引用本文： 郭影, 郭秋影. GSDM基因家族在原發性肝癌中的表達及其對預后的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(3): 328-336. doi: 10.7507/1007-9424.202105003 復制
肝癌已成為全球第四大腫瘤相關死亡原因，全球每年報道的新增病例約為841 000例，死亡人數約為782 000例[1]。世界衛生組織估計，2030年將有100多萬肝癌患者死亡[2]。盡管在新的診斷和治療技術方面取得了進展，但肝癌的發病機制仍不清楚，導致有效治療的難度較大，肝癌患者的5年總體存活率仍然很低。最近，高通量技術的出現使癌癥基因組研究發生了革命性的變化，它集中在基因的改變上，并提供了一種有效的方法來識別與肝癌發生和發展有關的新的生物標志物[3]。消皮素（gasdermin，GSDM）是最近發現的一個具有成孔能力的蛋白質家族，由GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME（又稱DFNA5）和DFNB59 ［又稱pejvakin（PJVK）］ 組成。GSDM的膜穿孔活性可以破壞細胞膜的完整性，引發炎性細胞死亡，并向細胞外釋放包括炎性細胞因子在內的細胞內容物，這種由GSDM介導的細胞死亡方式被稱為細胞焦亡[4]。細胞焦亡是一個很有前景的研究方向，在肝炎、動脈粥樣硬化、神經退行性變、腫瘤等多種疾病中發揮著重要作用[5-8]。目前認為，細胞焦亡對腫瘤有雙重作用：一方面，焦亡相關的炎癥細胞因子和通路促進腫瘤生長、侵襲和耐藥。另一方面，誘導焦亡直接抑制腫瘤增殖。因此，有關焦亡的研究對于發現診斷生物標志物、開發新的腫瘤治療方案、降低化療耐藥性，以及提高腫瘤患者的生活質量具有積極意義[9-11]。本研究中，筆者通過生物信息數據庫分析了GSDM的基因表達差異、功能網絡和預后價值，并進一步探索了GSDM對肝癌腫瘤免疫的影響，希望對GSDM在肝癌中的表達有新的認識，并為肝癌的診斷、預后和治療提供一個潛在的靶點，希望對探索更好的癌癥治療方法有所幫助。
1 材料與方法
1.1 癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫和 GEO 數據庫
使用UCSC Xena工具（
1.2 基因表達譜數據動態分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2，GEPIA2）數據庫
GEPIA2 數據庫（網址為
1.3 生存分析
Kaplan-Meier Plotter（
1.4 單因素及多因素Cox比例風險回歸分析
本研究使用TCGA數據庫當中的肝癌樣本進行Cox比例風險回歸分析，納入變量包括GSDM家族各基因表達量、性別、年齡、TNM分期。筆者排除生存信息以及TNM分期不明確的原發性肝癌患者后，尚有348例樣本的信息。使用R軟件當中的“survival”包進行單因素及多因素Cox比例風險回歸分析。
1.5 預測可能與GSDM基因家族相互作用的基因
GeneMANIA（
1.6 GSDM基因家族的功能富集分析
Metascape（
1.7 GSDM基因家族與原發性肝癌免疫特征的關系
TIMER（cistrome.shinyapps.io/timer）數據庫是一個使用Timer算法評估腫瘤微環境當中6種免疫細胞含量的在線工具，可探索免疫細胞浸潤與基因表達、臨床特點、體細胞突變之間的關系[16]。本研究中，筆者用TIMER數據庫當中的“Gene”模塊探索了GSDM家族當中各基因的表達與原發性肝癌腫瘤微環境當中6種免疫細胞浸潤的關系，包括B細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞以及肥大細胞。TISIDB（
1.8 統計學方法
Kaplan-Meier Plotter工具當中GSDM基因家族的表達與原發性肝癌患者預后關系的生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，并使用log-rank檢驗對兩組生存曲線進行比較。TIMER數據庫中，使用Spearman秩相關分析探索GSDM家族各基因表達量與免疫細胞浸潤水平的關系；兩組數據間的比較時，若數據服從正態分布，使用獨立樣本比較的t檢驗，若不服從正態分布，則使用獨立樣本比較的U檢驗。所有分析的檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 GSDM基因家族在原發性肝癌中的表達
GEPIA2數據庫當中收錄了來自TCGA數據庫當中的369例肝癌信息，以及TCGA和GTEx數據庫中共160例正常肝臟樣本的mRNA表達水平。如圖1a～1f所示，與正常肝臟組織相比，GSDMA、GSDMC、GSDMD以及GSDME在肝癌組織當中的表達水平較高（P<0.050），而GSDMB和DFNB59在肝癌組織當中的表達水平較低（P<0.050）。隨后筆者使用GEO數據庫中的肝癌數據集（肝癌207例，正常肝臟樣本40例）驗證了GSDM家族在肝癌當中的表達情況，如圖1g所示，可見GSDMB、GSDMD 以及GSDME的結果與前一致，而GSDMC則在肝癌和正常肝組織當中的表達的差異無統計學意義（P>0.050），而數據集GSE112790以及GSE45114當中均無GSDMA及DFNB59的表達數據。
圖1
示GSDM基因家族在肝癌組織和正常肝臟組織中的表達差異和不同GSDM基因家族表達狀態患者的生存曲線
a～f：GEPIA2數據庫分析結果表明，GSDMA（a）、GSDMC（c）、GSDMD（d）以及GSDME（e）在肝癌組織中的表達水平高于正常肝組織，而GSDMB（b）和DFNB59（f）在肝癌組織中的表達水平低于正常肝組織；g：采用GEO數據庫進行驗證，可見GSDMB、GSDMD以及GSDME的結果與GEPIA2數據庫分析結果一致，而GSDMC則在肝癌和正常肝組織中的表達水平的差異無統計學意義；h～l：GSDMA（h）、GSDMB（i）、GSDMC（j）、GSDMD（k）、GSDME（l）和DFNB59（m）不同表達狀態患者的生存曲線；*
2.2 GSDM基因家族與原發性肝癌患者預后的關系
本研究使用TCGA數據庫當中的肝癌樣本進行log-rank檢驗，探索了GSDM家族各基因與原發性肝癌患者總體生存之間的關系。圖1h～1m顯示，GSDMD和DFNB59高表達組患者的總體生存情況比低表達組患者更好（P<0.050），而GSDME高表達組患者的總體生存情況相比于低表達組患者較差（P<0.050）。這表明GSDMD和DFNB59的低表達、GSDME 的高表達提示肝癌患者的預后不良。而GSDMA、GSDMB和GSDMC的表達則與肝癌患者的預后沒有明顯的相關性（P>0.050）。為了進一步探索GSDM家族在肝癌當中的預后意義，本研究進行了單因素及多因素Cox比例風險回歸分析。如表1所示，單因素Cox比例風險回歸結果顯示，GSDMC和GSDME的高表達，以及TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期均是肝癌預后的高危因素（P<0.050）；而多因素Cox比例風險回歸結果顯示GSDME的高表達，以及TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期是肝癌預后的高危因素（P<0.050）。本研究結果表明，GSDME可作為肝癌患者預后的預測因子。
表1
單因素和多因素Cox比例風險回歸分析（n=348）
2.3 GSDM基因家族與原發性肝癌患者臨床特征的相關性
本研究進一步使用GEPIA2數據庫探索了TCGA肝癌數據集當中GSDM家族各基因與肝癌患者臨床分期的關系。如圖2a～2f所示，隨著肝癌患者TNM分期的增加，GSDMA和GSDMC的表達量也逐漸增加（P<0.050），而GSDMB、GSDMD、GSDME和DFNB59的表達則與肝癌患者的臨床分期無關（P>0.050）。隨后本研究比較了TCGA肝癌數據集當中GSDM家族各基因在不同年齡分組以及不同性別肝癌患者當中的表達情況，圖2g表明GSDM家族各基因的表達與年齡無關（P>0.050）；圖2h示GSDMD在男性患者當中的表達量高于女性患者（P<0.050），其他基因的表達未呈現出與性別的相關性（P>0.050）。
圖2
示GSDM家族與肝癌臨床特征之間的關系以及GSDM家族互作網絡及功能富集分析
a～f：GSDMA（a）、GSDMB（b）、GSDMC（c）、GSDMD（d）、GSDME（e）和DFNB59（f）在不同TNM分期患者中的表達水平；g：GSDM家族在不同年齡患者中的表達水平；h：GSDM家族在不同性別患者中的表達水平；i：與GSDM家族相互作用的基因；j：GSDM家族及其互作基因的功能富集分析；k：GSDM家族及其互作基因所富集功能的互作網絡；***
2.4 GSDM基因家族的功能富集分析
本研究用GeneMANIA數據庫探索了可能與GSDM家族相互作用的基因，并生成了基因互作網絡（圖2i）。如圖2i所示，以GSDM家族為核心，有19種基因與其互作，其中CALML4、HLA-E、RNF213、CDK5RAP3、ATHL1、SULT1A2以及TRIM14與GSDM家族成員密切互作。為了探索GSDM基因家族可能參與的生物學過程，本研究利用Metascape數據庫對GSDM家族及其互作基因進行功能富集分析。圖2j顯示，這些基因主要富集在細胞焦亡、細胞死亡的調節、免疫系統當中的細胞因子信號等生物學過程。圖2k展示了這些生物過程的相互作用網絡，結果顯示細胞焦亡、細胞死亡的調節以及細胞因子信號之間存在相互作用。
2.5 GSDM基因家族與原發性肝癌免疫細胞浸潤之間的關系
鑒于富集分析表明GSDM基因家族參與多種免疫相關的生物學過程，本研究探索了GSDM基因家族與肝癌腫瘤微環境中6種免疫細胞浸潤水平的相關性。如圖3a所示，GSDMA和GSDME的表達水平與B細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞以及樹突狀細胞的浸潤水平均呈正相關（P<0.050），而GSDMB的表達水平只與CD8+ T細胞的浸潤水平呈正相關（P<0.050）。GSDMC的表達水平與B細胞、CD4+ T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞以及樹突狀細胞的浸潤水平均呈正相關（P<0.050）；GSDMD的表達水平與B細胞和樹突狀細胞的浸潤水平呈正相關（P<0.050）。DFNB59的表達水平只與CD4+ T細胞浸潤水平呈正相關（P<0.050）。隨后，本研究使用TISIDB數據庫分析了GSDM家族的表達水平與原發性肝癌免疫亞型之間的關系。由于GSDMA在肝癌當中表達水平過低，TISIDB 數據庫中未探討GSDMA與肝癌免疫特征之間的相關性。結果表明，GSDMB、GSDMD、GSDME和DFNB59的表達水平均與肝癌的免疫亞型相關（P<0.050）。GSDMB在C2型當中高表達，在C3型當中低表達；GSDMD也在C2型當中高表達，而在C1和C3型當中低表達；GSDME的表達水平則在C1～C4型當中依次遞減；DFNB59在C1和C4型當中高表達，而在C2型當中表達水平最低（圖3b～3f）。
圖3
示GSDM基因家族與免疫特征的相關性
a：GSDM基因家族與免疫細胞浸潤水平的相關性散點圖；b～f：不同免疫特征患者的GSDMB（b）、GSDMC（c）、GSDMD（d）、GSDME（e）及DFNB59（f）的表達水平
3 討論
原發性肝癌是世界范圍內常見的腫瘤，其發病率高、死亡率高，是癌癥死亡的常見原因。解決原發性肝癌治療難點的關鍵主要在于早期診斷和治療，因此開發新的具有前景的生物標志物以及尋找基因治療靶點，對原發性肝癌的診斷、臨床分期、療效觀察和預后判斷具有重要意義[18]。值得注意的是，許多癌癥研究都有大量的網絡數據支持，包括TCGA、KEGG、GEPIA、基因相互作用和其他網絡分析。基于多個基因分析平臺，一些研究人員已經證明許多關鍵基因在肝癌的發生、發展和預后中起著至關重要的作用[19]。然而，需要發現更多與靶向治療相關的潛在基因，以提供更有效的肝癌治療靶點。細胞焦亡是細胞程序性死亡的一種形式，其特征是細胞膜孔形成、細胞質腫脹、膜破裂，并將白細胞介素1β（IL-1β）等胞質內容物釋放到細胞外環境中，放大局部或全身的炎癥效應。已有研究報道，細胞焦亡與神經系統疾病、傳染病、自身免疫性疾病、心血管疾病和腫瘤密切相關[20-23]。GSDM是一個參與焦亡活化的孔形成蛋白家族，該家族包含6個成員 ［GSDMA～E和DFNB59］。除DFNB59外均包含兩個保守結構域、N端效應域和C端抑制域。在靜息狀態下，GSDM的低聚是通過N端效應域和C端抑制域之間的分子內結合來維持的。然而當在各種微生物和內源刺激下，GSDM被熱解半胱天冬酶蛋白（caspases）所裂解，某些GSDM的N端結構域擠入脂質成分，在細胞膜上形成孔，發揮細胞焦亡誘導作用[24-28]。即使腫瘤使用多種策略來避免或限制細胞死亡途徑，但在某些情況下，腫瘤可以通過不同的方式被殺死，如凋亡、壞死、自噬和焦亡。凋亡和其他死亡模式作為重要的抗癌防御機制已被廣泛研究，但細胞焦亡與癌癥的關系目前尚未完全了解。
生物信息學結合高通量測序可以系統地對疾病相關基因進行全面分析，是研究疾病發病機制的重要手段[29]。本研究試圖通過生信分析初步探索GSDM基因家族在原發性肝癌中的表達水平及其對于臨床分期及預后的臨床意義。通過挖掘TCGA數據庫以及GTEx數據庫中的臨床樣本，結果發現肝癌組織中GSDM基因家族的GSDMA、GSDMC、GSDMD以及GSDME在肝癌組織當中的表達水平均高于正常肝組織，而GSDMB和DFNB59在肝癌組織當中則呈低表達，差異具有統計學意義（P<0.050），并進一步用GEO數據庫驗證了上述表達結果（其中GSDMC的表達水平的差異無統計學意義）。隨后的預后和生存分析結果表明，GSDMD和DFNB59低表達、GSDME高表達患者總體生存率較低，提示肝癌患者的預后不良，表明GSDMD、GSDME以及DFNB59具有作為預測肝癌患者預后的生物標志物的潛力。單因素和多因素Cox比例風險回歸分析結果表明，GSDME可作為預測肝癌患者預后的因子。接下來，本研究又探索了GSDM家族的表達水平與原發性肝癌患者臨床病理分期的相關性，發現隨著肝癌患者TNM分期的增加，GSDMA和GSDMC的表達水平也逐漸增加，表明GSDMA和GSDMC可能參與肝癌的進展及惡化，有可能作為腫瘤臨床分期的生物標志物，同時也是一個潛在的治療靶點。為了進一步探索GSDM影響疾病發生發展的潛在機制，本研究繪制了基因互作的網絡圖，這些與GSDM家族相互作用的基因可能是參與細胞焦亡過程潛在的候選基因。遂又對其進行功能富集分析來探索可能參與的生物學過程，發現這些基因主要富集在細胞焦亡、細胞死亡的調節以及免疫系統當中的細胞因子信號等生物學過程。最后，本研究探索了GSDM基因家族與肝癌腫瘤微環境中6種免疫細胞浸潤的相關性，發現GSDMA、GSDMC與GSDME的表達水平與多種免疫細胞的浸潤水平呈正相關，這表明這些GSDM家族成員的高表達可能與肝癌腫瘤微環境中較高的免疫活性有關。本研究進一步分析了GSDM家族的表達水平與原發性肝癌免疫亞型之間的關系。免疫亞型包括6種：C1（組織愈合型）、C2（γ干擾素主導型）、C3（炎癥型）、C4（淋巴細胞耗竭型）、C5（免疫靜默型）和C6（轉化生長因子β主導型）。本研究結果表明，GSDMB和GSDMD均在C2型當中高表達，GSDME在C1和C2型當中均高表達，同時DFNB59在C1和C4型當中高表達。以往的文獻[30]報道，C1型有升高的血管基因表達、高增殖比例和Th2偏向的獲得性免疫浸潤；C2型有最高的M1/M2巨噬細胞極化、強烈的CD8信號以及最高的抗原受體多樣性；C4型則具有更為顯著的巨噬細胞特征。這些結果進一步表明了GSDM家族的表達水平與肝癌腫瘤微環境的免疫活性密切相關，可能為開發更有效的治療方案提供新的見解。
綜上所述，本研究通過生物信息分析發現，GSDM 基因家族可能參與了肝癌發病機制中與細胞焦亡和免疫相關的生物學過程，具有作為一種反映肝癌臨床分期和預后指標的生物標志物的潛力，可能是改善預后、延長生存期的潛在治療靶點。相信通過對GSDM基因家族的深入研究，進一步挖掘其影響腫瘤發生發展的分子機制，有望在不久的將來應用于臨床，為肝癌患者的早期診斷和個體化精準治療帶來新的希望，實現改善患者生活質量、提高治愈率、降低死亡率的目標。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：郭影負責研究設計、數據處理及論文撰寫，郭秋影主負責論文的審查及修改。
肝癌已成為全球第四大腫瘤相關死亡原因，全球每年報道的新增病例約為841 000例，死亡人數約為782 000例[1]。世界衛生組織估計，2030年將有100多萬肝癌患者死亡[2]。盡管在新的診斷和治療技術方面取得了進展，但肝癌的發病機制仍不清楚，導致有效治療的難度較大，肝癌患者的5年總體存活率仍然很低。最近，高通量技術的出現使癌癥基因組研究發生了革命性的變化，它集中在基因的改變上，并提供了一種有效的方法來識別與肝癌發生和發展有關的新的生物標志物[3]。消皮素（gasdermin，GSDM）是最近發現的一個具有成孔能力的蛋白質家族，由GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME（又稱DFNA5）和DFNB59 ［又稱pejvakin（PJVK）］ 組成。GSDM的膜穿孔活性可以破壞細胞膜的完整性，引發炎性細胞死亡，并向細胞外釋放包括炎性細胞因子在內的細胞內容物，這種由GSDM介導的細胞死亡方式被稱為細胞焦亡[4]。細胞焦亡是一個很有前景的研究方向，在肝炎、動脈粥樣硬化、神經退行性變、腫瘤等多種疾病中發揮著重要作用[5-8]。目前認為，細胞焦亡對腫瘤有雙重作用：一方面，焦亡相關的炎癥細胞因子和通路促進腫瘤生長、侵襲和耐藥。另一方面，誘導焦亡直接抑制腫瘤增殖。因此，有關焦亡的研究對于發現診斷生物標志物、開發新的腫瘤治療方案、降低化療耐藥性，以及提高腫瘤患者的生活質量具有積極意義[9-11]。本研究中，筆者通過生物信息數據庫分析了GSDM的基因表達差異、功能網絡和預后價值，并進一步探索了GSDM對肝癌腫瘤免疫的影響，希望對GSDM在肝癌中的表達有新的認識，并為肝癌的診斷、預后和治療提供一個潛在的靶點，希望對探索更好的癌癥治療方法有所幫助。
1 材料與方法
1.1 癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫和 GEO 數據庫
使用UCSC Xena工具（
1.2 基因表達譜數據動態分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2，GEPIA2）數據庫
GEPIA2 數據庫（網址為
1.3 生存分析
Kaplan-Meier Plotter（
1.4 單因素及多因素Cox比例風險回歸分析
本研究使用TCGA數據庫當中的肝癌樣本進行Cox比例風險回歸分析，納入變量包括GSDM家族各基因表達量、性別、年齡、TNM分期。筆者排除生存信息以及TNM分期不明確的原發性肝癌患者后，尚有348例樣本的信息。使用R軟件當中的“survival”包進行單因素及多因素Cox比例風險回歸分析。
1.5 預測可能與GSDM基因家族相互作用的基因
GeneMANIA（
1.6 GSDM基因家族的功能富集分析
Metascape（
1.7 GSDM基因家族與原發性肝癌免疫特征的關系
TIMER（cistrome.shinyapps.io/timer）數據庫是一個使用Timer算法評估腫瘤微環境當中6種免疫細胞含量的在線工具，可探索免疫細胞浸潤與基因表達、臨床特點、體細胞突變之間的關系[16]。本研究中，筆者用TIMER數據庫當中的“Gene”模塊探索了GSDM家族當中各基因的表達與原發性肝癌腫瘤微環境當中6種免疫細胞浸潤的關系，包括B細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞以及肥大細胞。TISIDB（
1.8 統計學方法
Kaplan-Meier Plotter工具當中GSDM基因家族的表達與原發性肝癌患者預后關系的生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，并使用log-rank檢驗對兩組生存曲線進行比較。TIMER數據庫中，使用Spearman秩相關分析探索GSDM家族各基因表達量與免疫細胞浸潤水平的關系；兩組數據間的比較時，若數據服從正態分布，使用獨立樣本比較的t檢驗，若不服從正態分布，則使用獨立樣本比較的U檢驗。所有分析的檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 GSDM基因家族在原發性肝癌中的表達
GEPIA2數據庫當中收錄了來自TCGA數據庫當中的369例肝癌信息，以及TCGA和GTEx數據庫中共160例正常肝臟樣本的mRNA表達水平。如圖1a～1f所示，與正常肝臟組織相比，GSDMA、GSDMC、GSDMD以及GSDME在肝癌組織當中的表達水平較高（P<0.050），而GSDMB和DFNB59在肝癌組織當中的表達水平較低（P<0.050）。隨后筆者使用GEO數據庫中的肝癌數據集（肝癌207例，正常肝臟樣本40例）驗證了GSDM家族在肝癌當中的表達情況，如圖1g所示，可見GSDMB、GSDMD 以及GSDME的結果與前一致，而GSDMC則在肝癌和正常肝組織當中的表達的差異無統計學意義（P>0.050），而數據集GSE112790以及GSE45114當中均無GSDMA及DFNB59的表達數據。
圖1
示GSDM基因家族在肝癌組織和正常肝臟組織中的表達差異和不同GSDM基因家族表達狀態患者的生存曲線
a～f：GEPIA2數據庫分析結果表明，GSDMA（a）、GSDMC（c）、GSDMD（d）以及GSDME（e）在肝癌組織中的表達水平高于正常肝組織，而GSDMB（b）和DFNB59（f）在肝癌組織中的表達水平低于正常肝組織；g：采用GEO數據庫進行驗證，可見GSDMB、GSDMD以及GSDME的結果與GEPIA2數據庫分析結果一致，而GSDMC則在肝癌和正常肝組織中的表達水平的差異無統計學意義；h～l：GSDMA（h）、GSDMB（i）、GSDMC（j）、GSDMD（k）、GSDME（l）和DFNB59（m）不同表達狀態患者的生存曲線；*
2.2 GSDM基因家族與原發性肝癌患者預后的關系
本研究使用TCGA數據庫當中的肝癌樣本進行log-rank檢驗，探索了GSDM家族各基因與原發性肝癌患者總體生存之間的關系。圖1h～1m顯示，GSDMD和DFNB59高表達組患者的總體生存情況比低表達組患者更好（P<0.050），而GSDME高表達組患者的總體生存情況相比于低表達組患者較差（P<0.050）。這表明GSDMD和DFNB59的低表達、GSDME 的高表達提示肝癌患者的預后不良。而GSDMA、GSDMB和GSDMC的表達則與肝癌患者的預后沒有明顯的相關性（P>0.050）。為了進一步探索GSDM家族在肝癌當中的預后意義，本研究進行了單因素及多因素Cox比例風險回歸分析。如表1所示，單因素Cox比例風險回歸結果顯示，GSDMC和GSDME的高表達，以及TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期均是肝癌預后的高危因素（P<0.050）；而多因素Cox比例風險回歸結果顯示GSDME的高表達，以及TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期是肝癌預后的高危因素（P<0.050）。本研究結果表明，GSDME可作為肝癌患者預后的預測因子。
表1
單因素和多因素Cox比例風險回歸分析（n=348）
2.3 GSDM基因家族與原發性肝癌患者臨床特征的相關性
本研究進一步使用GEPIA2數據庫探索了TCGA肝癌數據集當中GSDM家族各基因與肝癌患者臨床分期的關系。如圖2a～2f所示，隨著肝癌患者TNM分期的增加，GSDMA和GSDMC的表達量也逐漸增加（P<0.050），而GSDMB、GSDMD、GSDME和DFNB59的表達則與肝癌患者的臨床分期無關（P>0.050）。隨后本研究比較了TCGA肝癌數據集當中GSDM家族各基因在不同年齡分組以及不同性別肝癌患者當中的表達情況，圖2g表明GSDM家族各基因的表達與年齡無關（P>0.050）；圖2h示GSDMD在男性患者當中的表達量高于女性患者（P<0.050），其他基因的表達未呈現出與性別的相關性（P>0.050）。
圖2
示GSDM家族與肝癌臨床特征之間的關系以及GSDM家族互作網絡及功能富集分析
a～f：GSDMA（a）、GSDMB（b）、GSDMC（c）、GSDMD（d）、GSDME（e）和DFNB59（f）在不同TNM分期患者中的表達水平；g：GSDM家族在不同年齡患者中的表達水平；h：GSDM家族在不同性別患者中的表達水平；i：與GSDM家族相互作用的基因；j：GSDM家族及其互作基因的功能富集分析；k：GSDM家族及其互作基因所富集功能的互作網絡；***
2.4 GSDM基因家族的功能富集分析
本研究用GeneMANIA數據庫探索了可能與GSDM家族相互作用的基因，并生成了基因互作網絡（圖2i）。如圖2i所示，以GSDM家族為核心，有19種基因與其互作，其中CALML4、HLA-E、RNF213、CDK5RAP3、ATHL1、SULT1A2以及TRIM14與GSDM家族成員密切互作。為了探索GSDM基因家族可能參與的生物學過程，本研究利用Metascape數據庫對GSDM家族及其互作基因進行功能富集分析。圖2j顯示，這些基因主要富集在細胞焦亡、細胞死亡的調節、免疫系統當中的細胞因子信號等生物學過程。圖2k展示了這些生物過程的相互作用網絡，結果顯示細胞焦亡、細胞死亡的調節以及細胞因子信號之間存在相互作用。
2.5 GSDM基因家族與原發性肝癌免疫細胞浸潤之間的關系
鑒于富集分析表明GSDM基因家族參與多種免疫相關的生物學過程，本研究探索了GSDM基因家族與肝癌腫瘤微環境中6種免疫細胞浸潤水平的相關性。如圖3a所示，GSDMA和GSDME的表達水平與B細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞以及樹突狀細胞的浸潤水平均呈正相關（P<0.050），而GSDMB的表達水平只與CD8+ T細胞的浸潤水平呈正相關（P<0.050）。GSDMC的表達水平與B細胞、CD4+ T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞以及樹突狀細胞的浸潤水平均呈正相關（P<0.050）；GSDMD的表達水平與B細胞和樹突狀細胞的浸潤水平呈正相關（P<0.050）。DFNB59的表達水平只與CD4+ T細胞浸潤水平呈正相關（P<0.050）。隨后，本研究使用TISIDB數據庫分析了GSDM家族的表達水平與原發性肝癌免疫亞型之間的關系。由于GSDMA在肝癌當中表達水平過低，TISIDB 數據庫中未探討GSDMA與肝癌免疫特征之間的相關性。結果表明，GSDMB、GSDMD、GSDME和DFNB59的表達水平均與肝癌的免疫亞型相關（P<0.050）。GSDMB在C2型當中高表達，在C3型當中低表達；GSDMD也在C2型當中高表達，而在C1和C3型當中低表達；GSDME的表達水平則在C1～C4型當中依次遞減；DFNB59在C1和C4型當中高表達，而在C2型當中表達水平最低（圖3b～3f）。
圖3
示GSDM基因家族與免疫特征的相關性
a：GSDM基因家族與免疫細胞浸潤水平的相關性散點圖；b～f：不同免疫特征患者的GSDMB（b）、GSDMC（c）、GSDMD（d）、GSDME（e）及DFNB59（f）的表達水平
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原發性肝癌是世界范圍內常見的腫瘤，其發病率高、死亡率高，是癌癥死亡的常見原因。解決原發性肝癌治療難點的關鍵主要在于早期診斷和治療，因此開發新的具有前景的生物標志物以及尋找基因治療靶點，對原發性肝癌的診斷、臨床分期、療效觀察和預后判斷具有重要意義[18]。值得注意的是，許多癌癥研究都有大量的網絡數據支持，包括TCGA、KEGG、GEPIA、基因相互作用和其他網絡分析。基于多個基因分析平臺，一些研究人員已經證明許多關鍵基因在肝癌的發生、發展和預后中起著至關重要的作用[19]。然而，需要發現更多與靶向治療相關的潛在基因，以提供更有效的肝癌治療靶點。細胞焦亡是細胞程序性死亡的一種形式，其特征是細胞膜孔形成、細胞質腫脹、膜破裂，并將白細胞介素1β（IL-1β）等胞質內容物釋放到細胞外環境中，放大局部或全身的炎癥效應。已有研究報道，細胞焦亡與神經系統疾病、傳染病、自身免疫性疾病、心血管疾病和腫瘤密切相關[20-23]。GSDM是一個參與焦亡活化的孔形成蛋白家族，該家族包含6個成員 ［GSDMA～E和DFNB59］。除DFNB59外均包含兩個保守結構域、N端效應域和C端抑制域。在靜息狀態下，GSDM的低聚是通過N端效應域和C端抑制域之間的分子內結合來維持的。然而當在各種微生物和內源刺激下，GSDM被熱解半胱天冬酶蛋白（caspases）所裂解，某些GSDM的N端結構域擠入脂質成分，在細胞膜上形成孔，發揮細胞焦亡誘導作用[24-28]。即使腫瘤使用多種策略來避免或限制細胞死亡途徑，但在某些情況下，腫瘤可以通過不同的方式被殺死，如凋亡、壞死、自噬和焦亡。凋亡和其他死亡模式作為重要的抗癌防御機制已被廣泛研究，但細胞焦亡與癌癥的關系目前尚未完全了解。
生物信息學結合高通量測序可以系統地對疾病相關基因進行全面分析，是研究疾病發病機制的重要手段[29]。本研究試圖通過生信分析初步探索GSDM基因家族在原發性肝癌中的表達水平及其對于臨床分期及預后的臨床意義。通過挖掘TCGA數據庫以及GTEx數據庫中的臨床樣本，結果發現肝癌組織中GSDM基因家族的GSDMA、GSDMC、GSDMD以及GSDME在肝癌組織當中的表達水平均高于正常肝組織，而GSDMB和DFNB59在肝癌組織當中則呈低表達，差異具有統計學意義（P<0.050），并進一步用GEO數據庫驗證了上述表達結果（其中GSDMC的表達水平的差異無統計學意義）。隨后的預后和生存分析結果表明，GSDMD和DFNB59低表達、GSDME高表達患者總體生存率較低，提示肝癌患者的預后不良，表明GSDMD、GSDME以及DFNB59具有作為預測肝癌患者預后的生物標志物的潛力。單因素和多因素Cox比例風險回歸分析結果表明，GSDME可作為預測肝癌患者預后的因子。接下來，本研究又探索了GSDM家族的表達水平與原發性肝癌患者臨床病理分期的相關性，發現隨著肝癌患者TNM分期的增加，GSDMA和GSDMC的表達水平也逐漸增加，表明GSDMA和GSDMC可能參與肝癌的進展及惡化，有可能作為腫瘤臨床分期的生物標志物，同時也是一個潛在的治療靶點。為了進一步探索GSDM影響疾病發生發展的潛在機制，本研究繪制了基因互作的網絡圖，這些與GSDM家族相互作用的基因可能是參與細胞焦亡過程潛在的候選基因。遂又對其進行功能富集分析來探索可能參與的生物學過程，發現這些基因主要富集在細胞焦亡、細胞死亡的調節以及免疫系統當中的細胞因子信號等生物學過程。最后，本研究探索了GSDM基因家族與肝癌腫瘤微環境中6種免疫細胞浸潤的相關性，發現GSDMA、GSDMC與GSDME的表達水平與多種免疫細胞的浸潤水平呈正相關，這表明這些GSDM家族成員的高表達可能與肝癌腫瘤微環境中較高的免疫活性有關。本研究進一步分析了GSDM家族的表達水平與原發性肝癌免疫亞型之間的關系。免疫亞型包括6種：C1（組織愈合型）、C2（γ干擾素主導型）、C3（炎癥型）、C4（淋巴細胞耗竭型）、C5（免疫靜默型）和C6（轉化生長因子β主導型）。本研究結果表明，GSDMB和GSDMD均在C2型當中高表達，GSDME在C1和C2型當中均高表達，同時DFNB59在C1和C4型當中高表達。以往的文獻[30]報道，C1型有升高的血管基因表達、高增殖比例和Th2偏向的獲得性免疫浸潤；C2型有最高的M1/M2巨噬細胞極化、強烈的CD8信號以及最高的抗原受體多樣性；C4型則具有更為顯著的巨噬細胞特征。這些結果進一步表明了GSDM家族的表達水平與肝癌腫瘤微環境的免疫活性密切相關，可能為開發更有效的治療方案提供新的見解。
綜上所述，本研究通過生物信息分析發現，GSDM 基因家族可能參與了肝癌發病機制中與細胞焦亡和免疫相關的生物學過程，具有作為一種反映肝癌臨床分期和預后指標的生物標志物的潛力，可能是改善預后、延長生存期的潛在治療靶點。相信通過對GSDM基因家族的深入研究，進一步挖掘其影響腫瘤發生發展的分子機制，有望在不久的將來應用于臨床，為肝癌患者的早期診斷和個體化精準治療帶來新的希望，實現改善患者生活質量、提高治愈率、降低死亡率的目標。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：郭影負責研究設計、數據處理及論文撰寫，郭秋影主負責論文的審查及修改。
