血漿中 H19 和 HOTTIP 的相對表達量，結果發現，NAC 治療后 T 降期和疾病控制患者 NAC 治療前血漿中 H19 和 HOTTIP 的相對表達量要低于 T 未降期和PD患者。換句話說，在接受 NAC 治療前，患者血漿中 H19 和 HOTTIP 相對表達量較低的患者可能要比血漿中 H19 和 HOTTIP 相對表達量較高的患者對 NAC 治療更敏感。有不少研究[29, 33-36]已經表明，H19 和 HOTTIP 可能通過多種途徑參與腫瘤的化療耐藥，且皆表明高表達的 H19 和 HOTTIP 可導致腫瘤化療耐藥，但其參與化療耐藥的途徑尚待進一步去探索。
此外，H19 和 HOTTIP 還能從腫瘤細胞中分泌到外周血中[19-20]。在本研究中通過檢測 NAC 治療前外周血中 H19 和 HOTTIP 相對表達量發現，二者較高的患者 NAC 的療效不如 H19 和 HOTTIP 相對表達量較低的患者；然后進一步檢測了胃癌患者 NAC 前后 H19 和 HOTTIP 在外周血中相對表達水平的變化情況，結果發現，化療后兩種 lncRNA 的變化趨勢較化療前總體是下降的，但二者的變化量在 T 降期和T未降期以及疾病控制或PD患者之間比較差異未見統計學意義，結果提示，如果通過監測胃癌患者血漿中 2 種 lncRNA H19和HOTTIP的表達水平在 NAC 治療前后的變化值來判斷 NAC 的療效還不確定，其原因也可能與本研究所納入樣本量較少也有關系，有待擴大樣本量進一步探索這2種 lncRNA 化療前后變化的意義。
另外，也有研究[9, 37-38]表明，H19 和 HOTTIP 高表達與胃癌的入侵深度、淋巴結轉移和 TNM 分期、腫瘤大小顯著相關。在本研究中發現，NAC 治療前血漿中 H19 的表達水平與腫瘤的浸潤深度和腫瘤分化程度有關（P<0.05），但未發現 HOTTIP 與胃癌患者其他臨床病理特征有關（P>0.05），其原因可能與樣本量較少及個體差異有關，需要更大的樣本量進行進一步的研究分析。
總之，由于外周血腫瘤標志物具有易獲得、非侵入性等特點，可以幫助區分胃癌患者和胃良性疾病患者，也可以在 NAC 治療前幫助判斷患者對化療的耐藥性及預測化療的效果，進而判斷患者預后。但由于本研究樣本量較少，并且本研究中的選擇偏差可能會影響本研究結果，需要大規模、多中心的研究來進一步闡明 H19 和 HOTTIP 對 NAC 療效的預測作用，同時也需要使用動物或細胞模型進行進一步的實驗研究，以探索 H19 和 HOTTIP 參與胃癌發生、發展及化療耐藥的機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉傳緒收集樣本進行檢測并撰寫文章；姜立新進行文章寫作指導；鑒謐、姚增武、胡金晨、崔洪銘、于彬及趙揚對試驗進行協助并收集相關文獻。
倫理聲明：本研究通過了煙臺毓璜頂醫院醫學倫理委員會審批（批文編號：2020-292）。
胃癌是最常見的惡行腫瘤之一，居惡性腫瘤死亡原因的第 3 位，早期無明顯癥狀，發現時往往已經是中晚期，5 年生存率低于 30%[1]。我國的局部進展期胃癌占比超過 70%，亟需提高中國胃癌整體 5 年生存率[2-3]，如何降低這部分患者的復發率和轉移率、延長其術后生存時間是所有普外科醫師需要共同面對的一個難題。現有的胃癌診斷和預后生物標志物的靈敏度和特異度較低，尋求新的腫瘤標志物成了提高胃癌診斷率的關鍵[4]。有研究[5-8]表明，部分長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在腫瘤細胞中高表達且可以分泌到外周血中，外周血中的 lncRNA 可能是胃癌潛在的腫瘤標志物，其診斷價值可能比傳統腫瘤標志物要高。目前已有研究[9-11]報道，H19、HOTTIP 可能與胃癌的發生、進展及耐藥有關，并且能夠在外周血中出現差異性表達。但目前尚未明確外周血中的 H19 和 HOTTIP 是否能夠作為一種非侵入性指標預測新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）的療效。近些年來NAC取得了重大進展，為胃癌患者尤其是進展期胃癌患者提供了更好的治療方案，改善了患者手術預后[12]。決定是否行 NAC 和 NAC 用藥取決于患者對化療的敏感性和化療效果，本研究通過檢測患者治療前后血漿中 H19、HOTTIP 的表達水平情況，以分析 H19、HOTTIP 對胃癌的診斷及其對 NAC 治療效果的預測價值。
1 資料與方法
1.1 納入和排除標準
本研究前瞻性納入 2020 年 8 月至 2021 年 5 月期間于青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院就診的胃癌患者和胃良性疾病患者如胃息肉、胃良性腫瘤等，每組均 40 例患者，均已簽署受試者知情同意書。納入標準：① T3～4aN+M0 期需行 NAC 治療的胃癌患者；② 均經胃鏡檢查并經病理組織學活檢結果確診為胃癌；③ 入院前未行任何治療；④ 既往無其他惡性腫瘤史；⑤ 臨床病理資料完整者。排除標準：① 行放射、免疫、生物等治療者；② 合并其他系統惡性腫瘤或癌前病變；③ 既往有其他腫瘤病史；④ 復發后再治療及非腫瘤因素死亡的患者；⑤ 合并有炎癥患者；⑥ 臨床病理資料不全。
1.2 方法
1.2.1 治療
NAC 治療前完善胃鏡、超聲、多層螺旋 CT 或磁共振等檢查，同時檢測患者血漿中的 H19、HOTTIP 表達水平。化療方案為 CAPEOX 方案：卡培他濱（1 000 mg/m2，口服，2 次/d，持續2 周）+奧沙利鉑（130 mg/m2，靜脈滴注，第 1 天），間隔 1 周，即每 3 周為 1 個周期。完成 2 個及以上周期 NAC 治療后再次檢測患者血漿中的 H19、HOTTIP 表達水平，同時行胃鏡、超聲、多層螺旋 CT 或磁共振等檢查評估，并根據 RECIST 1.1 評分標準對 NAC 療效進行評估[13]，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩定（SD）、疾病進展（PD），將CR和PR歸為客觀緩解，CR、PR和SD歸為疾病控制。對于客觀緩解的患者均直接行腹腔鏡下胃癌根治術，SD的患者繼續行1～2周期化療方案后再次評估患者考慮是否行手術處理或直接行胃癌根治術，PD患者繼續化療或行姑息性手術。
1.2.2 H19、HOTTIP 檢測方法
于清晨空腹狀態下收集患者靜脈血，將其放于 EDTA 管中并在 2 h 內于離心機中離心（4 000×g）20 min，離心完成后取其血漿于凍存管中立即放置于–80 ℃ 環境中儲存。采用 HiPure Serum/Plasma miRNA Kit 試劑盒并用硅基質吸附柱法從人血漿組織樣本中抽提 RNA，采用 BeyoRT? cDNA 第一鏈合成試劑盒（RNase H–）對所提取的 RNA 進行逆轉錄處理，采用 BeyoFast? SYBR Green qPCR Mix 進行熒光定量 PCR。H19 的正向引物為 5′-CCACCACCTCCCTCTTCTTC-3′，反向引物為 5′-GCCGTCTCCACAACTCCAA-3′，擴增片段長度為 169 bp；HOTTIP 的正向引物為 5′-TTCCTGCCTTCCCCTCAA-3′，反向引物為 5′-CAGCACCAACACCCTACCAT-3′，擴增片段長度為 142 bp；內參 GAPDH 的正向引物為 5′-TCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，反向引物為 5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′，擴增片段長度為 118 bp。采用 2–ΔΔCt法（Livak 法）計算血漿中 H19 和 HOTTIP 的相對表達量。
1.3 收集資料
① 人口學資料：年齡、性別；② 臨床病理資料：腫瘤的位置、分化程度（參照日本《胃癌處理規約》第 15 版規定）、浸潤深度、淋巴結轉移、外周血中的癌胚抗原（CEA）、CA19-9、CA724、CA125 的表達水平等。
1.4 統計學方法
采用 IBM SPSS 25.0 統計軟件對數據進行分析。采用 Kolmogornov-Smirnov 對計量數據進行正態分布檢驗，符合正態分布數據以均數±標準差（±s）表示并用配對t檢驗，偏態分布數據用中位數（M）和上下四分位數間距（IQR）表示并用 Mann-Whitney U 檢驗或 Kruskal-Wallis H 檢驗；計數資料采用頻數和百分率表示并采用 χ2 檢驗。采用受試者操作特征（ROC）曲線及其曲線下面積（AUC）評估 H19 和 HOTTIP 對胃癌的診斷價值。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 納入患者的基本情況
本研究共納入40例進展期胃癌患者（胃癌組），其中男27例，女13例；年齡 20～85歲、中位年齡66歲；納入40例如胃良性腫物、胃息肉等良性疾病患者（非胃癌組），其中男25例，女15例；年齡31～91歲、中位年齡61歲。2 組患者的人口學特征及治療前血漿H19和HOTTIP相對表達量及腫瘤標志物比較結果見表 1。從表 1可見，2組的性別和年齡比較差異無統計學意義（P>0.05），胃癌組患者 NAC 治療前的H19、HOTTIP相對表達量和CEA、CA19-9陽性率均高于非胃癌組（P<0.05），2組間CA724、CA125腫瘤標志物陽性率比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
表1
胃癌組與非胃癌組患者的人口學特征及 NAC 治療前血漿中 H19、HOTTIP 及腫瘤標志物情況
2.2 NAC 治療前 lncRNA 指標和腫瘤標志物診斷胃癌的價值
ROC 曲線（圖 1）評估 lncRNA 指標和腫瘤標志物診斷胃癌的價值見表 2。從表 2 可見，lncRNA 指標無論單獨或是聯合，其AUC值均>0.70，具有較好的診斷價值。腫瘤標志物僅 CA724 和 CEA+CA19-9+CA724+CA125 聯合的AUC值>0.70。
圖1
示lncRNA 指標（a）和腫瘤標志物（b）診斷胃癌的 ROC 曲線
表2
NAC 治療前lncRNA指標和腫瘤標志物對胃癌的診斷價值
2.3 NAC 治療前血漿中 lncRNA 指標與胃癌患者臨床病理特征的關系
NAC 治療前血漿中 H19 相對表達量與胃癌患者的分化程度和浸潤深度有關（P<0.05），與性別、年齡、腫瘤位置、淋巴結轉移等臨床病理因素無關（P>0.05）；血漿中 HOTTIP 相對表達量與胃癌患者性別、年齡、分化程度、腫瘤位置、浸潤深度、淋巴結轉移等臨床病理因素均無關（P>0.05）。見表 3。
表3
NAC 治療前血漿中H19、HOTTIP相對表達量與胃癌患者臨床病理特征的關系
2.4 NAC 治療效果
40 例進展期胃癌患者接受 NAC 治療后，T 降期 13 例，T 未降期 27 例；CR 1 例、PR 24 例、SD 10 例、PD 5 例，客觀緩解 25 例（62.5%）、疾病控制 35 例（87.5%）。術后病理評估結果為 CR、PR、SD 和 PD 患者 NAC 治療前后的 CT 檢查結果見圖 2。
圖2
示術后病理評估結果為 CR、PR、SD 和 PD 患者 NAC 治療前后的CT結果
a–h：分別為 CR、PR、SD 和 PD 患者 NAC 治療前（a、c、e、g）和 NAC 治療后（b、d、f、h）的情況，分別見 NAC 治療后胃癌及腫大淋巴結基本消失（b）、明顯縮小（d）、無明顯增大或縮小（f）及明顯增大（h）。圖中箭頭所指為胃癌或腫大淋巴結
2.5 NAC 治療前血漿 H19 和 HOTTIP 表達量與 NAC 治療療效的關系
在 T 降期患者中，H19 和 HOTTIP 相對表達量均分別低于 T 未降期患者 ［H19：Z=–2.960、P=0.002，HOTTIP：Z=–2.310、P=0.019］。H19 和 HOTTIP 的相對表達量在 CR、PR、SD、PD 患者中依次遞增（H19：H=23.524，P<0.001；HOTTIP：H=16.686，P=0.001），即在療效較好的患者中 H19 和 HOTTIP 的相對表達量較低，在療效較差的患者中 H19 和 HOTTIP 的相對表達量較高。見表 4。
表4
NAC 前血漿 H19 和 HOTTIP 相對表達量與 NAC 療效的關系
2.6 NAC 治療后胃癌患者血漿中 H19 和 HOTTIP 的表達量以及其 NAC 治療前后表達量變化的差值
40例進展期胃癌患者NAC治療后血漿中H19和HOTTIP相對表達量分別為1.12（0.40）和1.30（0.67），均分別低于NAC治療前 ［分別為 1.42（0.64）、2.15（1.48），Z=–3.965、P<0.001；Z=–4.839、P<0.001］，二者在 NAC 治療前后變化情況見圖 3a、3b。NAC 治療前后胃癌患者血漿中 H19 和 HOTTIP 相對表達量變化量在 T 降期和 T 未降期患者中比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 3c、3d；二者在疾病控制患者和 PD 患者中比較差異亦無統計學意義（P>0.05），見圖 3e、3f。
圖3
NAC 治療前后胃癌患者血漿中 H19 和 HOTTIP 的表達量變化情況
a、b：H19（a）和 HOTTIP（b）在胃癌患者中NAC治療前后的變化情況；c、d：H19（c）和 HOTTIP（d）在T降期和T未降期患者中的變化量；e、f：H19（e）和 HOTTIP（f）在疾病控制和PD患者中的變化量
3 討論
我國的進展期胃癌占大多數[2]。對進展期胃癌而言，單純手術效果較差，對其采用 NAC 治療可以使腫瘤縮小、降低腫瘤分期、減少脈管癌栓和神經浸潤，為手術治療選擇提供機會，可減少術后并發癥發生和縮短住院時間[14]。但是 NAC 治療的療效因個體差異而不同，與胃癌患者的病情及不同臨床病理因素有關[15]，亟需探索預測 NAC 治療效果的客觀指標。
已有研究[16-17]發現，許多 lncRNA 可能參與了多種腫瘤的化療耐藥性。lncRNA 是一類長度>200 nt、缺乏開放閱讀框、具有調節功能的非編碼 RNA。有研究[5, 18]發現，lncRNA 從多種途徑參與調節基因的表達，與腫瘤的發生與發展有密切關系。另外，lncRNA 不僅在腫瘤細胞中表達，還能從腫瘤細胞中分泌到循環系統中從而在外周血中表現出來，這就使得 lncRNA 作為腫瘤的診斷和檢測病情變化的標志物成為可能[19-20]。目前已有研究[21-23]發現，lncRNA H19 和 HOTTIP 可在多種腫瘤患者的外周血中表達上調，其中 H19 位于染色體 11p15.5上，不僅在生長發育方面起重要的調節作用，同時其在腫瘤細胞的侵襲和轉移方面可能也具有調節作用[21]；HOTTIP 位于 7 號染色體上，是從 HOXA 簇的 5′ 末端轉錄，與多種腫瘤有密切的關系[22-23]。多項研究[24-28]已經表明 H19 和 HOTTIP 與腫瘤密切相關，其表達水平的高低可能與多種腫瘤組織的分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移相關，而且 H19 和 HOTTIP 可能通過多種途徑參與腫瘤的致病機制，可能還是結腸癌、胰腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的潛在腫瘤標志物。目前也有較多的研究[6-8, 29-32]在胃癌患者的外周血中發現了lncRNA H19和 HOTTIP表達且指出其可能與胃癌的發生、發展及化療耐藥相關，其可能成為胃癌的一種潛在腫瘤標志物[31-32]。基于已發表的文獻研究，本研究探討了血漿中 H19 和 HOTTIP 表達情況對胃癌的診斷價值及其對 NAC 治療效果的預測意義。
本研究中檢測了 NAC 治療前胃癌患者和胃良性疾病患者外周血中 H19 和 HOTTIP 相對表達量，結果發現，NAC治療前二者的相對表達量在胃癌中均高于胃良性疾病患者（P<0.05），結果提示，其可能具有區分胃癌和胃良性疾病的作用。為此，本研究采用 ROC 曲線分析血漿中 H19 和 HOTTIP 相對表達量對胃癌的診斷價值，同時評估傳統腫瘤標志物 CEA、CA19-9、CA724、CA125 等對胃癌的診斷價值，結果發現，H19 和 HOTTIP 的 AUC 值高于 CEA、CA19-9、CA724、CA125 的 AUC 值，H19 和 HOTTIP 作為診斷胃癌的價值可能優于這些傳統的腫瘤標志物，同時本研究還進一步研究了 H19 和 HOTTIP 的聯合診斷價值，發現其價值要高于 CEA、CA19-9、CA724、CA125 聯合對胃癌的診斷價值。結果提示，H19 和 HOTTIP 可能是胃癌的潛在腫瘤標志物。但本研究的胃癌患者均為進展期胃癌，尚未納入早期胃癌，有待納入早期胃癌患者進行探討。
分析 NAC 治療后不同療效反應患者 NAC 治療前血漿中 H19 和 HOTTIP 的相對表達量，結果發現，NAC 治療后 T 降期和疾病控制患者 NAC 治療前血漿中 H19 和 HOTTIP 的相對表達量要低于 T 未降期和PD患者。換句話說，在接受 NAC 治療前，患者血漿中 H19 和 HOTTIP 相對表達量較低的患者可能要比血漿中 H19 和 HOTTIP 相對表達量較高的患者對 NAC 治療更敏感。有不少研究[29, 33-36]已經表明，H19 和 HOTTIP 可能通過多種途徑參與腫瘤的化療耐藥，且皆表明高表達的 H19 和 HOTTIP 可導致腫瘤化療耐藥，但其參與化療耐藥的途徑尚待進一步去探索。
此外，H19 和 HOTTIP 還能從腫瘤細胞中分泌到外周血中[19-20]。在本研究中通過檢測 NAC 治療前外周血中 H19 和 HOTTIP 相對表達量發現，二者較高的患者 NAC 的療效不如 H19 和 HOTTIP 相對表達量較低的患者；然后進一步檢測了胃癌患者 NAC 前后 H19 和 HOTTIP 在外周血中相對表達水平的變化情況，結果發現，化療后兩種 lncRNA 的變化趨勢較化療前總體是下降的，但二者的變化量在 T 降期和T未降期以及疾病控制或PD患者之間比較差異未見統計學意義，結果提示，如果通過監測胃癌患者血漿中 2 種 lncRNA H19和HOTTIP的表達水平在 NAC 治療前后的變化值來判斷 NAC 的療效還不確定，其原因也可能與本研究所納入樣本量較少也有關系，有待擴大樣本量進一步探索這2種 lncRNA 化療前后變化的意義。
另外，也有研究[9, 37-38]表明，H19 和 HOTTIP 高表達與胃癌的入侵深度、淋巴結轉移和 TNM 分期、腫瘤大小顯著相關。在本研究中發現，NAC 治療前血漿中 H19 的表達水平與腫瘤的浸潤深度和腫瘤分化程度有關（P<0.05），但未發現 HOTTIP 與胃癌患者其他臨床病理特征有關（P>0.05），其原因可能與樣本量較少及個體差異有關，需要更大的樣本量進行進一步的研究分析。
總之，由于外周血腫瘤標志物具有易獲得、非侵入性等特點，可以幫助區分胃癌患者和胃良性疾病患者，也可以在 NAC 治療前幫助判斷患者對化療的耐藥性及預測化療的效果，進而判斷患者預后。但由于本研究樣本量較少，并且本研究中的選擇偏差可能會影響本研究結果，需要大規模、多中心的研究來進一步闡明 H19 和 HOTTIP 對 NAC 療效的預測作用，同時也需要使用動物或細胞模型進行進一步的實驗研究，以探索 H19 和 HOTTIP 參與胃癌發生、發展及化療耐藥的機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉傳緒收集樣本進行檢測并撰寫文章；姜立新進行文章寫作指導；鑒謐、姚增武、胡金晨、崔洪銘、于彬及趙揚對試驗進行協助并收集相關文獻。
倫理聲明：本研究通過了煙臺毓璜頂醫院醫學倫理委員會審批（批文編號：2020-292）。
