引用本文： 杜志興, 魏孔孔, 宋天亮, 王紀澤, 楊金偉, 周輝年, 張泠漪. 基于生物信息學分析丙肝和乙肝相關肝細胞癌的基因組學差異. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(12): 1604-1611. doi: 10.7507/1007-9424.202103120 復制
肝細胞癌（HCC）是消化系統常見的惡性腫瘤之一，最新的統計數據顯示其發病率居全球惡性腫瘤第 6 位，病死率位居第 3 位[1]。HCC 具有明顯的地域差異，西方國家的 HCC 主要源于酒精性脂肪性肝病，而在東亞尤其是中國，HCC 主要由病毒性肝炎所致[2]。隨著靶向藥物的開發和早期診斷率的提高，HCC 的外科切除機會有所提升，同時分子靶向藥物也在一定程度上延長了 HCC 患者的生存期，但 HCC 人群總體預后仍然較差[3]。世界范圍內 HCC 的主要風險因素如乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、過量飲酒、黃曲霉毒素、肥胖、吸煙、2 型糖尿病等都存在地區差異[4]。HBV 是 DNA 病毒，HCV 屬于 RNA 病毒，二者的抗病毒方案和終致終末期肝病的分子生物學過程也不盡相同。因此，探究二者在致 HCC 過程中的基因組變化差異、分析其潛在的生物學過程，對于我們了解和掌握不同肝炎病毒的致癌分子機制很有幫助，同時也可為早期預警 HCC 高危的病毒性肝炎患者提供必要的參考。目前，微陣列分析技術是評估生物體中基因組表達水平重要的生物信息學分析工具[5]。公共基因表達數據庫如基因表達數據庫（gene expression omnibus，GEO）[6]、癌癥基因組圖譜（
1 資料與方法
1.1 數據下載及處理
從 GEO 數據庫（
1.2 差異基因分析
繼續使用 limma 包對 HCV-HCC 和 HBV-HCC 樣本的基因表達水平進行差異分析，將其符合|log2FC（fold change，變化倍數）|>1 且P<0.05 的基因認定為 DEG。當 log2FC>1 時，說明該基因在 HCV-HCC 樣本中呈現高水平表達，當 log2FC<1 時，說明該基因在 HCV-HCC 樣本中呈現低水平表達。
1.3 基因集富集分析（GSEA）
以 HBV-HCC 為對照，通過 clusterProfiler 包[7]進行 GSEA[8]，評估 HCV-HCC 與 HBV-HCC 樣本比較后分析基因表達水平激活或抑制基因集的狀況，以反映 HCV-HCC 所表現出的特有的生物學過程，以P<0.05 作為差異基因集的篩選條件。
1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建
將 DEGs 在 STRING（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，
1.5 關鍵基因的基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析
clusterProfiler 包還可用來完成基因和基因簇功能譜的統計分析和可視化，我們利用該 R 包完成對關鍵基因的 GO 和 KEGG（
1.6 關鍵基因對生存影響的分析
為明確關鍵基因是否影響有肝炎病毒（HV）和無肝炎病毒（NHV）感染相關的 HCC 患者的預后，我們利用 Kaplan-Meier Plotter 數據庫（
2 結果
2.1 基因表達矩陣標準化及 DEG 分析結果
數據提取后共獲得 HBV-HCC 樣本 119 例，HCV-HCC 樣本 163 例，該矩陣的標準化過程見圖 1a、1b。按照 DEG 的篩選條件，共獲得 199 個 DEGs，其中 139 個上調基因，60 個下調基因，見圖 1c。
圖1
示 HBV-HCC 和 HCV-HCC 樣本基因總體表達水平標準化、差異分析及 GSEA 結果
a、b：分別表示基因總體表達水平標準化前后（藍色：HBV-HCC 樣本；紅色：HCV-HCC 樣本）；c：DEGs（紅色代表 HCV-HCC 中的上調基因，綠色代表 HCV-HCC 中的下調基因）；d：HCV-HCC 樣本所表現出的激活或抑制的基因集結果
2.2 GSEA 結果
與 HBV-HCC 相比，HCV-HCC 患者中明顯受到激活的基因集主要集中在炎癥相關和上調對干擾素反應的基因集，而明顯被抑制的基因集則主要體現在細胞周期相關的基因集，見圖 1d。
2.3 PPI 網絡構建結果
將 199 個 DEGs 在 STRING 數據庫中構建了 PPI 網絡（圖 2），包含了 124 個基因組成的 375 對相互關系，平均基因間互作關系度為 4.39，PPI 網絡富集的P值為 1.0E-16。下載 PPI 網絡數據并導入 cytoScape 軟件，利用 MCODE 插件篩選關鍵分子模塊，共發現 8 個 DEGs 所富集的關鍵分子模塊，8 個模塊的詳細信息見表 1。其中第 1 個聚類包含基因數最多（18 個），得分最高，因此，我們將其認定為最重要的分子模塊，其包含的 18 個基因被認定為關鍵基因。此外，我們也發現，與 HBV-HCC 相比，這 18 個關鍵基因在 HCV-HCC 中均呈明顯高表達（log2FC>1，表 2）。
圖2
示 DEGs 在 STRING 數據庫中構建的 PPI 網絡（線條粗細代表基因間互作證據的強弱）
表1
DEGs 所富集的關鍵分子模塊
表2
18 個關鍵基因的差異分析結果
2.4 GO 和 KEGG 分析結果
對 18 個關鍵基因的 GO 分析結果顯示，其生物學過程主要集中在與病毒感染相關的機體反應中（圖 3a），細胞組分主要以宿主細胞為主（圖 3b），分子功能則主要是富集在生物學結合（圖 3c）。KEGG 通路富集分析結果顯示，這 18 個關鍵基因參與了病毒感染相關的分子信號通路（圖 3d）。
圖3
示關鍵基因 GO 分析結果顯示生物學過程（a）、細胞組分（b）及分子功能（c）和 KEGG 通路分析（d）
2.5 關鍵基因對預后生存的影響分析結果
18 個關鍵基因對總體 HCC 患者的生存影響不盡相同，結果見圖 4 和表 3。① 與總體患者預后有關的基因有 9 個：CXCL10、HERC6、DDX60、IFITM1、IFI27、GBP4、IFI44L、IFI44 和 MX1，且這 9 個基因均與良好預后有關（HR<1，P<0.05），對其進行亞組分析時發現，HERC6、DDX60、IFI44L、IFI44、MX1 這 5 個基因在 HV 患者中與不良預后有關（HR>1，P<0.05）、在 NHV 患者中與良好預后有關（HR<1，P<0.05），而 CXCL10 在 HV 和 NHV 患者中與預后均無關（P>0.05），IFITM1 在 HV 患者中與不良預后無關（P>0.05）、在 NHV 患者中與良好預后有關（HR<1，P<0.05）。② 與總體患者預后無關的基因也有 9 個：CMPK2、RSAD2、HERC5、IFIT1、EPSTI1、ISG15、OAS1、IRF9 和 OAS3；對其進行亞組分析時發現，HERC5 和 EPSTI1 這 2 個基因在 HV 患者中與不良預后有關（HR>1，P<0.05）、在 NHV 患者中與良好預后有關（HR<1，P<0.05），而 CMPK2、ISG15、OAS1 和 OAS3 這 4 個基因在 HV 患者中與不良預后有關（HR>1，P<0.05）、在 NHV 患者中與預后無關（P>0.05），RSAD2、IFIT1、IRF9 這 3 個基因在 NHV 患者中與良好預后有關（HR<1，P<0.05）、在 HV 患者中與預后無關（P>0.05）。
圖4
示關鍵基因在 HV 或 NHV 感染 HCC 患者中的生存分析結果
表3
18 個關鍵基因對總體 HCC、HV-HCC 以及 NHV-HCC 患者總生存時間的影響
3 討論
統計數據[10]顯示，與未感染 HBV 和 HCV 人群相比，HBV 和 HCV 者罹患 HCC 的風險要增加 15～20 倍。在我國，病毒性肝炎相關的 HCC 也是最為突出的健康問題之一[11]。隨著 HBV 疫苗的廣泛使用，HBV-HCC 的發病趨勢有逐漸延緩的趨勢，但對于沒有疫苗阻斷傳播的 HCV，積極地抗病毒治療和定期規律隨訪成為評估病情變化的主要手段，但目前并沒有切實可行的標志物或者措施來更好地監測 HCV 感染發展為終末期肝病的趨勢。
惡性腫瘤的發生是一個復雜而循序漸進的過程，細胞基因組改變和微環境相互作用共同促進癌變的發生，HCC 也不例外。慢性 HBV 感染就被認為是 HBV 特異性免疫耐受的結果[12]，同時這種免疫耐受所形成的炎癥微環境是 HBV-HCC 的一大主要促癌環境。從基因角度看，現有的證據表明，HBV-DNA 與宿主 DNA 在不同位點的整合被認為是 HBV 相關性 HCC 發病機制中的關鍵一步，這不僅會引起周圍細胞序列的改變，而且還通過激活反轉錄而干擾正常細胞基因的表達[13]，在這個過程中，同時也誘導了更多的細胞因子如細胞周期調節因子、失活負生長調節因子或基因家族如抑制 p53 基因等來共同參與癌變的初始調節[14]。相比 HBV，HCV 感染與 HCC 的因果關系在最近 10 年來才逐漸被揭開[15]。HCV-HCC 則表現出更高的異質性、更特殊的個體差異，這可能與 HCV 基因組序列的不同有關。目前，HCV 基因組序列包括 7 種不同的基因型[16]，各型之間的地理分布也存在著明顯差異[17]，但目前針對不同的 HCV 基因型在促進 HCC 進展和作為 HCC 危險因素的作用仍存在爭議。慢性 HCV 患者發生 HCC 的風險取決于纖維化階段的嚴重程度，其進展速度每年為 2%～6%[18-19]。HCV 導致肝臟炎癥的分子途徑比較復雜，至今仍無明確定論，現有的證據主要集中在 HCV 直接的病毒作用和其他間接機制，如細胞因子途徑、氧化應激、脂肪變性誘導等，也就是說 HCV 致 HCC 的出現更多是與微環境共同作用的結果，而對于 HCV 本身是否具有直接致癌作用仍不確定[20]。來自Estevez等[21]的結果表明，HCV 可能通過調節促進肝細胞惡性轉化的途徑而參與 HCC 的發生，但諸多細節仍不清楚。因此，在本研究中，我們利用來源于同一個注釋平臺的基因表達數據來比較了 HCV-HCC 與 HBV-HCC 之間基因表達的不同，并從表達水平的角度分析了二者之間的生物學過程差異。
本研究結果顯示，與 HBV-HCC 相比，HCV-HCC 激活的基因集主要包括炎癥和補體相關的基因集，如定義炎癥反應的基因、編碼補體系統組成部分的基因、通過 STAT3 途徑被 IL6 上調的基因、在 IL2 刺激下被 STAT5 上調的基因等，這些證據更加豐富了 HCV-HCC 的發生與免疫反應誘導的微環境的確切關系。除此之外，本研究還發現，在 HCV-HCC 患者中，上調對 α 干擾素反應的基因以及上調對 γ 干擾素反應的基因被明顯激活，機體對于干擾素的反應與機體產生慢性感染有關，因此，這些證據的相互支持提示 HCV-HCC 與免疫微環境的關系十分密切。同時還發現，在 HCV-HCC 患者中 KRAS 激活上調基因，經核因子（NF）-kB 對腫瘤壞死因子（TNF）調控的基因、通過激活半胱天冬酶介導程序性細胞死亡的基因等相關基因集的激活，這也說明促癌基因的激活也在 HCV-HCC 發生的過程中扮演著重要角色；而與細胞周期相關的基因集如在細胞分裂周期的進展中參與 G2/M 檢查點的基因和 E2F_TARGETS 編碼 E2F 轉錄因子細胞周期相關靶點的基因卻得到了明顯的抑制，這在一定程度上體現了 HCV-HCC 細胞的增殖惰性，也可能預示藥物治療效果不佳。與 HBV-HCC 比較，HCV-HCC 中呈現高表達的 18 個關鍵基因被確定，這些關鍵基因主要參與了機體對病毒的響應以及病毒基因組的復制，分子通路則主要體現在 EB 病毒感染和 NOD 樣受體信號通路，視黃酸（維甲酸）誘導基因蛋白Ⅰ（RIG- Ⅰ）樣受體信號通路等。NOD 樣受體通過啟動天然免疫和激活適應性免疫參與介導免疫識別[22]，而在病毒感染過程中，RIG- Ⅰ 在啟動Ⅰ型干擾素信號通路和防止病毒在宿主細胞中的感染或復制中起著重要作用[23]，這些結果說明，HCV-HCC 的發生與機體病毒的復制過程密切相關，也從另一個角度反映了對 HCV 患者進行積極抗病毒治療的必要性，這些結果也反映了 HBV-HCC 與 HCV-HCC 發病機制的差異。針對 18 個關鍵基因的生存分析顯示，CXCL10、HERC6、DDX60、IFITM1、IFI27、GBP4、IFI44L、IFI44 和 MX1 在 HCC 患者中與良好預后（總生存率）有關，而 CMPK2、RSAD2、HERC5、IFIT1、EPSTI1、ISG15、OAS1、IRF9 和 OAS3 在 HCC 患者中并未表現出與總生存率有關，但是在對于有無合并肝炎病毒感染的 HCC 亞組分析中，除 RSAD2、IFIT1、CXCL10、IFITM1、IFI27、GBP4 和 IRF9 以外，其他 11 個關鍵基因均在有肝炎病毒感染的 HCC 亞組中與不良預后密切相關。該結果提示，關鍵基因在促進病毒感染的肝組織向癌變組織轉變外，也在一定程度上促進了其相關 HCC 的進展過程。亞組分析結果也為我們提供了新的思路，對存在肝炎病毒感染的 HCC 和無肝炎病毒感染的 HCC，其預后截然不同，在今后的工作中，我們應重視這種差異性。
對本研究得到的結果也需要客觀看待，由于數據的原因，本研究也存在一些需要完善的步驟，如我們采取來自同一平臺的數據進行整合分析，雖然這能在一定程度上避免了平臺差異造成的結果誤差，但也不能排除其可能存在批次差異對研究結果造成的影響；在生存分析階段，因樣本量的限制，我們并不能很好地區分出 HCV-HCC 和 HBV-HCC，因此，亞組分析只是在有和無肝炎病毒感染的樣本間進行，盡管亞組分析的結果發現大多數關鍵基因在有肝炎病毒感染的樣本中與不良預后相關，但最終的結果仍需要更多數據和更詳細的亞組分析進一步驗證。總之，通過本研究結果初步得出，HBV-HCC 和 HCV-HCC 之間存在著本質的區別，通過對二者間基因組學變化差異的分析后我們認為，HCV-HCC 的發生主要與病毒感染和病毒誘導機體產生的免疫反應密切相關。因此，對于 HCV 感染者應積極地抗病毒治療，避免其轉為慢性感染，對于預防或阻斷其轉變為 HCC 十分必要。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：杜志興是本研究設計者和執行人；魏孔孔和宋天亮數據分析、論文初稿寫作；王紀澤和楊金偉參與研究設計和結果分析；周輝年和張泠漪參與指導研究設計、數據分析、論文寫作與修改。全體作者都閱讀并同意最終文本。
志謝 感謝馮智軍博士對論文方法及結果可視化過程中給予的指導和幫助。
肝細胞癌（HCC）是消化系統常見的惡性腫瘤之一，最新的統計數據顯示其發病率居全球惡性腫瘤第 6 位，病死率位居第 3 位[1]。HCC 具有明顯的地域差異，西方國家的 HCC 主要源于酒精性脂肪性肝病，而在東亞尤其是中國，HCC 主要由病毒性肝炎所致[2]。隨著靶向藥物的開發和早期診斷率的提高，HCC 的外科切除機會有所提升，同時分子靶向藥物也在一定程度上延長了 HCC 患者的生存期，但 HCC 人群總體預后仍然較差[3]。世界范圍內 HCC 的主要風險因素如乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、過量飲酒、黃曲霉毒素、肥胖、吸煙、2 型糖尿病等都存在地區差異[4]。HBV 是 DNA 病毒，HCV 屬于 RNA 病毒，二者的抗病毒方案和終致終末期肝病的分子生物學過程也不盡相同。因此，探究二者在致 HCC 過程中的基因組變化差異、分析其潛在的生物學過程，對于我們了解和掌握不同肝炎病毒的致癌分子機制很有幫助，同時也可為早期預警 HCC 高危的病毒性肝炎患者提供必要的參考。目前，微陣列分析技術是評估生物體中基因組表達水平重要的生物信息學分析工具[5]。公共基因表達數據庫如基因表達數據庫（gene expression omnibus，GEO）[6]、癌癥基因組圖譜（
1 資料與方法
1.1 數據下載及處理
從 GEO 數據庫（
1.2 差異基因分析
繼續使用 limma 包對 HCV-HCC 和 HBV-HCC 樣本的基因表達水平進行差異分析，將其符合|log2FC（fold change，變化倍數）|>1 且P<0.05 的基因認定為 DEG。當 log2FC>1 時，說明該基因在 HCV-HCC 樣本中呈現高水平表達，當 log2FC<1 時，說明該基因在 HCV-HCC 樣本中呈現低水平表達。
1.3 基因集富集分析（GSEA）
以 HBV-HCC 為對照，通過 clusterProfiler 包[7]進行 GSEA[8]，評估 HCV-HCC 與 HBV-HCC 樣本比較后分析基因表達水平激活或抑制基因集的狀況，以反映 HCV-HCC 所表現出的特有的生物學過程，以P<0.05 作為差異基因集的篩選條件。
1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建
將 DEGs 在 STRING（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，
1.5 關鍵基因的基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析
clusterProfiler 包還可用來完成基因和基因簇功能譜的統計分析和可視化，我們利用該 R 包完成對關鍵基因的 GO 和 KEGG（
1.6 關鍵基因對生存影響的分析
為明確關鍵基因是否影響有肝炎病毒（HV）和無肝炎病毒（NHV）感染相關的 HCC 患者的預后，我們利用 Kaplan-Meier Plotter 數據庫（
2 結果
2.1 基因表達矩陣標準化及 DEG 分析結果
數據提取后共獲得 HBV-HCC 樣本 119 例，HCV-HCC 樣本 163 例，該矩陣的標準化過程見圖 1a、1b。按照 DEG 的篩選條件，共獲得 199 個 DEGs，其中 139 個上調基因，60 個下調基因，見圖 1c。
圖1
示 HBV-HCC 和 HCV-HCC 樣本基因總體表達水平標準化、差異分析及 GSEA 結果
a、b：分別表示基因總體表達水平標準化前后（藍色：HBV-HCC 樣本；紅色：HCV-HCC 樣本）；c：DEGs（紅色代表 HCV-HCC 中的上調基因，綠色代表 HCV-HCC 中的下調基因）；d：HCV-HCC 樣本所表現出的激活或抑制的基因集結果
2.2 GSEA 結果
與 HBV-HCC 相比，HCV-HCC 患者中明顯受到激活的基因集主要集中在炎癥相關和上調對干擾素反應的基因集，而明顯被抑制的基因集則主要體現在細胞周期相關的基因集，見圖 1d。
2.3 PPI 網絡構建結果
將 199 個 DEGs 在 STRING 數據庫中構建了 PPI 網絡（圖 2），包含了 124 個基因組成的 375 對相互關系，平均基因間互作關系度為 4.39，PPI 網絡富集的P值為 1.0E-16。下載 PPI 網絡數據并導入 cytoScape 軟件，利用 MCODE 插件篩選關鍵分子模塊，共發現 8 個 DEGs 所富集的關鍵分子模塊，8 個模塊的詳細信息見表 1。其中第 1 個聚類包含基因數最多（18 個），得分最高，因此，我們將其認定為最重要的分子模塊，其包含的 18 個基因被認定為關鍵基因。此外，我們也發現，與 HBV-HCC 相比，這 18 個關鍵基因在 HCV-HCC 中均呈明顯高表達（log2FC>1，表 2）。
圖2
示 DEGs 在 STRING 數據庫中構建的 PPI 網絡（線條粗細代表基因間互作證據的強弱）
表1
DEGs 所富集的關鍵分子模塊
表2
18 個關鍵基因的差異分析結果
2.4 GO 和 KEGG 分析結果
對 18 個關鍵基因的 GO 分析結果顯示，其生物學過程主要集中在與病毒感染相關的機體反應中（圖 3a），細胞組分主要以宿主細胞為主（圖 3b），分子功能則主要是富集在生物學結合（圖 3c）。KEGG 通路富集分析結果顯示，這 18 個關鍵基因參與了病毒感染相關的分子信號通路（圖 3d）。
圖3
示關鍵基因 GO 分析結果顯示生物學過程（a）、細胞組分（b）及分子功能（c）和 KEGG 通路分析（d）
2.5 關鍵基因對預后生存的影響分析結果
18 個關鍵基因對總體 HCC 患者的生存影響不盡相同，結果見圖 4 和表 3。① 與總體患者預后有關的基因有 9 個：CXCL10、HERC6、DDX60、IFITM1、IFI27、GBP4、IFI44L、IFI44 和 MX1，且這 9 個基因均與良好預后有關（HR<1，P<0.05），對其進行亞組分析時發現，HERC6、DDX60、IFI44L、IFI44、MX1 這 5 個基因在 HV 患者中與不良預后有關（HR>1，P<0.05）、在 NHV 患者中與良好預后有關（HR<1，P<0.05），而 CXCL10 在 HV 和 NHV 患者中與預后均無關（P>0.05），IFITM1 在 HV 患者中與不良預后無關（P>0.05）、在 NHV 患者中與良好預后有關（HR<1，P<0.05）。② 與總體患者預后無關的基因也有 9 個：CMPK2、RSAD2、HERC5、IFIT1、EPSTI1、ISG15、OAS1、IRF9 和 OAS3；對其進行亞組分析時發現，HERC5 和 EPSTI1 這 2 個基因在 HV 患者中與不良預后有關（HR>1，P<0.05）、在 NHV 患者中與良好預后有關（HR<1，P<0.05），而 CMPK2、ISG15、OAS1 和 OAS3 這 4 個基因在 HV 患者中與不良預后有關（HR>1，P<0.05）、在 NHV 患者中與預后無關（P>0.05），RSAD2、IFIT1、IRF9 這 3 個基因在 NHV 患者中與良好預后有關（HR<1，P<0.05）、在 HV 患者中與預后無關（P>0.05）。
圖4
示關鍵基因在 HV 或 NHV 感染 HCC 患者中的生存分析結果
表3
18 個關鍵基因對總體 HCC、HV-HCC 以及 NHV-HCC 患者總生存時間的影響
3 討論
統計數據[10]顯示，與未感染 HBV 和 HCV 人群相比，HBV 和 HCV 者罹患 HCC 的風險要增加 15～20 倍。在我國，病毒性肝炎相關的 HCC 也是最為突出的健康問題之一[11]。隨著 HBV 疫苗的廣泛使用，HBV-HCC 的發病趨勢有逐漸延緩的趨勢，但對于沒有疫苗阻斷傳播的 HCV，積極地抗病毒治療和定期規律隨訪成為評估病情變化的主要手段，但目前并沒有切實可行的標志物或者措施來更好地監測 HCV 感染發展為終末期肝病的趨勢。
惡性腫瘤的發生是一個復雜而循序漸進的過程，細胞基因組改變和微環境相互作用共同促進癌變的發生，HCC 也不例外。慢性 HBV 感染就被認為是 HBV 特異性免疫耐受的結果[12]，同時這種免疫耐受所形成的炎癥微環境是 HBV-HCC 的一大主要促癌環境。從基因角度看，現有的證據表明，HBV-DNA 與宿主 DNA 在不同位點的整合被認為是 HBV 相關性 HCC 發病機制中的關鍵一步，這不僅會引起周圍細胞序列的改變，而且還通過激活反轉錄而干擾正常細胞基因的表達[13]，在這個過程中，同時也誘導了更多的細胞因子如細胞周期調節因子、失活負生長調節因子或基因家族如抑制 p53 基因等來共同參與癌變的初始調節[14]。相比 HBV，HCV 感染與 HCC 的因果關系在最近 10 年來才逐漸被揭開[15]。HCV-HCC 則表現出更高的異質性、更特殊的個體差異，這可能與 HCV 基因組序列的不同有關。目前，HCV 基因組序列包括 7 種不同的基因型[16]，各型之間的地理分布也存在著明顯差異[17]，但目前針對不同的 HCV 基因型在促進 HCC 進展和作為 HCC 危險因素的作用仍存在爭議。慢性 HCV 患者發生 HCC 的風險取決于纖維化階段的嚴重程度，其進展速度每年為 2%～6%[18-19]。HCV 導致肝臟炎癥的分子途徑比較復雜，至今仍無明確定論，現有的證據主要集中在 HCV 直接的病毒作用和其他間接機制，如細胞因子途徑、氧化應激、脂肪變性誘導等，也就是說 HCV 致 HCC 的出現更多是與微環境共同作用的結果，而對于 HCV 本身是否具有直接致癌作用仍不確定[20]。來自Estevez等[21]的結果表明，HCV 可能通過調節促進肝細胞惡性轉化的途徑而參與 HCC 的發生，但諸多細節仍不清楚。因此，在本研究中，我們利用來源于同一個注釋平臺的基因表達數據來比較了 HCV-HCC 與 HBV-HCC 之間基因表達的不同，并從表達水平的角度分析了二者之間的生物學過程差異。
本研究結果顯示，與 HBV-HCC 相比，HCV-HCC 激活的基因集主要包括炎癥和補體相關的基因集，如定義炎癥反應的基因、編碼補體系統組成部分的基因、通過 STAT3 途徑被 IL6 上調的基因、在 IL2 刺激下被 STAT5 上調的基因等，這些證據更加豐富了 HCV-HCC 的發生與免疫反應誘導的微環境的確切關系。除此之外，本研究還發現，在 HCV-HCC 患者中，上調對 α 干擾素反應的基因以及上調對 γ 干擾素反應的基因被明顯激活，機體對于干擾素的反應與機體產生慢性感染有關，因此，這些證據的相互支持提示 HCV-HCC 與免疫微環境的關系十分密切。同時還發現，在 HCV-HCC 患者中 KRAS 激活上調基因，經核因子（NF）-kB 對腫瘤壞死因子（TNF）調控的基因、通過激活半胱天冬酶介導程序性細胞死亡的基因等相關基因集的激活，這也說明促癌基因的激活也在 HCV-HCC 發生的過程中扮演著重要角色；而與細胞周期相關的基因集如在細胞分裂周期的進展中參與 G2/M 檢查點的基因和 E2F_TARGETS 編碼 E2F 轉錄因子細胞周期相關靶點的基因卻得到了明顯的抑制，這在一定程度上體現了 HCV-HCC 細胞的增殖惰性，也可能預示藥物治療效果不佳。與 HBV-HCC 比較，HCV-HCC 中呈現高表達的 18 個關鍵基因被確定，這些關鍵基因主要參與了機體對病毒的響應以及病毒基因組的復制，分子通路則主要體現在 EB 病毒感染和 NOD 樣受體信號通路，視黃酸（維甲酸）誘導基因蛋白Ⅰ（RIG- Ⅰ）樣受體信號通路等。NOD 樣受體通過啟動天然免疫和激活適應性免疫參與介導免疫識別[22]，而在病毒感染過程中，RIG- Ⅰ 在啟動Ⅰ型干擾素信號通路和防止病毒在宿主細胞中的感染或復制中起著重要作用[23]，這些結果說明，HCV-HCC 的發生與機體病毒的復制過程密切相關，也從另一個角度反映了對 HCV 患者進行積極抗病毒治療的必要性，這些結果也反映了 HBV-HCC 與 HCV-HCC 發病機制的差異。針對 18 個關鍵基因的生存分析顯示，CXCL10、HERC6、DDX60、IFITM1、IFI27、GBP4、IFI44L、IFI44 和 MX1 在 HCC 患者中與良好預后（總生存率）有關，而 CMPK2、RSAD2、HERC5、IFIT1、EPSTI1、ISG15、OAS1、IRF9 和 OAS3 在 HCC 患者中并未表現出與總生存率有關，但是在對于有無合并肝炎病毒感染的 HCC 亞組分析中，除 RSAD2、IFIT1、CXCL10、IFITM1、IFI27、GBP4 和 IRF9 以外，其他 11 個關鍵基因均在有肝炎病毒感染的 HCC 亞組中與不良預后密切相關。該結果提示，關鍵基因在促進病毒感染的肝組織向癌變組織轉變外，也在一定程度上促進了其相關 HCC 的進展過程。亞組分析結果也為我們提供了新的思路，對存在肝炎病毒感染的 HCC 和無肝炎病毒感染的 HCC，其預后截然不同，在今后的工作中，我們應重視這種差異性。
對本研究得到的結果也需要客觀看待，由于數據的原因，本研究也存在一些需要完善的步驟，如我們采取來自同一平臺的數據進行整合分析，雖然這能在一定程度上避免了平臺差異造成的結果誤差，但也不能排除其可能存在批次差異對研究結果造成的影響；在生存分析階段，因樣本量的限制，我們并不能很好地區分出 HCV-HCC 和 HBV-HCC，因此，亞組分析只是在有和無肝炎病毒感染的樣本間進行，盡管亞組分析的結果發現大多數關鍵基因在有肝炎病毒感染的樣本中與不良預后相關，但最終的結果仍需要更多數據和更詳細的亞組分析進一步驗證。總之，通過本研究結果初步得出，HBV-HCC 和 HCV-HCC 之間存在著本質的區別，通過對二者間基因組學變化差異的分析后我們認為，HCV-HCC 的發生主要與病毒感染和病毒誘導機體產生的免疫反應密切相關。因此，對于 HCV 感染者應積極地抗病毒治療，避免其轉為慢性感染，對于預防或阻斷其轉變為 HCC 十分必要。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：杜志興是本研究設計者和執行人；魏孔孔和宋天亮數據分析、論文初稿寫作；王紀澤和楊金偉參與研究設計和結果分析；周輝年和張泠漪參與指導研究設計、數據分析、論文寫作與修改。全體作者都閱讀并同意最終文本。
志謝 感謝馮智軍博士對論文方法及結果可視化過程中給予的指導和幫助。
