引用本文： 羅彬予, 張琴, 張肖, 秦龍, 郭慶, 任明揚, 田云鴻. 小腸缺血再灌注損傷恢復期骨形成蛋白-4促進腸黏膜屏障恢復的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(1): 6-11. doi: 10.7507/1007-9424.202104080 復制
腸黏膜屏障是小腸缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷機體防御的重要屏障。在燒傷、休克、嚴重外科感染等應激條件下，腸黏膜屏障功能發生障礙，造成腸源性感染，進一步加重原發疾病，從而誘發全身炎癥反應綜合征，導致多器官功能衰竭[1-2]。盡管目前對腸黏膜屏障功能損傷及修復機制做了大量研究工作，但其機制仍未明確，因此，深入研究腸黏膜屏障在正常及應激條件下的調控機制將有助于提出早期預防手段、降低危重患者的病死率。在本研究團隊前期的研究[3]中發現，在急性腸 I/R 損傷時，腸黏膜上皮細胞中骨形成蛋白-4（bone morphogenetic protein-4，BMP4）可通過經典 Smad 信號通路加重腸黏膜損傷，同時發現 Notch 信號通路參與了多種組織損傷后的修復過程；在腸 I/R 損傷時，腸黏膜 Jagged1/Notch1 信號通路蛋白表達升高，抑制腸 I/R 對腸黏膜上皮細胞的損傷，參與了抑制腸 I/R 對腸黏膜屏障完整性的破壞[4-5]。本研究通過建立小鼠小腸 I/R 損傷模型，觀察在小腸 I/R 損傷恢復期時小腸黏膜上皮細胞中 BMP4 蛋白表達變化及腸黏膜絨毛損傷程度，同時觀察緊密連接蛋白、Notch 信號通路蛋白及 Smad 蛋白的變化在腸黏膜屏障功能損傷中的作用，為腸黏膜屏障功能穩定機制研究提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
重組人 BMP4 蛋白購自美國 PeproTech 公司；BMP4、外周膜蛋白（ZO-1）、occludin、Notch1、Jagged1、磷酸化-Smad6（p-Smad6）、GAPDH 抗體、山羊抗兔二抗均購自美國 BD 公司；Percoll 液和 細胞裂解液均購自上海前塵生物科技有限公司；RPMI-1640 培養基、胎牛血清、DMEM 低糖培養基購自美國 Gibco 公司；牛血清白蛋白（BSA）、胰蛋白酶購自 Sigma 公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、二喹啉甲酸分析法（BCA）蛋白定量試劑盒購自中國碧云天公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）試劑盒購自中國波爾公司；RNA 提取試劑盒、RNA 逆轉錄試劑盒購自中國 Takara 公司。
1.2 動物及手術操作
6～8 周齡 C57BL/6J 雄性小鼠 28 只，體質量 20～30 g，由川北醫學院實驗動物中心提供。采取隨機數字表法隨機抽取 24 只小鼠進行小腸 I/R 操作，余下 4 只小鼠進行假手術（SO）操作。I/R 操作主要步驟：麻醉小鼠后，從腹正中線進腹，整理小腸，找到并分離腸系膜動脈根部后用無創傷血管夾夾閉腸系膜動脈，觀察小腸顏色變白后 25 min 時松夾，繼續觀察小鼠小腸顏色變暗黑后恢復小腸血供，然后縫合并關閉腹腔。SO 操作：只進行分離而不夾閉腸系膜上動脈，在手術操作后 25 min 時處死小鼠。在實驗過程中對動物的處置遵循動物倫理學標準。由于在 I/R 刺激下空腸最為敏感，因此，取處死后的小鼠部分空腸（距屈氏韌帶約 10 cm）組織備用。
1.3 采用蘇木精-伊紅（HE）染色法評估小腸黏膜的損傷程度
分別于小腸 I/R 損傷后在 6、12、24、48 h 時間點隨機抽取 4 只小鼠處死后取小腸部分空腸組織（根據在預實驗中發現 I/R 損傷后 24 h 時的小腸黏膜損傷較 6、12 h 時間點明顯減輕而與 48 h 時間點時比較變化不明顯，因而在本次實驗中選擇 I/R 損傷后 24 h 時作為腸黏膜損傷恢復期觀察時間點。因此，另外 8 只小鼠分配于 I/R 后 24 h 觀察時間點并用于腸黏膜損傷恢復期的實驗觀察），用預冷磷酸鹽緩沖液輕柔沖洗空腸腸腔，沖洗干凈后切取部分空腸組織塊（約 1.0 cm×0.5 cm 大小），用 4% 多聚甲醛固定 24 h，石蠟包埋，然后行 HE 染色后在光鏡下觀察小腸黏膜絨毛的形態學變化。參照 Chiu 等[6]的 6 級評分方法對小腸黏膜絨毛的損傷程度進行評估（表 1）。
表1
Chiu 等[6]的腸損傷評分法
1.4 采用實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）法檢測 I/R 損傷后各個時間點小鼠空腸上皮細胞中 BMP4 mRNA 表達的變化
取小鼠小腸 I/R 損傷后各個時間點（6、12、24、48 h）的部分空腸組織。采用 Trizol 試劑裂解細胞，離心（12 000 r/min，r=7.5 cm） 5 min 后采用 RNA 提取試劑盒提取總 RNA，按 RNA 逆轉錄試劑盒說明書要求將 RNA 反轉錄為 cDNA。以 cDNA 為模板，采用 ABI Viia7 熒光定量 PCR 儀進行 qRT-PCR 實驗。BMP4 上游引物為 5′-GAGCTAAGTTTTGCTGGTTTGC-3′，下游引物為 5′-GCCCATGAGCTTTTCTGAGA-3′，擴增片段長度為 277 bp；β-actin 上游引物為 5′-ACGGTCAGGTCATCACTATCG-3′，下游引物為 5′-GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3′，擴增片段長度為 476 bp。反應條件：5 ℃ 預變性 30 s；之后 95 ℃ 5 s 變性，60 ℃ 34 s 延伸，40 個循環；最后溶解參數設置為 95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，95 ℃ 15 s。結果用 2–ΔΔCt 計算 BMP4 mRNA 相對表達水平。
1.5 采用尤斯灌流系統檢測小鼠小腸 I/R 損傷后恢復期時腸黏膜屏障通透性大小
對小腸 I/R 損傷后恢復期即 I/R 后 24 h 時的小鼠腹腔內分別注射濃度為 30 ng/（mL·kg）的重組人 BMP4 蛋白（I/R-24 h-BMP4 組）和生理鹽水（I/R-24 h-NS 組），對不注射任何液體的小鼠作為對照組（I/R-24 h-空白組）。采用隨機數字表法每組隨機分配 4 只小鼠。取 3 組處理后 24 h 時和 SO 組約 3 cm 長的空腸組織，沿腸系膜方向縱行剖開腸道后并用 NS 清洗，完全清洗干凈后于顯微鏡下剝離腸黏膜，采用尤斯灌流系統[7]檢測各組小鼠腸黏膜組織跨膜電阻抗（transepithelial resistance，TER），用以反映腸黏膜組織活度及腸黏膜屏障通透性大小。
1.6 Western blot 法檢測小鼠小腸 I/R 損傷恢復期時小腸上皮細胞中 occludin、ZO-1、BMP4 、Notch1、Jagged1 及 p-Smad6 的蛋白表達
各組小鼠處理同 1.5。取各組約 3 cm 長的空腸組織放入盛滿 RPMI-1640 培養液的培養皿中，縱行剖開并洗凈腸腔內容物后用冷 D-Hanks 液洗滌，重復 3 次直至清潔，將空腸黏膜組織置于實驗前配好的消化液（5.0 mmol/L EDTA，145 μg/mL DTT 的D-Hanks 液）中，37 ℃ 環境搖床 90 min，然后離心（3 000 r/min，r=7.5 cm）15 min，沉淀者即為小腸上皮細胞。收集各組小腸上皮細胞加入細胞裂解液提取總蛋白，按照 BCA 法測定蛋白濃度，配制 12% 的 SDS-PAGE 電泳分離，濕轉法將蛋白轉移至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉，TBST 洗膜，分別加入一抗 BMP4（1∶500）、ZO-1（1∶1 000）、occludin（1∶1 000）、Notch1（1∶1 000）、Jagged1（1∶1 000）、p-Smad6（1∶1 000）、內參蛋白 GAPDH（1∶1 000），4 ℃ 過夜孵育，TBST 洗膜后加入山羊抗兔二抗（1∶1 000），搖床 2 h，洗膜后加入 Supersignal 發光液，上機檢測。用 Image J 軟件分別測量目的蛋白和內參蛋白的灰度值，目的蛋白灰度值與內參蛋白的灰度值比值即為目的蛋白的相對表達量。
2 結果
2.1 I/R 損傷模型建立結果以及小腸黏膜絨毛的形態學變化情況
HE 染色結果顯示，SO 小鼠的小腸黏膜損傷評分為 0 分，即未見腸黏膜損傷（圖 1a）。對于I/R小鼠，在 I/R 后 6 h 時，小腸黏膜損傷評分為 4～5 分，見腸黏膜損傷嚴重，表現為腸黏膜絨毛明顯斷裂、脫落或腸黏膜基底細胞連續性破壞、脫落（圖 1b）；在 I/R 后 12 h 時，腸黏膜損傷評分為 3～4 分，見腸黏膜損傷逐漸減輕，表現為腸上皮層部分破壞、毛細血管充血、固有層細胞成分增多（圖 1c）；在 I/R 后 24 h 時，腸黏膜損傷評分為 2～3 分，見腸黏膜損傷明顯減輕，表現為上皮層損傷和水腫均減輕、腸黏膜絨毛少部分斷裂、脫落（圖 1d）；在 I/R 后 48 h 時結果與 I/R 后 24 h 時的小腸黏膜形態變化不明顯。
圖1
示主要研究結果圖片
a–d：分別為 SO 組（a）和 I/R 組術后 6 h（b）、12 h（c）、24 h（d）時小鼠小腸黏膜絨毛形態學變化結果（HE 染色 ×200），圖中箭頭所指為觀察點；e：BMP4 mRNA相對表達水平（組別中1指SO組，2指I/R-6 h，3指I/R-12 h，4指I/R-24 h，5指I/R-48 h）；f：小腸黏膜TER變化（組別中1指SO組，2指I/R-24 h-空白組，3指I/R-24 h-NS組，4指I/R-24 h-BMP4組）；g、h：各蛋白表達的定性結果（圖中1指SO組，2指I/R-24 h-空白組，3指I/R-24 h-NS組，4指I/R-24 h-BMP4組）；i、j：各蛋白表達的半定量結果
2.2 I/R 后各個時間點小鼠空腸上皮細胞中 BMP4 mRNA 表達的變化
結果見圖 1e。從圖 1e 可見，與 SO 小鼠比較，I/R-6 h、I/R-12 h、I/R-24 h、I/R-48 h 各時間點空腸上皮細胞中 BMP4 mRNA 表達呈逐漸增高趨勢。
2.3 I/R 損傷后恢復期時小鼠腸黏膜屏障通透性大小
I/R 損傷后恢復期時腸黏膜組織中 TER 變化結果見圖 1f。從圖 1f 可見，I/R-24 h-BMP4 組 TER 仍低于 SO 組，但高于 I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組，而 I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組間變化不明顯。
2.4 I/R 損傷后恢復期小鼠小腸上皮細胞中occludin、ZO-1、BMP4 、Notch1、Jagged1 及 p-Smad6 的蛋白表達結果
Western blot 法檢測 occludin、ZO-1、BMP4、Notch1、Jagged1 及 p-Smad6 蛋白表達的定性結果見圖 1g 和 1h，半定量結果見圖 1i、1j。從圖 1i 可見，occludin、ZO-1 蛋白表達水平在 I/R-24 h-BMP4 組雖低于 SO 組，但高于 I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組，而 I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組間變化不明顯。從圖 1j 可見，BMP4 蛋白表達水平在 I/R-24 h-BMP4 組高于 SO 組、I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組，而 I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組間變化不明顯；Notch1、Jagged1、p-Smad6 蛋白表達水平在 I/R-24 h-BMP4 組雖低于 SO 組，但高于 I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組，而 I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組間變化不明顯。
3 討論
腸黏膜屏障主要由細胞外黏液層和腸黏膜上皮細胞組成，在抵御微生物和外源性抗原方面起著重要作用，其可分為機械屏障、化學屏障、生物屏障、免疫屏障等，其中由腸黏膜上皮細胞組成的機械屏障最為重要[8-9]。腸黏膜屏障的功能體現在允許營養物質的吸收而阻止有害物質及微生物的通過。
緊密連接蛋白是一種極具黏附性的多蛋白復合物，由跨膜蛋白、外周膜蛋白和調節蛋白組成，主要作用是封閉細胞間隙來調節屏障的通透性，因此，緊密連接蛋白是維持腸黏膜屏障通透性的重要結構[10]，同時維持腸黏膜上皮的完整性，也提供了細胞間通訊的場所，在腸上皮細胞的發育、生長和分化中起著關鍵作用[11-12]。通常用 TER 來評價緊密連接蛋白的完整性[13]。
BMPs 是轉化生長因子-β 大家族中的一個亞族，其分為Ⅰ型受體和Ⅱ型受體（跨膜），可通過經典 Smad 信號或非經典核因子-κB、絲裂原活化蛋白激酶、細胞外調節蛋白激酶等信號途徑發揮作用，影響腸黏膜上皮細胞的增殖、凋亡、分化等，從而維持腸黏膜機械屏障的穩定性[5, 14-15]。本研究團隊在前期 I/R 實驗研究[16-18]中發現， I/R 損傷腸黏膜上皮細胞中 BMP及 BMP 受體高度表達，Smad 信號通路激活，誘導促炎因子白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子-α 上調及抗炎因子 IL-2、IL-7 下調，同時細胞間緊密連接蛋白 occludin、ZO-1 表達降低，腸黏膜損傷加重。
在本次實驗中觀察到，在 I/R 損傷6 h 時，腸黏膜絨毛明顯斷裂、脫落或腸黏膜基底細胞的連續性破壞、脫落，腸黏膜屏障損傷最為嚴重；隨著 I/R 損傷時間延長至 24 h 時，腸黏膜損傷逐漸減輕，表現為腸上皮部分破壞、毛細血管充血、固有層細胞成分增多，提示在腸 I/R 損傷后 24 h 腸黏膜屏障功能開始恢復。在 I/R 損傷后腸黏膜屏障功能恢復期（I/R 損傷后 24 h）時進一步給予外源性 BMP4 蛋白刺激后發現，腸黏膜組織中 TER 增大，緊密連接蛋白 occludin、ZO-1 蛋白表達水平增高，因而逐漸恢復腸黏膜屏障功能；同時還觀察到 Notch 信號通路 Notch1、Jagged1 蛋白表達水平增高，提示腸 I/R 損傷后 Notch 信號通路被激活。在以往的研究[19]中也發現，Notch 信號通路參與了多種組織損傷后的修復過程，Notch 信號通路激活下游 Jagged1/Notch1/Hes1 信號通路，而且主要定位于增殖的腸隱窩上皮細胞內，促進了腸隱窩上皮細胞的增殖，參與了腸 I/R 損傷后腸黏膜的修復再生[20]；同時 Notch2/Hes5 信號通路被激活，可抑制腸 I/R 對腸黏膜上皮細胞的損傷，參與了抑制腸 I/R 對腸黏膜屏障完整性的破壞[21]。
近年來有研究發現，在血管上皮細胞中 Notch 可通過調控 Smad6 信號來影響 BMP 蛋白的表達，Smad6 作為 Smad1/5/8 蛋白磷酸化抑制劑，激活的 Smad6 信號反饋性下調 BMP 的經典 Smad 信號通路表達，從而誘導新血管的生成[22-23]，同時若經典 Smad 信號通路被抑制后，其下游的促炎細胞因子表達降低，可減輕細胞的炎癥反應[24]。在本實驗中發現，外源性 BMP4 刺激后，腸黏膜細胞中 p-Smad6蛋白表達水平增高，而 Smad6 作為 Smad1/5/8 蛋白磷酸化抑制劑，可以進一步減輕 I/R 腸黏膜屏障功能的損傷。
總之，從本實驗研究的初步研究結果看，在小腸 I/R 損傷恢復期，腸黏膜細胞內 BMP4 蛋白表達增高，其有可能是通過激活 Notch 信號通路和 Smad 經典信號通路來抑制 Smad6 蛋白和促進緊密連接蛋白表達增高，從而加速腸黏膜屏障功能恢復及減輕腸黏膜屏障功能損傷，但由于本研究樣本量較小，它們之間具體通過何種機制實現將有待進一步研究分析。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：羅彬予、張琴撰寫文章和參與實驗；張肖、秦龍、郭慶參與實驗；任明揚負責實驗質控；田云鴻參與數據分析、整理及匯總。
倫理聲明：本研究通過了川北醫學院附屬南充市中心醫院醫學倫理委員會審批［批文編號：2018 年審（102）號］；動物許可證號：SYXK（川）2018-076。
腸黏膜屏障是小腸缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷機體防御的重要屏障。在燒傷、休克、嚴重外科感染等應激條件下，腸黏膜屏障功能發生障礙，造成腸源性感染，進一步加重原發疾病，從而誘發全身炎癥反應綜合征，導致多器官功能衰竭[1-2]。盡管目前對腸黏膜屏障功能損傷及修復機制做了大量研究工作，但其機制仍未明確，因此，深入研究腸黏膜屏障在正常及應激條件下的調控機制將有助于提出早期預防手段、降低危重患者的病死率。在本研究團隊前期的研究[3]中發現，在急性腸 I/R 損傷時，腸黏膜上皮細胞中骨形成蛋白-4（bone morphogenetic protein-4，BMP4）可通過經典 Smad 信號通路加重腸黏膜損傷，同時發現 Notch 信號通路參與了多種組織損傷后的修復過程；在腸 I/R 損傷時，腸黏膜 Jagged1/Notch1 信號通路蛋白表達升高，抑制腸 I/R 對腸黏膜上皮細胞的損傷，參與了抑制腸 I/R 對腸黏膜屏障完整性的破壞[4-5]。本研究通過建立小鼠小腸 I/R 損傷模型，觀察在小腸 I/R 損傷恢復期時小腸黏膜上皮細胞中 BMP4 蛋白表達變化及腸黏膜絨毛損傷程度，同時觀察緊密連接蛋白、Notch 信號通路蛋白及 Smad 蛋白的變化在腸黏膜屏障功能損傷中的作用，為腸黏膜屏障功能穩定機制研究提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
重組人 BMP4 蛋白購自美國 PeproTech 公司；BMP4、外周膜蛋白（ZO-1）、occludin、Notch1、Jagged1、磷酸化-Smad6（p-Smad6）、GAPDH 抗體、山羊抗兔二抗均購自美國 BD 公司；Percoll 液和 細胞裂解液均購自上海前塵生物科技有限公司；RPMI-1640 培養基、胎牛血清、DMEM 低糖培養基購自美國 Gibco 公司；牛血清白蛋白（BSA）、胰蛋白酶購自 Sigma 公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、二喹啉甲酸分析法（BCA）蛋白定量試劑盒購自中國碧云天公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）試劑盒購自中國波爾公司；RNA 提取試劑盒、RNA 逆轉錄試劑盒購自中國 Takara 公司。
1.2 動物及手術操作
6～8 周齡 C57BL/6J 雄性小鼠 28 只，體質量 20～30 g，由川北醫學院實驗動物中心提供。采取隨機數字表法隨機抽取 24 只小鼠進行小腸 I/R 操作，余下 4 只小鼠進行假手術（SO）操作。I/R 操作主要步驟：麻醉小鼠后，從腹正中線進腹，整理小腸，找到并分離腸系膜動脈根部后用無創傷血管夾夾閉腸系膜動脈，觀察小腸顏色變白后 25 min 時松夾，繼續觀察小鼠小腸顏色變暗黑后恢復小腸血供，然后縫合并關閉腹腔。SO 操作：只進行分離而不夾閉腸系膜上動脈，在手術操作后 25 min 時處死小鼠。在實驗過程中對動物的處置遵循動物倫理學標準。由于在 I/R 刺激下空腸最為敏感，因此，取處死后的小鼠部分空腸（距屈氏韌帶約 10 cm）組織備用。
1.3 采用蘇木精-伊紅（HE）染色法評估小腸黏膜的損傷程度
分別于小腸 I/R 損傷后在 6、12、24、48 h 時間點隨機抽取 4 只小鼠處死后取小腸部分空腸組織（根據在預實驗中發現 I/R 損傷后 24 h 時的小腸黏膜損傷較 6、12 h 時間點明顯減輕而與 48 h 時間點時比較變化不明顯，因而在本次實驗中選擇 I/R 損傷后 24 h 時作為腸黏膜損傷恢復期觀察時間點。因此，另外 8 只小鼠分配于 I/R 后 24 h 觀察時間點并用于腸黏膜損傷恢復期的實驗觀察），用預冷磷酸鹽緩沖液輕柔沖洗空腸腸腔，沖洗干凈后切取部分空腸組織塊（約 1.0 cm×0.5 cm 大小），用 4% 多聚甲醛固定 24 h，石蠟包埋，然后行 HE 染色后在光鏡下觀察小腸黏膜絨毛的形態學變化。參照 Chiu 等[6]的 6 級評分方法對小腸黏膜絨毛的損傷程度進行評估（表 1）。
表1
Chiu 等[6]的腸損傷評分法
1.4 采用實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）法檢測 I/R 損傷后各個時間點小鼠空腸上皮細胞中 BMP4 mRNA 表達的變化
取小鼠小腸 I/R 損傷后各個時間點（6、12、24、48 h）的部分空腸組織。采用 Trizol 試劑裂解細胞，離心（12 000 r/min，r=7.5 cm） 5 min 后采用 RNA 提取試劑盒提取總 RNA，按 RNA 逆轉錄試劑盒說明書要求將 RNA 反轉錄為 cDNA。以 cDNA 為模板，采用 ABI Viia7 熒光定量 PCR 儀進行 qRT-PCR 實驗。BMP4 上游引物為 5′-GAGCTAAGTTTTGCTGGTTTGC-3′，下游引物為 5′-GCCCATGAGCTTTTCTGAGA-3′，擴增片段長度為 277 bp；β-actin 上游引物為 5′-ACGGTCAGGTCATCACTATCG-3′，下游引物為 5′-GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3′，擴增片段長度為 476 bp。反應條件：5 ℃ 預變性 30 s；之后 95 ℃ 5 s 變性，60 ℃ 34 s 延伸，40 個循環；最后溶解參數設置為 95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，95 ℃ 15 s。結果用 2–ΔΔCt 計算 BMP4 mRNA 相對表達水平。
1.5 采用尤斯灌流系統檢測小鼠小腸 I/R 損傷后恢復期時腸黏膜屏障通透性大小
對小腸 I/R 損傷后恢復期即 I/R 后 24 h 時的小鼠腹腔內分別注射濃度為 30 ng/（mL·kg）的重組人 BMP4 蛋白（I/R-24 h-BMP4 組）和生理鹽水（I/R-24 h-NS 組），對不注射任何液體的小鼠作為對照組（I/R-24 h-空白組）。采用隨機數字表法每組隨機分配 4 只小鼠。取 3 組處理后 24 h 時和 SO 組約 3 cm 長的空腸組織，沿腸系膜方向縱行剖開腸道后并用 NS 清洗，完全清洗干凈后于顯微鏡下剝離腸黏膜，采用尤斯灌流系統[7]檢測各組小鼠腸黏膜組織跨膜電阻抗（transepithelial resistance，TER），用以反映腸黏膜組織活度及腸黏膜屏障通透性大小。
1.6 Western blot 法檢測小鼠小腸 I/R 損傷恢復期時小腸上皮細胞中 occludin、ZO-1、BMP4 、Notch1、Jagged1 及 p-Smad6 的蛋白表達
各組小鼠處理同 1.5。取各組約 3 cm 長的空腸組織放入盛滿 RPMI-1640 培養液的培養皿中，縱行剖開并洗凈腸腔內容物后用冷 D-Hanks 液洗滌，重復 3 次直至清潔，將空腸黏膜組織置于實驗前配好的消化液（5.0 mmol/L EDTA，145 μg/mL DTT 的D-Hanks 液）中，37 ℃ 環境搖床 90 min，然后離心（3 000 r/min，r=7.5 cm）15 min，沉淀者即為小腸上皮細胞。收集各組小腸上皮細胞加入細胞裂解液提取總蛋白，按照 BCA 法測定蛋白濃度，配制 12% 的 SDS-PAGE 電泳分離，濕轉法將蛋白轉移至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉，TBST 洗膜，分別加入一抗 BMP4（1∶500）、ZO-1（1∶1 000）、occludin（1∶1 000）、Notch1（1∶1 000）、Jagged1（1∶1 000）、p-Smad6（1∶1 000）、內參蛋白 GAPDH（1∶1 000），4 ℃ 過夜孵育，TBST 洗膜后加入山羊抗兔二抗（1∶1 000），搖床 2 h，洗膜后加入 Supersignal 發光液，上機檢測。用 Image J 軟件分別測量目的蛋白和內參蛋白的灰度值，目的蛋白灰度值與內參蛋白的灰度值比值即為目的蛋白的相對表達量。
2 結果
2.1 I/R 損傷模型建立結果以及小腸黏膜絨毛的形態學變化情況
HE 染色結果顯示，SO 小鼠的小腸黏膜損傷評分為 0 分，即未見腸黏膜損傷（圖 1a）。對于I/R小鼠，在 I/R 后 6 h 時，小腸黏膜損傷評分為 4～5 分，見腸黏膜損傷嚴重，表現為腸黏膜絨毛明顯斷裂、脫落或腸黏膜基底細胞連續性破壞、脫落（圖 1b）；在 I/R 后 12 h 時，腸黏膜損傷評分為 3～4 分，見腸黏膜損傷逐漸減輕，表現為腸上皮層部分破壞、毛細血管充血、固有層細胞成分增多（圖 1c）；在 I/R 后 24 h 時，腸黏膜損傷評分為 2～3 分，見腸黏膜損傷明顯減輕，表現為上皮層損傷和水腫均減輕、腸黏膜絨毛少部分斷裂、脫落（圖 1d）；在 I/R 后 48 h 時結果與 I/R 后 24 h 時的小腸黏膜形態變化不明顯。
圖1
示主要研究結果圖片
a–d：分別為 SO 組（a）和 I/R 組術后 6 h（b）、12 h（c）、24 h（d）時小鼠小腸黏膜絨毛形態學變化結果（HE 染色 ×200），圖中箭頭所指為觀察點；e：BMP4 mRNA相對表達水平（組別中1指SO組，2指I/R-6 h，3指I/R-12 h，4指I/R-24 h，5指I/R-48 h）；f：小腸黏膜TER變化（組別中1指SO組，2指I/R-24 h-空白組，3指I/R-24 h-NS組，4指I/R-24 h-BMP4組）；g、h：各蛋白表達的定性結果（圖中1指SO組，2指I/R-24 h-空白組，3指I/R-24 h-NS組，4指I/R-24 h-BMP4組）；i、j：各蛋白表達的半定量結果
2.2 I/R 后各個時間點小鼠空腸上皮細胞中 BMP4 mRNA 表達的變化
結果見圖 1e。從圖 1e 可見，與 SO 小鼠比較，I/R-6 h、I/R-12 h、I/R-24 h、I/R-48 h 各時間點空腸上皮細胞中 BMP4 mRNA 表達呈逐漸增高趨勢。
2.3 I/R 損傷后恢復期時小鼠腸黏膜屏障通透性大小
I/R 損傷后恢復期時腸黏膜組織中 TER 變化結果見圖 1f。從圖 1f 可見，I/R-24 h-BMP4 組 TER 仍低于 SO 組，但高于 I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組，而 I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組間變化不明顯。
2.4 I/R 損傷后恢復期小鼠小腸上皮細胞中occludin、ZO-1、BMP4 、Notch1、Jagged1 及 p-Smad6 的蛋白表達結果
Western blot 法檢測 occludin、ZO-1、BMP4、Notch1、Jagged1 及 p-Smad6 蛋白表達的定性結果見圖 1g 和 1h，半定量結果見圖 1i、1j。從圖 1i 可見，occludin、ZO-1 蛋白表達水平在 I/R-24 h-BMP4 組雖低于 SO 組，但高于 I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組，而 I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組間變化不明顯。從圖 1j 可見，BMP4 蛋白表達水平在 I/R-24 h-BMP4 組高于 SO 組、I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組，而 I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組間變化不明顯；Notch1、Jagged1、p-Smad6 蛋白表達水平在 I/R-24 h-BMP4 組雖低于 SO 組，但高于 I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組，而 I/R-24 h-NS 組和 I/R-24 h-空白組間變化不明顯。
3 討論
腸黏膜屏障主要由細胞外黏液層和腸黏膜上皮細胞組成，在抵御微生物和外源性抗原方面起著重要作用，其可分為機械屏障、化學屏障、生物屏障、免疫屏障等，其中由腸黏膜上皮細胞組成的機械屏障最為重要[8-9]。腸黏膜屏障的功能體現在允許營養物質的吸收而阻止有害物質及微生物的通過。
緊密連接蛋白是一種極具黏附性的多蛋白復合物，由跨膜蛋白、外周膜蛋白和調節蛋白組成，主要作用是封閉細胞間隙來調節屏障的通透性，因此，緊密連接蛋白是維持腸黏膜屏障通透性的重要結構[10]，同時維持腸黏膜上皮的完整性，也提供了細胞間通訊的場所，在腸上皮細胞的發育、生長和分化中起著關鍵作用[11-12]。通常用 TER 來評價緊密連接蛋白的完整性[13]。
BMPs 是轉化生長因子-β 大家族中的一個亞族，其分為Ⅰ型受體和Ⅱ型受體（跨膜），可通過經典 Smad 信號或非經典核因子-κB、絲裂原活化蛋白激酶、細胞外調節蛋白激酶等信號途徑發揮作用，影響腸黏膜上皮細胞的增殖、凋亡、分化等，從而維持腸黏膜機械屏障的穩定性[5, 14-15]。本研究團隊在前期 I/R 實驗研究[16-18]中發現， I/R 損傷腸黏膜上皮細胞中 BMP及 BMP 受體高度表達，Smad 信號通路激活，誘導促炎因子白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子-α 上調及抗炎因子 IL-2、IL-7 下調，同時細胞間緊密連接蛋白 occludin、ZO-1 表達降低，腸黏膜損傷加重。
在本次實驗中觀察到，在 I/R 損傷6 h 時，腸黏膜絨毛明顯斷裂、脫落或腸黏膜基底細胞的連續性破壞、脫落，腸黏膜屏障損傷最為嚴重；隨著 I/R 損傷時間延長至 24 h 時，腸黏膜損傷逐漸減輕，表現為腸上皮部分破壞、毛細血管充血、固有層細胞成分增多，提示在腸 I/R 損傷后 24 h 腸黏膜屏障功能開始恢復。在 I/R 損傷后腸黏膜屏障功能恢復期（I/R 損傷后 24 h）時進一步給予外源性 BMP4 蛋白刺激后發現，腸黏膜組織中 TER 增大，緊密連接蛋白 occludin、ZO-1 蛋白表達水平增高，因而逐漸恢復腸黏膜屏障功能；同時還觀察到 Notch 信號通路 Notch1、Jagged1 蛋白表達水平增高，提示腸 I/R 損傷后 Notch 信號通路被激活。在以往的研究[19]中也發現，Notch 信號通路參與了多種組織損傷后的修復過程，Notch 信號通路激活下游 Jagged1/Notch1/Hes1 信號通路，而且主要定位于增殖的腸隱窩上皮細胞內，促進了腸隱窩上皮細胞的增殖，參與了腸 I/R 損傷后腸黏膜的修復再生[20]；同時 Notch2/Hes5 信號通路被激活，可抑制腸 I/R 對腸黏膜上皮細胞的損傷，參與了抑制腸 I/R 對腸黏膜屏障完整性的破壞[21]。
近年來有研究發現，在血管上皮細胞中 Notch 可通過調控 Smad6 信號來影響 BMP 蛋白的表達，Smad6 作為 Smad1/5/8 蛋白磷酸化抑制劑，激活的 Smad6 信號反饋性下調 BMP 的經典 Smad 信號通路表達，從而誘導新血管的生成[22-23]，同時若經典 Smad 信號通路被抑制后，其下游的促炎細胞因子表達降低，可減輕細胞的炎癥反應[24]。在本實驗中發現，外源性 BMP4 刺激后，腸黏膜細胞中 p-Smad6蛋白表達水平增高，而 Smad6 作為 Smad1/5/8 蛋白磷酸化抑制劑，可以進一步減輕 I/R 腸黏膜屏障功能的損傷。
總之，從本實驗研究的初步研究結果看，在小腸 I/R 損傷恢復期，腸黏膜細胞內 BMP4 蛋白表達增高，其有可能是通過激活 Notch 信號通路和 Smad 經典信號通路來抑制 Smad6 蛋白和促進緊密連接蛋白表達增高，從而加速腸黏膜屏障功能恢復及減輕腸黏膜屏障功能損傷，但由于本研究樣本量較小，它們之間具體通過何種機制實現將有待進一步研究分析。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：羅彬予、張琴撰寫文章和參與實驗；張肖、秦龍、郭慶參與實驗；任明揚負責實驗質控；田云鴻參與數據分析、整理及匯總。
倫理聲明：本研究通過了川北醫學院附屬南充市中心醫院醫學倫理委員會審批［批文編號：2018 年審（102）號］；動物許可證號：SYXK（川）2018-076。
