引用本文： 俞鑫, 孫圣榮, 王衛星. 乳腺癌的免疫相關預后標志物的鑒定. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(12): 1612-1618. doi: 10.7507/1007-9424.202103106 復制
乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤中病死率位居第 2，且近年來其發病率逐年增高[1]。2018 年約有 208.9 萬例新的乳腺癌患者被確診，并約有 62.7 萬例乳腺癌患者死亡[1]。盡管在過去的數十年中，乳腺癌的診治方法已經有了明顯的改進，然而乳腺癌的免疫治療仍處于起步階段。
乳腺癌不僅由惡性細胞組成，而且還包括腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）如浸潤淋巴細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、細胞外基質、脂肪細胞以及其他基質組分的顯著改變。TME 的改變被認為是乳腺癌發生、進展的關鍵要素，同時是治療乳腺癌的潛在靶標[2-5]。乳腺癌細胞通過與宿主免疫之間的持續相互作用在 TME 中建立了強大的免疫耐受網絡，從而導致腫瘤的免疫逃逸和腫瘤進展。在此過程中，抑制免疫活性的免疫檢查點分子在腫瘤細胞上調，從而激活多種免疫細胞的免疫抑制信號通路[6]。近年來，免疫治療已被證實是一種新穎而有效的惡性腫瘤治療方法，并被應用于各種腫瘤的治療[7]。其中通過靶向免疫檢查點的治療方法被證實可以顯著改善患者的生存時間及質量[8-9]。然而，只有少部分接受免疫療法治療的乳腺癌患者對該治療有反應[10]。因此有必要進一步努力確定與乳腺癌 TME 狀態相關的預后免疫生物標志物，因為它們有可能指導患者的治療，并有助于識別新的免疫治療干預措施。
本研究的目的是構建一種新的免疫相關基因生物標志物以用于評估乳腺癌患者的預后，并進行生物信息學分析以探索生物標志物的潛在機制，為將來乳腺癌的個性化診斷和治療提供依據。
1 資料與方法
1.1 數據來源
從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫（
1.2 差異表達的免疫相關基因（differentially expressed immune related genes，DEIRGs）的篩選
使用 R 語言的“limma”軟件包篩選 TCGA 數據庫中的乳腺癌和正常乳腺組織樣本的差異表達基因，篩選標準為：|log2FC|>1，P<0.05，其中 FC 為樣本表達量的差異倍數。接著使用免疫學數據庫和分析門戶（immunology database and analysis portal，ImmPort；
1.3 基于 DEIRGs 的預后風險評分方程的構建
使用 R 語言的“survival” 軟件包進行單因素 Cox 比例風險回歸，以 P<0.05 為閾值來初步識別 TCGA 數據庫中與總生存率（overall survival，OS）相關的 DEIRGs。使用 R 語言的“glmnet” 軟件包，通過最小絕對收縮和選擇算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）模型進一步篩選與預后相關的 DEIRGs。根據篩選出的預后相關 DEIRGs 使用多因素 Cox 比例風險回歸分析構建風險評分方程。根據構建的風險評分方程計算每例患者的風險評分，然后以風險評分的中位數將乳腺癌患者分為低風險組和高風險組。使用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）以及 log-rank 檢驗來分析風險評分方程的預測效果。
1.4 功能注釋及分析
使用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）探索低風險組和高風險組患者是否表現出不同的基因特征，在此過程使用京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）基因集進行注釋。
1.5 免疫浸潤分析
分別使用 R 語言的“ESITIMATE”軟件包和“CIBERSORT”軟件包對乳腺癌組織的基質評分、免疫評分及免疫細胞進行計算。使用 t 檢驗分析低風險組和高風險組的免疫評分及免疫細胞是否有差異。
1.6 統計學方法
使用 R 軟件和網頁工具生信人（
2 結果
2.1 乳腺癌與正常乳腺組織樣本中 DEIRGs 的篩選結果
本研究結果顯示：乳腺癌組織與正常乳腺組織樣本間有 4 314 個差異表達基因（|log2FC|>1，P<0.05），其中 1 631 個基因表達上調，2 683 個基因表達下調（圖 1a）。通過將差異表達基因與 ImmPort 的免疫相關基因列表取交集，得到 434 個 DEIRGs，其中 134 個基因表達上調，300 個基因表達下調（圖 1b）。
圖1
示本研究篩選的免疫生物標志物和構建的風險評估模型以及相應分析結果
a：示 TCGA 數據庫乳腺癌及正常乳腺組織樣本中差異表達基因的火山圖；b：示取交集后差異表達基因的火山圖；藍點表示腫瘤組織中的下調基因；紅點表示腫瘤組織中的上調基因；c：示通過 LASSO 模型篩選的 60 個候選 DEIRGs 的 LASSO 系數圖譜；d：根據 log（λ）確認的最佳參數數量；e：示基于 DEIRGs 的預后風險評分方程的 1、3 和 5 年生存率的 ROC 曲線；f：高風險組與低風險組患者的生存差異，實線表示累計事件，虛線表示 95%
2.2 基于 DEIRGs 的預后風險評分方程的構建與驗證
在整合 TCGA 乳腺癌患者的基因表達與臨床信息后，通過單因素 Cox 比例風險回歸分析，以 P<0.05 作為臨界值，在 434 個 DEIRGs 中鑒定出了 60 個候選預后相關 DEIRGs，表 1 展示了其中 P 值最小的 30 個基因。通過 LASSO 方法進一步篩選（圖 1c、1d），確定了 9 個與預后相關的 DEIRGs，即腎上腺素受體 β1（adrenoceptor beta 1，ADRB1）、白介素 12B（interleukin 12B，IL12B）、多配體蛋白聚糖-1（syndecan 1，SDC1）、胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、成纖維細胞生長因子 19（fibroblast growth factor 19，FGF19）、脂肪酸結合蛋白 7（fatty acid binding protein 7，FABP7）、干擾素 ε（interferon epsilon，IFNE）、腫瘤壞死因子受體超家族成員 18（tumor necrosis factor receptor superfamily member 18，TNFRSF18）和白介素 27（interleukin 27，IL27）。最后通過多因素 Cox 比例風險回歸分析利用這 9 個預后相關 DEIRGs 構建預后風險評分方程：風險評分=（–0.099×ADRB1）+（–0.143×IL12B）+（0.176×SDC1）+（0.025×TSLP）+（–0.132×FGF19）+（–0.054×FABP7）+（–0.108×IFNE）+（–0.156×TNFRSF18）+（0.23×IL27），方程中的各基因是各自的表達量。
表1
單因素 Cox 比例風險回歸分析中與預后關聯最顯著的 30 個差異表達基因
根據預后風險評分方程對患者的風險評分進行計算和排序，根據風險評分的中位值，將患者分為高風險組和低風險組進行預后評估。其結果顯示：患者 1、3 及 5 年的 ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）分別為 0.69、0.73 和 0.71（圖 1e）；經 log-rank 檢驗其結果顯示，低風險組的 OS 高于高風險組（P<0.000 1），見圖 1f。
進一步分析風險評分在不同分子亞型乳腺癌患者中的預測效果，本研究使用 TCGA 的 PAM50 分子分型數據，將乳腺癌患者分為正常型（n=38）、Luminal A 型（n=550）、Luminal B型（n=206）、HER2 過表達型（n=78）和三陰性（n=185），評估各亞型中高風險組患者與低風險組患者的預后差異。結果顯示，在 Luminal A 型（P=0.003 1）、Luminal B 型（P=0.000 7）和三陰性（P=0.000 7）患者中，高風險組患者的預后差于低風險組患者，而在正常型（P=0.109 3）和 HER2 過表達型患者（P=0.540 4）中，高風險組患者與低風險組患者的預后差異無統計學意義，這可能部分歸因于正常型和 HER2 過表達型 2 組患者的樣本量較少。具體見圖 1g-1k。
本研究進一步使用 GEO 數據集（GSE48390）進一步驗證風險評分對乳腺癌患者的預后評估效果。結果顯示，在該數據集中依據風險評分劃分的高風險組患者的預后差于低風險組患者（P=0.038 0），見圖 1l。
2.3 GSEA 分析結果
使用 GSEA 分析低風險組和高風險組患者的不同基因特征，結果顯示高風險組患者“神經營養素信號通路”（P<0.000 1）以及“脂肪細胞因子信號途徑”（P<0.000 1）通路活躍，而低風險組患者的“白細胞跨內皮遷移”（P<0.000 1）、“WNT 信號通路”（P<0.000 1）、“FcεRI 信號通路”（P<0.000 1）、“纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成”（P=0.001 9）以及“蛋白質輸出途徑”（P=0.003 8）通路顯著活躍，具體見圖 1m-1o。該結果提示，在低風險組患者中富集的途徑多與免疫相關，表明免疫過程可能對低風險患者起保護作用。
2.4 免疫浸潤分析結果
為了進一步揭示基于 DEIRGs 的預后模型和腫瘤免疫微環境之間的相關性，本研究使用 ESITIMATE 計算并分析高風險組與低風險組患者之間的基質評分及免疫評分差異。結果顯示：低風險組患者具有更高的免疫評分以及基質評分，見圖 1p。使用 CIBERSORT 計算并分析高風險組與低風險組患者腫瘤浸潤性免疫細胞的差異。結果顯示：多種腫瘤殺傷性免疫細胞如幼稚 B 細胞、CD8+ T 細胞、靜息記憶 CD4+ T 細胞、活化記憶 CD4+ T 細胞、單核細胞和巨噬細胞 M1 在低風險組患者的腫瘤浸潤性免疫細胞中顯著富集，而免疫抑制型免疫細胞如調節型 T 細胞及巨噬細胞 M2 在高風險組患者的腫瘤浸潤性免疫細胞中顯著富集，見圖 1q。該結果提示：相較于高風險組患者而言，低風險組患者的免疫微環境中具有更多腫瘤抑制成分。
3 討論
近年來，腫瘤免疫治療已被廣泛接受為惡性腫瘤的潛在治療方案或標準化治療的替代治療方案[7, 11]。因此，基于惡性腫瘤免疫特征評估患者的預后情況已成為當下研究的熱點[12-13]。本研究確定了 134 個表達上調和 300 個表達下調的與乳腺癌進展有關的 DEIRGs，并基于其中 9 個與預后相關的 DEIRGs 構建風險評分方程，該風險評分與患者的 OS 顯著關聯且評分越高患者的 OS 相對越低，提示該風險評分方程可以為評估乳腺癌患者死亡風險和免疫治療納入治療方案的可能性提供了新的視角。
同時，本研究中納入風險評分方程的 ADRB1、IL12B、SDC1、TSLP、FGF19、FABP7、IFNE、TNFRSF18 和 IL27 這 9 個基因在乳腺癌進展中的作用也值得關注。ADRB1，也稱為 β1-腎上腺受體（adrenergic receptor，AR），屬于 G 蛋白耦合受體家族成員，是各種治療應用的重要靶點[14]。藥理學研究[15]表明，β 受體阻滯劑可以通過抑制 AR 對癌細胞代謝增殖的促進作用來抑制腫瘤的進展和降低病死率。近年來有研究[16]表明，ADRB1 的高表達可以通過促進 B 細胞和樹突狀細胞的活性，從而調解和維持正常的免疫反應，因而被認為是乳腺癌的潛在生物學標志物。IL12B 是細胞因子 IL12 的主要組成部分，IL12 參與適應性免疫，在抵御細胞內微生物過程中發揮重要作用。IL12 的主要作用是促進 Th1 細胞的分化，并誘導其表達Ⅱ型干擾素，目前 IL12 及其下游細胞因子參與激活抗腫瘤免疫反應已得到廣泛承認[17]。值得注意的是，IL12B 的基因多態性與宮頸癌、乳腺癌、結腸癌等多種惡性腫瘤的發生風險相關[18-20]。SDC1 屬于 Syndecan 家族蛋白成員，其參與調節細胞增殖、遷移、黏附和血管生成，SDC1 已被證實通過核因子 κB（NF-κB）調節基質金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）表達來增強子宮內膜癌的侵襲性[21]。此外，有研究[22]表明，SDC1 與乳腺癌 DNA 甲基化狀態呈負相關，同時與乳腺癌不良預后相關。TSLP 是一種上皮細胞衍生細胞因子，主要作用于樹突狀細胞、乳腺細胞、CD4 T 細胞等免疫細胞[23]。研究[24]表明，人及鼠乳腺癌細胞均可以通過在微環境內釋放 TSLP 來產生 Th2 型免疫反應，從而促進腫瘤細胞生長。FGF19 屬于 FGF 家族，其作為內分泌信號參與調節各種代謝過程。據報道，FGF19 可以通過激活 mTOR 信號促進蛋白質合成，同時可以通過抑制糖原合成酶激酶 3α（glycogen synthase kinase 3 alpha，GSK3α）和糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3β）來促進糖原合成[25]。在肝癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌和食管癌中均發現了 FGF19 基因組位點的擴增[26]。FABP7 是脂肪酸結合蛋白的家族成員，被公認為有助于脂肪酸在各種細胞器上的運輸，調節其新陳代謝和其他生理活動[27]。有研究[28]表明，FABP7 與多種類型腫瘤的發病機制和進展有顯著關系，并且可能作為腫瘤標志物。同時 FABP7 作為大腦特異性細胞內脂結合蛋白，與乳腺癌患者顱內轉移發生風險呈正相關[29]。TNFRSF18 又稱糖皮質激素的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factorreceptor，GITR），TNFRSF18 活化可增強 T 細胞增殖和效應功能，并保護 T 細胞免受激活引起的細胞死亡，從而促進記憶 T 細胞的產生[30]。盡管 TNFRSF18 與乳腺癌相關的研究尚不多見，但其作為新興免疫治療靶點而被廣泛研究[31]。因此 TNFRSF18 可能是乳腺癌免疫治療的潛在靶點。IL27 最初被報道為一種增強免疫的細胞因子，促進 CD4 T 細胞增殖和Ⅱ型干擾素的產生，然而近年來發現其在腫瘤中也具有免疫調節功能，包括增強吲哚胺 2，3-雙加氧酶 1（indoleamine 2，3-dioxygenase 1，IDO）及程序性死亡受體-配體 1（programmed cell death-Ligand 1，PD-L1）的表達[32]。同時，有研究[33]表明，乳腺癌患者的血清 IL27 水平顯著高于健康人群，且與乳腺癌的臨床分期呈正相關。然而目前對 IL27 在乳腺癌中產生的具體作用及其機制尚不明確。此外，在本研究中確定了過去缺乏相關研究的 IFNE 在乳腺癌中的預測作用，這可能為進一步研究提供新的方向。
本研究中，基因集富集分析以及免疫富集分析的結果均顯示高風險組患者的免疫微環境可能是其不良預后的重要貢獻者。高風險組患者 TME 中表現出較高比例的調節型 T 細胞、巨噬細胞 M2 和肥大細胞。調節型 T 細胞和巨噬細胞 M2 作為抗炎和促腫瘤免疫細胞，在近年來已被公認為在促進乳腺癌轉移進展中發揮重要作用，并與不良預后有關[34]。此外，近年研究[35-36]表現，肥大細胞可以被蛋白激酶 Ds 募集進入 TME，并進一步生成血管生成因子以促進血管生成，并與患者的淋巴轉移及不良預后呈正相關關系。因此，本研究建立的風險評分方程可以較好地反映患者的免疫微環境狀態并評估患者的預后。
本研究存在著一定的局限性。首先，本研究為回顧性研究，尚需進行進一步的前瞻性研究。其次，本研究僅對轉錄組數據進行了研究，不一定能完全反映腫瘤發生發展中的生理病理狀態，缺乏細胞及動物實驗驗證。因此，目前的結論需要在今后的實驗中加以驗證。
綜上所述，本研究建立的基于 DEIRGs 的預后風險評分方程，并根據風險評分將患者分為高風險組及低風險組，2 組患者生存結局的差異有統計學意義，可能與腫瘤免疫微環境失衡有關。該發現可能為開發新的免疫生物學標志物和靶向治療提供參考。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：俞鑫負責研究設計、數據處理和論文撰寫；孫圣榮和王衛星負責論文審改。
乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤中病死率位居第 2，且近年來其發病率逐年增高[1]。2018 年約有 208.9 萬例新的乳腺癌患者被確診，并約有 62.7 萬例乳腺癌患者死亡[1]。盡管在過去的數十年中，乳腺癌的診治方法已經有了明顯的改進，然而乳腺癌的免疫治療仍處于起步階段。
乳腺癌不僅由惡性細胞組成，而且還包括腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）如浸潤淋巴細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、細胞外基質、脂肪細胞以及其他基質組分的顯著改變。TME 的改變被認為是乳腺癌發生、進展的關鍵要素，同時是治療乳腺癌的潛在靶標[2-5]。乳腺癌細胞通過與宿主免疫之間的持續相互作用在 TME 中建立了強大的免疫耐受網絡，從而導致腫瘤的免疫逃逸和腫瘤進展。在此過程中，抑制免疫活性的免疫檢查點分子在腫瘤細胞上調，從而激活多種免疫細胞的免疫抑制信號通路[6]。近年來，免疫治療已被證實是一種新穎而有效的惡性腫瘤治療方法，并被應用于各種腫瘤的治療[7]。其中通過靶向免疫檢查點的治療方法被證實可以顯著改善患者的生存時間及質量[8-9]。然而，只有少部分接受免疫療法治療的乳腺癌患者對該治療有反應[10]。因此有必要進一步努力確定與乳腺癌 TME 狀態相關的預后免疫生物標志物，因為它們有可能指導患者的治療，并有助于識別新的免疫治療干預措施。
本研究的目的是構建一種新的免疫相關基因生物標志物以用于評估乳腺癌患者的預后，并進行生物信息學分析以探索生物標志物的潛在機制，為將來乳腺癌的個性化診斷和治療提供依據。
1 資料與方法
1.1 數據來源
從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫（
1.2 差異表達的免疫相關基因（differentially expressed immune related genes，DEIRGs）的篩選
使用 R 語言的“limma”軟件包篩選 TCGA 數據庫中的乳腺癌和正常乳腺組織樣本的差異表達基因，篩選標準為：|log2FC|>1，P<0.05，其中 FC 為樣本表達量的差異倍數。接著使用免疫學數據庫和分析門戶（immunology database and analysis portal，ImmPort；
1.3 基于 DEIRGs 的預后風險評分方程的構建
使用 R 語言的“survival” 軟件包進行單因素 Cox 比例風險回歸，以 P<0.05 為閾值來初步識別 TCGA 數據庫中與總生存率（overall survival，OS）相關的 DEIRGs。使用 R 語言的“glmnet” 軟件包，通過最小絕對收縮和選擇算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）模型進一步篩選與預后相關的 DEIRGs。根據篩選出的預后相關 DEIRGs 使用多因素 Cox 比例風險回歸分析構建風險評分方程。根據構建的風險評分方程計算每例患者的風險評分，然后以風險評分的中位數將乳腺癌患者分為低風險組和高風險組。使用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）以及 log-rank 檢驗來分析風險評分方程的預測效果。
1.4 功能注釋及分析
使用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）探索低風險組和高風險組患者是否表現出不同的基因特征，在此過程使用京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）基因集進行注釋。
1.5 免疫浸潤分析
分別使用 R 語言的“ESITIMATE”軟件包和“CIBERSORT”軟件包對乳腺癌組織的基質評分、免疫評分及免疫細胞進行計算。使用 t 檢驗分析低風險組和高風險組的免疫評分及免疫細胞是否有差異。
1.6 統計學方法
使用 R 軟件和網頁工具生信人（
2 結果
2.1 乳腺癌與正常乳腺組織樣本中 DEIRGs 的篩選結果
本研究結果顯示：乳腺癌組織與正常乳腺組織樣本間有 4 314 個差異表達基因（|log2FC|>1，P<0.05），其中 1 631 個基因表達上調，2 683 個基因表達下調（圖 1a）。通過將差異表達基因與 ImmPort 的免疫相關基因列表取交集，得到 434 個 DEIRGs，其中 134 個基因表達上調，300 個基因表達下調（圖 1b）。
圖1
示本研究篩選的免疫生物標志物和構建的風險評估模型以及相應分析結果
a：示 TCGA 數據庫乳腺癌及正常乳腺組織樣本中差異表達基因的火山圖；b：示取交集后差異表達基因的火山圖；藍點表示腫瘤組織中的下調基因；紅點表示腫瘤組織中的上調基因；c：示通過 LASSO 模型篩選的 60 個候選 DEIRGs 的 LASSO 系數圖譜；d：根據 log（λ）確認的最佳參數數量；e：示基于 DEIRGs 的預后風險評分方程的 1、3 和 5 年生存率的 ROC 曲線；f：高風險組與低風險組患者的生存差異，實線表示累計事件，虛線表示 95%
2.2 基于 DEIRGs 的預后風險評分方程的構建與驗證
在整合 TCGA 乳腺癌患者的基因表達與臨床信息后，通過單因素 Cox 比例風險回歸分析，以 P<0.05 作為臨界值，在 434 個 DEIRGs 中鑒定出了 60 個候選預后相關 DEIRGs，表 1 展示了其中 P 值最小的 30 個基因。通過 LASSO 方法進一步篩選（圖 1c、1d），確定了 9 個與預后相關的 DEIRGs，即腎上腺素受體 β1（adrenoceptor beta 1，ADRB1）、白介素 12B（interleukin 12B，IL12B）、多配體蛋白聚糖-1（syndecan 1，SDC1）、胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、成纖維細胞生長因子 19（fibroblast growth factor 19，FGF19）、脂肪酸結合蛋白 7（fatty acid binding protein 7，FABP7）、干擾素 ε（interferon epsilon，IFNE）、腫瘤壞死因子受體超家族成員 18（tumor necrosis factor receptor superfamily member 18，TNFRSF18）和白介素 27（interleukin 27，IL27）。最后通過多因素 Cox 比例風險回歸分析利用這 9 個預后相關 DEIRGs 構建預后風險評分方程：風險評分=（–0.099×ADRB1）+（–0.143×IL12B）+（0.176×SDC1）+（0.025×TSLP）+（–0.132×FGF19）+（–0.054×FABP7）+（–0.108×IFNE）+（–0.156×TNFRSF18）+（0.23×IL27），方程中的各基因是各自的表達量。
表1
單因素 Cox 比例風險回歸分析中與預后關聯最顯著的 30 個差異表達基因
根據預后風險評分方程對患者的風險評分進行計算和排序，根據風險評分的中位值，將患者分為高風險組和低風險組進行預后評估。其結果顯示：患者 1、3 及 5 年的 ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）分別為 0.69、0.73 和 0.71（圖 1e）；經 log-rank 檢驗其結果顯示，低風險組的 OS 高于高風險組（P<0.000 1），見圖 1f。
進一步分析風險評分在不同分子亞型乳腺癌患者中的預測效果，本研究使用 TCGA 的 PAM50 分子分型數據，將乳腺癌患者分為正常型（n=38）、Luminal A 型（n=550）、Luminal B型（n=206）、HER2 過表達型（n=78）和三陰性（n=185），評估各亞型中高風險組患者與低風險組患者的預后差異。結果顯示，在 Luminal A 型（P=0.003 1）、Luminal B 型（P=0.000 7）和三陰性（P=0.000 7）患者中，高風險組患者的預后差于低風險組患者，而在正常型（P=0.109 3）和 HER2 過表達型患者（P=0.540 4）中，高風險組患者與低風險組患者的預后差異無統計學意義，這可能部分歸因于正常型和 HER2 過表達型 2 組患者的樣本量較少。具體見圖 1g-1k。
本研究進一步使用 GEO 數據集（GSE48390）進一步驗證風險評分對乳腺癌患者的預后評估效果。結果顯示，在該數據集中依據風險評分劃分的高風險組患者的預后差于低風險組患者（P=0.038 0），見圖 1l。
2.3 GSEA 分析結果
使用 GSEA 分析低風險組和高風險組患者的不同基因特征，結果顯示高風險組患者“神經營養素信號通路”（P<0.000 1）以及“脂肪細胞因子信號途徑”（P<0.000 1）通路活躍，而低風險組患者的“白細胞跨內皮遷移”（P<0.000 1）、“WNT 信號通路”（P<0.000 1）、“FcεRI 信號通路”（P<0.000 1）、“纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成”（P=0.001 9）以及“蛋白質輸出途徑”（P=0.003 8）通路顯著活躍，具體見圖 1m-1o。該結果提示，在低風險組患者中富集的途徑多與免疫相關，表明免疫過程可能對低風險患者起保護作用。
2.4 免疫浸潤分析結果
為了進一步揭示基于 DEIRGs 的預后模型和腫瘤免疫微環境之間的相關性，本研究使用 ESITIMATE 計算并分析高風險組與低風險組患者之間的基質評分及免疫評分差異。結果顯示：低風險組患者具有更高的免疫評分以及基質評分，見圖 1p。使用 CIBERSORT 計算并分析高風險組與低風險組患者腫瘤浸潤性免疫細胞的差異。結果顯示：多種腫瘤殺傷性免疫細胞如幼稚 B 細胞、CD8+ T 細胞、靜息記憶 CD4+ T 細胞、活化記憶 CD4+ T 細胞、單核細胞和巨噬細胞 M1 在低風險組患者的腫瘤浸潤性免疫細胞中顯著富集，而免疫抑制型免疫細胞如調節型 T 細胞及巨噬細胞 M2 在高風險組患者的腫瘤浸潤性免疫細胞中顯著富集，見圖 1q。該結果提示：相較于高風險組患者而言，低風險組患者的免疫微環境中具有更多腫瘤抑制成分。
3 討論
近年來，腫瘤免疫治療已被廣泛接受為惡性腫瘤的潛在治療方案或標準化治療的替代治療方案[7, 11]。因此，基于惡性腫瘤免疫特征評估患者的預后情況已成為當下研究的熱點[12-13]。本研究確定了 134 個表達上調和 300 個表達下調的與乳腺癌進展有關的 DEIRGs，并基于其中 9 個與預后相關的 DEIRGs 構建風險評分方程，該風險評分與患者的 OS 顯著關聯且評分越高患者的 OS 相對越低，提示該風險評分方程可以為評估乳腺癌患者死亡風險和免疫治療納入治療方案的可能性提供了新的視角。
同時，本研究中納入風險評分方程的 ADRB1、IL12B、SDC1、TSLP、FGF19、FABP7、IFNE、TNFRSF18 和 IL27 這 9 個基因在乳腺癌進展中的作用也值得關注。ADRB1，也稱為 β1-腎上腺受體（adrenergic receptor，AR），屬于 G 蛋白耦合受體家族成員，是各種治療應用的重要靶點[14]。藥理學研究[15]表明，β 受體阻滯劑可以通過抑制 AR 對癌細胞代謝增殖的促進作用來抑制腫瘤的進展和降低病死率。近年來有研究[16]表明，ADRB1 的高表達可以通過促進 B 細胞和樹突狀細胞的活性，從而調解和維持正常的免疫反應，因而被認為是乳腺癌的潛在生物學標志物。IL12B 是細胞因子 IL12 的主要組成部分，IL12 參與適應性免疫，在抵御細胞內微生物過程中發揮重要作用。IL12 的主要作用是促進 Th1 細胞的分化，并誘導其表達Ⅱ型干擾素，目前 IL12 及其下游細胞因子參與激活抗腫瘤免疫反應已得到廣泛承認[17]。值得注意的是，IL12B 的基因多態性與宮頸癌、乳腺癌、結腸癌等多種惡性腫瘤的發生風險相關[18-20]。SDC1 屬于 Syndecan 家族蛋白成員，其參與調節細胞增殖、遷移、黏附和血管生成，SDC1 已被證實通過核因子 κB（NF-κB）調節基質金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）表達來增強子宮內膜癌的侵襲性[21]。此外，有研究[22]表明，SDC1 與乳腺癌 DNA 甲基化狀態呈負相關，同時與乳腺癌不良預后相關。TSLP 是一種上皮細胞衍生細胞因子，主要作用于樹突狀細胞、乳腺細胞、CD4 T 細胞等免疫細胞[23]。研究[24]表明，人及鼠乳腺癌細胞均可以通過在微環境內釋放 TSLP 來產生 Th2 型免疫反應，從而促進腫瘤細胞生長。FGF19 屬于 FGF 家族，其作為內分泌信號參與調節各種代謝過程。據報道，FGF19 可以通過激活 mTOR 信號促進蛋白質合成，同時可以通過抑制糖原合成酶激酶 3α（glycogen synthase kinase 3 alpha，GSK3α）和糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3β）來促進糖原合成[25]。在肝癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌和食管癌中均發現了 FGF19 基因組位點的擴增[26]。FABP7 是脂肪酸結合蛋白的家族成員，被公認為有助于脂肪酸在各種細胞器上的運輸，調節其新陳代謝和其他生理活動[27]。有研究[28]表明，FABP7 與多種類型腫瘤的發病機制和進展有顯著關系，并且可能作為腫瘤標志物。同時 FABP7 作為大腦特異性細胞內脂結合蛋白，與乳腺癌患者顱內轉移發生風險呈正相關[29]。TNFRSF18 又稱糖皮質激素的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factorreceptor，GITR），TNFRSF18 活化可增強 T 細胞增殖和效應功能，并保護 T 細胞免受激活引起的細胞死亡，從而促進記憶 T 細胞的產生[30]。盡管 TNFRSF18 與乳腺癌相關的研究尚不多見，但其作為新興免疫治療靶點而被廣泛研究[31]。因此 TNFRSF18 可能是乳腺癌免疫治療的潛在靶點。IL27 最初被報道為一種增強免疫的細胞因子，促進 CD4 T 細胞增殖和Ⅱ型干擾素的產生，然而近年來發現其在腫瘤中也具有免疫調節功能，包括增強吲哚胺 2，3-雙加氧酶 1（indoleamine 2，3-dioxygenase 1，IDO）及程序性死亡受體-配體 1（programmed cell death-Ligand 1，PD-L1）的表達[32]。同時，有研究[33]表明，乳腺癌患者的血清 IL27 水平顯著高于健康人群，且與乳腺癌的臨床分期呈正相關。然而目前對 IL27 在乳腺癌中產生的具體作用及其機制尚不明確。此外，在本研究中確定了過去缺乏相關研究的 IFNE 在乳腺癌中的預測作用，這可能為進一步研究提供新的方向。
本研究中，基因集富集分析以及免疫富集分析的結果均顯示高風險組患者的免疫微環境可能是其不良預后的重要貢獻者。高風險組患者 TME 中表現出較高比例的調節型 T 細胞、巨噬細胞 M2 和肥大細胞。調節型 T 細胞和巨噬細胞 M2 作為抗炎和促腫瘤免疫細胞，在近年來已被公認為在促進乳腺癌轉移進展中發揮重要作用，并與不良預后有關[34]。此外，近年研究[35-36]表現，肥大細胞可以被蛋白激酶 Ds 募集進入 TME，并進一步生成血管生成因子以促進血管生成，并與患者的淋巴轉移及不良預后呈正相關關系。因此，本研究建立的風險評分方程可以較好地反映患者的免疫微環境狀態并評估患者的預后。
本研究存在著一定的局限性。首先，本研究為回顧性研究，尚需進行進一步的前瞻性研究。其次，本研究僅對轉錄組數據進行了研究，不一定能完全反映腫瘤發生發展中的生理病理狀態，缺乏細胞及動物實驗驗證。因此，目前的結論需要在今后的實驗中加以驗證。
綜上所述，本研究建立的基于 DEIRGs 的預后風險評分方程，并根據風險評分將患者分為高風險組及低風險組，2 組患者生存結局的差異有統計學意義，可能與腫瘤免疫微環境失衡有關。該發現可能為開發新的免疫生物學標志物和靶向治療提供參考。
重要聲明
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作者貢獻聲明：俞鑫負責研究設計、數據處理和論文撰寫；孫圣榮和王衛星負責論文審改。
