引用本文： 謝雨宣, 唐紅梅, 李欣, 潘登科, 周佳. GGTA1 基因敲除豬胰島細胞移植到Ⅰ型糖尿病獼猴 3 例報道. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(5): 561-565. doi: 10.7507/1007-9424.202104047 復制
糖尿病是目前嚴重威脅人類健康的世界性疾病之一[1]，中國的糖尿病患者數量位居世界第一[2]，而胰島細胞移植是唯一一種能徹底根治糖尿病的治療方法[3]，其推廣受限于人供體胰腺的稀缺。豬胰島素與人胰島素非常相似，只有一個氨基酸與人的不同[4]，同時異種移植用豬胰島細胞可以無限供應，用于治療Ⅰ型糖尿病（T1DM）有一定的可行性，因此豬胰島細胞得到了廣泛的研究[5-6]，豬胰島細胞被認為是人類胰島的最佳代替來源[7]。國內外已報道了多例豬胰島細胞移植治療非人類靈長類糖尿病猴，取得了良好的效果[8-10]。筆者所在團隊利用 α-1, 3-半乳糖基轉移酶基因（α-1, 3-galactosyltransferase，GGTA1）敲除豬作為胰島細胞來源，開展了胰島移植治療 T1DM 猴的臨床前實驗研究，來探索豬胰島細胞治療 T1DM 的可行性，現將本實驗研究結果匯報如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
健康成年獼猴由四川省人民醫院實驗動物研究所提供（3 只雄猴，年齡分別為 3.0、3.5 和 5.0 歲，體質量分別為 3.7、4.8 和 5.3 kg）。本研究中使用的動物和程序均經四川省醫學科學院·四川省人民醫院倫理委員會批準。此外，實驗動物的照顧和使用完全符合當地動物福利法律、指導方針和政策 ［批文編號：倫審（研）2019 第 240 號］。
1.2 主要耗材和設備
包括注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮（法國維克有限公司）、異氟烷（河北一品制藥股份有限公司）、甘精胰島素注射液（賽諾菲制藥有限公司）、胰島素注射液（江蘇萬邦生物制藥有限公司）和血糖儀（江蘇魚躍血糖儀）。
1.3 糖尿病猴模型的構建
1.3.1 糖尿病猴模型的成模標準
成模后的糖尿病獼猴出現典型糖尿病癥狀（多飲、多食、多尿和體質量明顯減輕）；空腹血糖水平持續≥11.1 mmol/L；尿糖（+++）；空腹血清 C 肽水平低于 0.4 μg/L；在靜脈注射葡萄糖耐量試驗（IVGTT）后，C 肽釋放沒有增加，缺乏 C 肽反應。滿足以上條件，則認為獼猴患有糖尿病，造模成功[10]。
1.3.2 糖尿病猴模型的構建方法
造模前獼猴禁食 12 h，不禁水，配制 0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液作為鏈尿佐菌素（STZ）溶劑，檸檬酸緩沖液的 pH 值在 4.2～4.5。麻醉后獼猴稱重，按 75 mg/kg 劑量稱取 STZ，使用檸檬酸緩沖液溶解 STZ，然后用 0.22 μm 微孔濾膜過濾，配制好后最好在 10 min 內使用。下肢建立靜脈通路，用 10 mL 生理鹽水推注，觀察管路通暢情況，固定好留置針；將配好的 STZ 溶液通過留置針在 5 min 內快速推注進獼猴的血管里，推注時注意觀察獼猴的血壓和心率的變化。推注后補充生理鹽水，可以減少 STZ 的腎毒性，有助于降低糖尿病猴造模時的副作用發生率和死亡率[11-12]。3 只獼猴的低血糖在 STZ 注射后 17～20 h 出現，STZ 注射后 24 h 內每 2 小時監測血糖變化，當血糖低時可在背部皮下注射 50% 葡萄糖注射液使其緩慢吸收，或喂食蘋果等含糖食物升高血糖。STZ 容易潮解失活，快速稱取后需要在 2～8 ℃、干燥避光環境中保存，現配現用。本實驗 3 只獼猴均已達到糖尿病成模標準，實驗過程符合動物倫理學標準。
1.4 豬胰島細胞移植治療糖尿病猴的實驗方法
1.4.1 胰島細胞的分離和移植
異種胰島移植的 GGTA1 基因敲除豬胰島細胞由成都中科奧格生物科技有限公司提供，新生豬胰島移植用量按照獼猴每千克體質量 50 000 IEQ（IEQ 為胰島當量）進行移植，胰島活性分別為 90.0%、85.0% 和 90.0%。獼猴禁食禁水 12 h 后麻醉，采用平臥位固定四肢，常規消毒、鋪巾，取右上腹腹直肌旁切口，暴露腹腔，找到腸系膜上靜脈進行穿刺置管，固定靜脈穿刺管后，連接胰島輸注管路。重力作用下輸注豬胰島細胞懸液（內加肝素抗凝），利用門靜脈的回流將胰島細胞分布至肝臟（圖 1）。術中嚴密觀察獼猴狀態及生命體征；輸入完畢后用沖洗液沖洗輸液管道，取出靜脈穿刺管，按壓穿刺點止血，回納腸管至腹腔，關閉腹腔。
圖1
示經受體猴腸系膜靜脈輸注豬胰島細胞懸液
1.4.2 免疫抑制方案
① 兔抗人胸腺細胞免疫球蛋白（ATG）：術前 2 d 至術后 2 d，每日以 2.2 mg/kg 劑量靜脈輸入 1 次，進行免疫誘導治療；② 他克莫司：術前 3 d 開始每天早晨和晚上各 1 次，每次 1 mg 灌服，每周監測血藥濃度，維持在 3～8 ng/mL；③ 西羅莫司：術前 3 d 開始每日 1 mg，1 d 1 次灌服，每周監測血藥濃度，維持在 8～12 ng/mL。
1.4.3 IVGTT
移植后第 3～4 周行 IVGTT 試驗，在沒有外源性胰島素干擾的前提下，每只獼猴禁食 12 h 后以 0.5 g/kg 靜脈推注 50% 葡萄糖注射液，在 1 min 內推注完畢，分別于 0、5、15、30、45、60、90、120 和 150 min 取靜脈血測血糖，檢測獼猴移植后豬胰島細胞對葡萄糖刺激的反應。
1.5 手術管理
1.5.1 術前管理
① 完成各種常規術前檢查：如血常規、糖化血紅蛋白、血生化、C 肽、IVGTT 等檢查。② 血糖控制：每日早、中、晚 3 餐前監測空腹血糖，根據血糖情況調整胰島素用量，使血糖盡量控制在正常范圍 3.9～6.1 mmol/L[13]。③ 術前用藥觀察：術前使用兔抗人 ATG 進行免疫誘導，密切觀察用藥后的不良反應[14]，如是否發生寒戰、發熱等癥狀，并控制輸液速度（1 h 以上），使用兔抗人 ATG 前準備好抗過敏和抗休克的藥物，如地塞米松。④ 獼猴準備：術前禁食 12 h、禁飲 8 h。按腹腔手術需要備皮（上方齊平乳頭連線，下方至恥骨聯合兩側到腋后線），清洗皮膚，這有利于消毒和保持無菌狀態。⑤ 手術器械、用物準備：準備普通開腹器械、無菌包、高頻電刀、刀片、無菌紗布若干、一次性無菌手套若干、22G 靜脈留置針、一次性使用輸液器、血糖儀、血糖試紙和獼猴防撓背心。
1.5.2 術后管理
① 生命體征監測：術后繼續給予心電監護和氧氣吸入，密切觀察生命體征變化，保持呼吸道通暢，直至麻醉蘇醒、恢復自主呼吸。② 傷口護理：因術后常規應用免疫抑制劑，抵抗力低，容易發生切口感染，需注意護理。③ 血糖控制：異種移植后容易發生免疫排斥反應，胰島細胞被破壞、釋放胰島素，導致低血糖的發生，因此應注意觀察獼猴術后的精神狀態和飲食情況，24 h 內每2 小時監測 1 次血糖變化，血糖≤2.0 mmol/L 時給予 50% 葡萄糖注射液靜脈注射，根據血糖波動情況調整胰島素用量，警惕低血糖和高血糖的發生。④ 用藥管理：胰島移植后需要長時間服用西羅莫司、他克莫司免疫抑制劑，需要定期監測血藥濃度[15]。除常規移植后用藥，還需應用依那西普（一種用于治療類風濕關節炎和強直性脊柱炎的藥物），用于減輕經血液介導的炎癥反應對胰島細胞的損害[16]，依那西普用藥時易發生過敏反應，還需觀察用藥后不良反應，準備抗過敏和抗休克的藥物。⑤ 指標檢測：用常規檢測方法檢測術后血常規、肝腎功能指標，由于經受手術，體內內環境會發生明顯變化，需要隨時監測體內內環境的恢復情況，以及門靜脈移植后肝腎功能的受損情況。
1.5.3 并發癥的預防及處理
① 預防糖尿病酮癥酸中毒：使用 STZ 會對恒河猴胰島 β 細胞造成損害[17]，此時胰島無法分泌胰島素，身體發生不適，產生應激反應，進食量減少，甚至不進食。當機體缺乏胰島素時，組織和細胞也無法有效攝取和利用血液中的葡萄糖，會促使脂肪分解產生大量酸性酮體，從而導致糖尿病酮癥酸中毒的發生。應多觀察獼猴每日三餐進食情況，合理運用胰島素，防止發生低血糖反應。② 糖尿病酮癥酸中毒的處理措施：術后觀察獼猴是否出現酮癥酸中毒癥狀，酮癥酸中毒表現為高血糖（血糖≥30.0 mmol/L）、高血酮（≥1.0 mmol/L）、多飲、多尿、食欲減退、惡心嘔吐等。可通過靜脈補液（輸入氯化鉀、復方氨基酸、復方氯化鈉等）糾正水、電解質平衡，補充營養，使用碳酸氫鈉注射液靜脈滴注，補充胰島素，促進機體利用葡萄糖，減少脂肪分解，當血糖降低至 13.9 mmol/L以下時，同時補充 5% 葡萄糖注射液和胰島素，快速減少酮體的產生[18]。同時插胃管溫水灌胃，喂服碳酸氫鈉片中和胃酸，給予多酶片增加食欲。
2 結果
移植治療效果：3 例實驗猴成功進行胰島細胞移植治療，術后生命體征平穩，未發生靜脈栓塞癥狀，均健康存活。12 周內能檢測到特異性豬 C 肽，移植后血糖較術前均有較明顯降低，3 只猴術前平均空腹血糖分別為：19.8、16.7 和 15.9 mmol/L，術后平均空腹血糖分別為 14.3、15.2 和 13.3 mmol/L；平均每日外源性胰島素用量也明顯下降，術前平均分別為 15.38、14.23 和 16.55 U，術后平均分別為 10.24、12.96 和 11.24 U；胰島移植前后 IVGTT 試驗結果差異顯著：胰島移植前，高糖靜脈注射后血糖在 150 min 內維持高位，沒有下降；胰島移植后，高糖靜脈注射后血糖在 5 min 時血糖達到最高值，而后開始降低，150 min 時血糖恢復到高糖注射前水平（圖 2）。
圖2
示第 3 只獼猴移植前后 IVGTT 實驗期間血糖水平的變化
術后有 1 只獼猴發生傷口感染，出現發炎、紅腫癥狀，予以每日消毒傷口、更換敷料、頭孢唑啉鈉 10 mg/kg 肌肉注射抗感染等處理后，傷口感染得到控制。3 只獼猴移植術后服用阿司匹林抗凝，未發生靜脈栓塞等癥狀。實驗過程中 3 只獼猴在成模后 1 周左右、胰島移植術后均出現了酮癥酸中毒癥狀，血糖持續≥25.0 mmol/L，進食量減少，經靜脈補液、補充營養、插胃管溫水灌胃等治療后，血酮、血糖恢復正常，酸中毒緩解。實驗期間獼猴應用他克莫司、西羅莫司、依那西普等免疫抑制劑后沒有發生用藥不良反應；1 和 3 號獼猴在手術當天胰島細胞進入肝臟后，血清谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）指標對比手術前有升高，2 號猴移植后肝功能無明顯損傷，可能與胰島細胞進入肝臟定植對肝臟產生影響有關；1 和 3 號獼猴在 4 周后指標開始逐漸下降，2 號猴在 8 周后指標開始下降，16 周時均基本恢復正常（表 1）；移植物進入肝臟后未對其他的器官造成損害，獼猴均健康存活達16 周。
表1
移植前后 3 只獼猴的血常規及血生化指標變化
3 討論
胰島細胞移植能夠糾正糖尿病患者的糖代謝異常[19]，能實現完全脫離外源性胰島素，并有微創治療的特性，是一種有巨大潛力和應用前景的治療方法[20-24]。由于人供體胰島的稀缺，對豬胰島細胞移植的研究受到了廣泛關注。隨著近年來基因編輯技術的快速發展，能更加高效的開發基因修飾豬，推進了異種移植的臨床前研究。使用更有效的免疫抑制方案和基因修飾豬胰島的異種移植有可能實現長期持續的胰島素脫離，但預計得到豬胰島移植臨床 T1DM 標準治療方法和結果還需要一些時間[25-26]。
本研究豬胰島移植采用的是 GGTA1 基因敲除的新生豬胰島細胞，GGTA1 基因敲除基本解決了異種移植的超急性排斥反應。傳統的 Edmonton 免疫抑制方案是由抗 CD25 單克隆抗體、他克莫司和西羅莫司組成的三聯用藥方案，本實驗在 Edmonton 方案的基礎上，將抗 CD25 單克隆抗體改為 ATG，從而有利于移植免疫耐受的形成。移植后糖尿病猴的血糖降低，結合外源性胰島素治療，3 只糖尿病猴均健康存活，未出現其他并發癥。筆者通過總結這幾例異種胰島細胞移植，認為要延長豬胰島細胞存活并發揮功能的時間，還需加強對基因修飾豬的改造，篩選適用于異種胰島移植的基因型組合，得到免疫原性更低、人源化的豬胰島細胞。應摸索圍手術期及手術后的免疫抑制劑方案，探索應用如單克隆抗體之類的高靶向性的免疫抑制劑，以阻斷主要的協同刺激通路，抑制 T 細胞的激活，誘導免疫耐受，從而極大地降低免疫排斥反應程度。筆者總結手術過程：嚴格執行無菌操作，采用適當的抗凝和預防感染治療措施，可以減少術后嚴重感染、血管栓塞等并發癥的發生；移植時盡量選擇粗細合適的靜脈穿刺管，保證穿刺成功和胰島懸液輸注通暢；剪去輸液器上的濾膜，防止對胰島細胞的過濾；嚴密監測血糖，控制血糖保持穩定，有利于胰島細胞存活，觀察免疫抑制劑用藥后的不良反應，對保證治療療效有重要意義。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：謝雨宣收集資料并撰寫論文；唐紅梅修改論文；李欣審核資料，潘登科負責課題設計和修改論文；周佳對文稿進行審閱及修改。
倫理聲明：本研究已通過四川省醫學科學院·四川省人民醫院的倫理審核批準［批文編號：倫審（研）2019 第 240 號］。
糖尿病是目前嚴重威脅人類健康的世界性疾病之一[1]，中國的糖尿病患者數量位居世界第一[2]，而胰島細胞移植是唯一一種能徹底根治糖尿病的治療方法[3]，其推廣受限于人供體胰腺的稀缺。豬胰島素與人胰島素非常相似，只有一個氨基酸與人的不同[4]，同時異種移植用豬胰島細胞可以無限供應，用于治療Ⅰ型糖尿病（T1DM）有一定的可行性，因此豬胰島細胞得到了廣泛的研究[5-6]，豬胰島細胞被認為是人類胰島的最佳代替來源[7]。國內外已報道了多例豬胰島細胞移植治療非人類靈長類糖尿病猴，取得了良好的效果[8-10]。筆者所在團隊利用 α-1, 3-半乳糖基轉移酶基因（α-1, 3-galactosyltransferase，GGTA1）敲除豬作為胰島細胞來源，開展了胰島移植治療 T1DM 猴的臨床前實驗研究，來探索豬胰島細胞治療 T1DM 的可行性，現將本實驗研究結果匯報如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
健康成年獼猴由四川省人民醫院實驗動物研究所提供（3 只雄猴，年齡分別為 3.0、3.5 和 5.0 歲，體質量分別為 3.7、4.8 和 5.3 kg）。本研究中使用的動物和程序均經四川省醫學科學院·四川省人民醫院倫理委員會批準。此外，實驗動物的照顧和使用完全符合當地動物福利法律、指導方針和政策 ［批文編號：倫審（研）2019 第 240 號］。
1.2 主要耗材和設備
包括注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮（法國維克有限公司）、異氟烷（河北一品制藥股份有限公司）、甘精胰島素注射液（賽諾菲制藥有限公司）、胰島素注射液（江蘇萬邦生物制藥有限公司）和血糖儀（江蘇魚躍血糖儀）。
1.3 糖尿病猴模型的構建
1.3.1 糖尿病猴模型的成模標準
成模后的糖尿病獼猴出現典型糖尿病癥狀（多飲、多食、多尿和體質量明顯減輕）；空腹血糖水平持續≥11.1 mmol/L；尿糖（+++）；空腹血清 C 肽水平低于 0.4 μg/L；在靜脈注射葡萄糖耐量試驗（IVGTT）后，C 肽釋放沒有增加，缺乏 C 肽反應。滿足以上條件，則認為獼猴患有糖尿病，造模成功[10]。
1.3.2 糖尿病猴模型的構建方法
造模前獼猴禁食 12 h，不禁水，配制 0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液作為鏈尿佐菌素（STZ）溶劑，檸檬酸緩沖液的 pH 值在 4.2～4.5。麻醉后獼猴稱重，按 75 mg/kg 劑量稱取 STZ，使用檸檬酸緩沖液溶解 STZ，然后用 0.22 μm 微孔濾膜過濾，配制好后最好在 10 min 內使用。下肢建立靜脈通路，用 10 mL 生理鹽水推注，觀察管路通暢情況，固定好留置針；將配好的 STZ 溶液通過留置針在 5 min 內快速推注進獼猴的血管里，推注時注意觀察獼猴的血壓和心率的變化。推注后補充生理鹽水，可以減少 STZ 的腎毒性，有助于降低糖尿病猴造模時的副作用發生率和死亡率[11-12]。3 只獼猴的低血糖在 STZ 注射后 17～20 h 出現，STZ 注射后 24 h 內每 2 小時監測血糖變化，當血糖低時可在背部皮下注射 50% 葡萄糖注射液使其緩慢吸收，或喂食蘋果等含糖食物升高血糖。STZ 容易潮解失活，快速稱取后需要在 2～8 ℃、干燥避光環境中保存，現配現用。本實驗 3 只獼猴均已達到糖尿病成模標準，實驗過程符合動物倫理學標準。
1.4 豬胰島細胞移植治療糖尿病猴的實驗方法
1.4.1 胰島細胞的分離和移植
異種胰島移植的 GGTA1 基因敲除豬胰島細胞由成都中科奧格生物科技有限公司提供，新生豬胰島移植用量按照獼猴每千克體質量 50 000 IEQ（IEQ 為胰島當量）進行移植，胰島活性分別為 90.0%、85.0% 和 90.0%。獼猴禁食禁水 12 h 后麻醉，采用平臥位固定四肢，常規消毒、鋪巾，取右上腹腹直肌旁切口，暴露腹腔，找到腸系膜上靜脈進行穿刺置管，固定靜脈穿刺管后，連接胰島輸注管路。重力作用下輸注豬胰島細胞懸液（內加肝素抗凝），利用門靜脈的回流將胰島細胞分布至肝臟（圖 1）。術中嚴密觀察獼猴狀態及生命體征；輸入完畢后用沖洗液沖洗輸液管道，取出靜脈穿刺管，按壓穿刺點止血，回納腸管至腹腔，關閉腹腔。
圖1
示經受體猴腸系膜靜脈輸注豬胰島細胞懸液
1.4.2 免疫抑制方案
① 兔抗人胸腺細胞免疫球蛋白（ATG）：術前 2 d 至術后 2 d，每日以 2.2 mg/kg 劑量靜脈輸入 1 次，進行免疫誘導治療；② 他克莫司：術前 3 d 開始每天早晨和晚上各 1 次，每次 1 mg 灌服，每周監測血藥濃度，維持在 3～8 ng/mL；③ 西羅莫司：術前 3 d 開始每日 1 mg，1 d 1 次灌服，每周監測血藥濃度，維持在 8～12 ng/mL。
1.4.3 IVGTT
移植后第 3～4 周行 IVGTT 試驗，在沒有外源性胰島素干擾的前提下，每只獼猴禁食 12 h 后以 0.5 g/kg 靜脈推注 50% 葡萄糖注射液，在 1 min 內推注完畢，分別于 0、5、15、30、45、60、90、120 和 150 min 取靜脈血測血糖，檢測獼猴移植后豬胰島細胞對葡萄糖刺激的反應。
1.5 手術管理
1.5.1 術前管理
① 完成各種常規術前檢查：如血常規、糖化血紅蛋白、血生化、C 肽、IVGTT 等檢查。② 血糖控制：每日早、中、晚 3 餐前監測空腹血糖，根據血糖情況調整胰島素用量，使血糖盡量控制在正常范圍 3.9～6.1 mmol/L[13]。③ 術前用藥觀察：術前使用兔抗人 ATG 進行免疫誘導，密切觀察用藥后的不良反應[14]，如是否發生寒戰、發熱等癥狀，并控制輸液速度（1 h 以上），使用兔抗人 ATG 前準備好抗過敏和抗休克的藥物，如地塞米松。④ 獼猴準備：術前禁食 12 h、禁飲 8 h。按腹腔手術需要備皮（上方齊平乳頭連線，下方至恥骨聯合兩側到腋后線），清洗皮膚，這有利于消毒和保持無菌狀態。⑤ 手術器械、用物準備：準備普通開腹器械、無菌包、高頻電刀、刀片、無菌紗布若干、一次性無菌手套若干、22G 靜脈留置針、一次性使用輸液器、血糖儀、血糖試紙和獼猴防撓背心。
1.5.2 術后管理
① 生命體征監測：術后繼續給予心電監護和氧氣吸入，密切觀察生命體征變化，保持呼吸道通暢，直至麻醉蘇醒、恢復自主呼吸。② 傷口護理：因術后常規應用免疫抑制劑，抵抗力低，容易發生切口感染，需注意護理。③ 血糖控制：異種移植后容易發生免疫排斥反應，胰島細胞被破壞、釋放胰島素，導致低血糖的發生，因此應注意觀察獼猴術后的精神狀態和飲食情況，24 h 內每2 小時監測 1 次血糖變化，血糖≤2.0 mmol/L 時給予 50% 葡萄糖注射液靜脈注射，根據血糖波動情況調整胰島素用量，警惕低血糖和高血糖的發生。④ 用藥管理：胰島移植后需要長時間服用西羅莫司、他克莫司免疫抑制劑，需要定期監測血藥濃度[15]。除常規移植后用藥，還需應用依那西普（一種用于治療類風濕關節炎和強直性脊柱炎的藥物），用于減輕經血液介導的炎癥反應對胰島細胞的損害[16]，依那西普用藥時易發生過敏反應，還需觀察用藥后不良反應，準備抗過敏和抗休克的藥物。⑤ 指標檢測：用常規檢測方法檢測術后血常規、肝腎功能指標，由于經受手術，體內內環境會發生明顯變化，需要隨時監測體內內環境的恢復情況，以及門靜脈移植后肝腎功能的受損情況。
1.5.3 并發癥的預防及處理
① 預防糖尿病酮癥酸中毒：使用 STZ 會對恒河猴胰島 β 細胞造成損害[17]，此時胰島無法分泌胰島素，身體發生不適，產生應激反應，進食量減少，甚至不進食。當機體缺乏胰島素時，組織和細胞也無法有效攝取和利用血液中的葡萄糖，會促使脂肪分解產生大量酸性酮體，從而導致糖尿病酮癥酸中毒的發生。應多觀察獼猴每日三餐進食情況，合理運用胰島素，防止發生低血糖反應。② 糖尿病酮癥酸中毒的處理措施：術后觀察獼猴是否出現酮癥酸中毒癥狀，酮癥酸中毒表現為高血糖（血糖≥30.0 mmol/L）、高血酮（≥1.0 mmol/L）、多飲、多尿、食欲減退、惡心嘔吐等。可通過靜脈補液（輸入氯化鉀、復方氨基酸、復方氯化鈉等）糾正水、電解質平衡，補充營養，使用碳酸氫鈉注射液靜脈滴注，補充胰島素，促進機體利用葡萄糖，減少脂肪分解，當血糖降低至 13.9 mmol/L以下時，同時補充 5% 葡萄糖注射液和胰島素，快速減少酮體的產生[18]。同時插胃管溫水灌胃，喂服碳酸氫鈉片中和胃酸，給予多酶片增加食欲。
2 結果
移植治療效果：3 例實驗猴成功進行胰島細胞移植治療，術后生命體征平穩，未發生靜脈栓塞癥狀，均健康存活。12 周內能檢測到特異性豬 C 肽，移植后血糖較術前均有較明顯降低，3 只猴術前平均空腹血糖分別為：19.8、16.7 和 15.9 mmol/L，術后平均空腹血糖分別為 14.3、15.2 和 13.3 mmol/L；平均每日外源性胰島素用量也明顯下降，術前平均分別為 15.38、14.23 和 16.55 U，術后平均分別為 10.24、12.96 和 11.24 U；胰島移植前后 IVGTT 試驗結果差異顯著：胰島移植前，高糖靜脈注射后血糖在 150 min 內維持高位，沒有下降；胰島移植后，高糖靜脈注射后血糖在 5 min 時血糖達到最高值，而后開始降低，150 min 時血糖恢復到高糖注射前水平（圖 2）。
圖2
示第 3 只獼猴移植前后 IVGTT 實驗期間血糖水平的變化
術后有 1 只獼猴發生傷口感染，出現發炎、紅腫癥狀，予以每日消毒傷口、更換敷料、頭孢唑啉鈉 10 mg/kg 肌肉注射抗感染等處理后，傷口感染得到控制。3 只獼猴移植術后服用阿司匹林抗凝，未發生靜脈栓塞等癥狀。實驗過程中 3 只獼猴在成模后 1 周左右、胰島移植術后均出現了酮癥酸中毒癥狀，血糖持續≥25.0 mmol/L，進食量減少，經靜脈補液、補充營養、插胃管溫水灌胃等治療后，血酮、血糖恢復正常，酸中毒緩解。實驗期間獼猴應用他克莫司、西羅莫司、依那西普等免疫抑制劑后沒有發生用藥不良反應；1 和 3 號獼猴在手術當天胰島細胞進入肝臟后，血清谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）指標對比手術前有升高，2 號猴移植后肝功能無明顯損傷，可能與胰島細胞進入肝臟定植對肝臟產生影響有關；1 和 3 號獼猴在 4 周后指標開始逐漸下降，2 號猴在 8 周后指標開始下降，16 周時均基本恢復正常（表 1）；移植物進入肝臟后未對其他的器官造成損害，獼猴均健康存活達16 周。
表1
移植前后 3 只獼猴的血常規及血生化指標變化
3 討論
胰島細胞移植能夠糾正糖尿病患者的糖代謝異常[19]，能實現完全脫離外源性胰島素，并有微創治療的特性，是一種有巨大潛力和應用前景的治療方法[20-24]。由于人供體胰島的稀缺，對豬胰島細胞移植的研究受到了廣泛關注。隨著近年來基因編輯技術的快速發展，能更加高效的開發基因修飾豬，推進了異種移植的臨床前研究。使用更有效的免疫抑制方案和基因修飾豬胰島的異種移植有可能實現長期持續的胰島素脫離，但預計得到豬胰島移植臨床 T1DM 標準治療方法和結果還需要一些時間[25-26]。
本研究豬胰島移植采用的是 GGTA1 基因敲除的新生豬胰島細胞，GGTA1 基因敲除基本解決了異種移植的超急性排斥反應。傳統的 Edmonton 免疫抑制方案是由抗 CD25 單克隆抗體、他克莫司和西羅莫司組成的三聯用藥方案，本實驗在 Edmonton 方案的基礎上，將抗 CD25 單克隆抗體改為 ATG，從而有利于移植免疫耐受的形成。移植后糖尿病猴的血糖降低，結合外源性胰島素治療，3 只糖尿病猴均健康存活，未出現其他并發癥。筆者通過總結這幾例異種胰島細胞移植，認為要延長豬胰島細胞存活并發揮功能的時間，還需加強對基因修飾豬的改造，篩選適用于異種胰島移植的基因型組合，得到免疫原性更低、人源化的豬胰島細胞。應摸索圍手術期及手術后的免疫抑制劑方案，探索應用如單克隆抗體之類的高靶向性的免疫抑制劑，以阻斷主要的協同刺激通路，抑制 T 細胞的激活，誘導免疫耐受，從而極大地降低免疫排斥反應程度。筆者總結手術過程：嚴格執行無菌操作，采用適當的抗凝和預防感染治療措施，可以減少術后嚴重感染、血管栓塞等并發癥的發生；移植時盡量選擇粗細合適的靜脈穿刺管，保證穿刺成功和胰島懸液輸注通暢；剪去輸液器上的濾膜，防止對胰島細胞的過濾；嚴密監測血糖，控制血糖保持穩定，有利于胰島細胞存活，觀察免疫抑制劑用藥后的不良反應，對保證治療療效有重要意義。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：謝雨宣收集資料并撰寫論文；唐紅梅修改論文；李欣審核資料，潘登科負責課題設計和修改論文；周佳對文稿進行審閱及修改。
倫理聲明：本研究已通過四川省醫學科學院·四川省人民醫院的倫理審核批準［批文編號：倫審（研）2019 第 240 號］。
