引用本文： 何玲華, 劉凱敏, 佟虹興, 楊超, 陳剛. 肝細胞肝癌免疫檢查點阻斷治療療效相關生物標志物的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(1): 112-117. doi: 10.7507/1007-9424.202103044 復制
肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，我國每年的新發病例數及死亡病例數占全球的一半以上，嚴重威脅著國民的健康水平[1-2]。由于 HCC 起病隱匿、惡性程度高，約有 60% 的 HCC 患者確診時即已喪失手術機會[3]，因此如何提高中晚期不可切除患者的臨床療效成為 HCC 治療的關鍵。目前，以靶向程序性死亡受體 1 及其配體 1（PD-1/PD-L1）通路為代表的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitions，ICIs）治療是中晚期 HCC 轉化治療的研究熱點。CheckMate 040 研究[4]和 KEYNOTE-224 研究[5]分別評價了 Nivolumab 和 Pembrolizumab 單藥用于治療晚期 HCC 患者的有效性和安全性，結果顯示二者的中位生存期分別為 15.6 個月和 12.9 個月。基于這兩項Ⅱ期臨床試驗研究結果，2018 年 11 月 FDA 先后批準了 Nivolumab 和 Pembrolizumab 單藥用于晚期 HCC 的二線治療，開啟了 HCC 免疫治療的新時代。然而仍有相當一部分患者不能對單藥免疫治療產生應答，不同治療方式的聯合治療是當前 HCC 治療領域探索的熱點和重點，尤其是免疫治療聯合分子靶向治療正在改變著晚期 HCC 的一線治療模式，如何篩選優勢人群及確定最佳的聯合治療方案成為當前 HCC 治療面臨的一大挑戰。因此亟需尋找一種或多種與療效相關的生物標志物對 HCC 患者進行分層，區分應答者和無應答者，對預計不會對免疫療法作出反應的患者則推薦使用其他的替代治療，避免不必要的毒性。筆者現總結在 HCC 治療中，以 PD-1/PD-L1 抑制劑為主的 ICIs 單藥治療及其與靶向藥物聯合治療療效的相關生物標志物，為有效地判定 ICIs 的療效提供依據，并探討其在實現 HCC 精準免疫治療方面的發展方向。
1 腫瘤組織內生物標志物
免疫檢查點是 T 細胞表面的興奮性共刺激或協同抑制性分子，又被稱為“免疫細胞剎車”。T 細胞通過其抗原受體（TCR）識別腫瘤細胞表面的主要組織相容性復合體（MHC）分子而被活化，然后產生 γ-干擾素（INF-γ）與腫瘤細胞和腫瘤微環境中的其他細胞表面的 γ-干擾素受體（INF-γR）結合，通過非受體酪氨酸激酶-信號轉導子和轉錄激活子（JAK-STAT）信號通路誘導 PD-L1 和 PD-L2 在腫瘤細胞表面的反應性表達。PD-1 是活化的 CD4+ 和 CD8+ T 細胞、B 細胞、單核細胞、NK 細胞表面廣泛表達的協同抑制性分子，與腫瘤細胞表面的 PD-L1和 PD-L2 結合后可使試圖攻擊腫瘤的 T 細胞失活，包括抗 PD-1 和抗 PD-L1 抗體在內的 ICIs 即通過阻斷 PD-1/PD-L1 通路誘導細胞毒性 T 細胞增殖并向腫瘤內浸潤（圖1），從而發揮抗腫瘤的效應[6-8]。
圖1
示 ICIs 的阻斷治療機制
腫瘤組織內生物標志物包括 PD-L1 表達、腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）和腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating T cell，ILTs）。
1.1 PD-L1 表達
理論上，PD-L1 的表達是預測 PD-1/PD-L1 抑制劑療效最直接的標志物，但與其他惡性腫瘤不同，HCC 的發生常伴隨有肝炎或肝硬化，這使得 HCC 的腫瘤微環境更加復雜。HCC 組織中 PD-L1 的分類更復雜，且空間和細胞異質性水平更高，這可能會影響 PD-L1 作為 ICIs 療效的預測指標的可靠性和重復性[9]。在 CheckMate 040 研究[4]中，以 1% 的腫瘤細胞上有 PD-L1 的表達為界，PD-L1 陽性患者的客觀緩解率為 26%，陰性患者為 19%，提示 PD-L1 在腫瘤細胞上的陰性表達對抗 PD-1 治療的客觀反應率與 PD-L1 陽性患者相比無顯著性差異。在一項 Pembrolizumab 治療不可切除晚期 HCC 患者的Ⅱ期臨床試驗[10]中，6 例 PD-L1 染色陰性的 HCC 患者中 2 例為部分緩解（PR），4 例 PD-L1表達陽性者中 1 例為 PR，亦提示 PD-L1 陽性與治療反應之間無明顯相關性。
PD-L1 表達在預測 HCC ICIs的療效方面有重要作用，但其敏感性和特異性不高。其原因可能有：① 檢測模式不同，如組織類型（新鮮組織和存檔切片）、細胞類型（腫瘤細胞和免疫細胞）等都有很大的差異。② PD-L1 的表達受腫瘤微環境中多種分子途徑和免疫細胞的調控，其誘導免疫原性的能力可能因腫瘤類型不同而異，如宿主髓系細胞也可表達 PD-L1，并具有重要的抗腫瘤免疫功能，可作為潛在的生物標志物。③ 既往接受過免疫治療也可能影響 PD-L1 的表達[11-12]。因此，PD-L1 的表達目前在預測 HCC 療效方面存在較大爭議，尚不足以作為常規臨床應用的生物標志物來預測免疫治療的療效。
1.2 TMB
TMB 是指每百萬堿基中，體細胞基因編碼錯誤、堿基替換、基因插入或缺失錯誤的總數。腫瘤特異性突變產生的新抗原可能具有高度的免疫原性，可作為 T 細胞抗腫瘤免疫治療策略的最佳靶點和療效預測指標[13]。已有研究[14-15]表明，免疫治療療效與 CD8+ T 淋巴細胞浸潤程度呈正相關，以 TMB=4.2作為分界點，高 TMB 組的 CD8+ T 淋巴細胞浸潤率明顯高于低 TMB 組。此外，特異性基因突變也可以作為預測 ICIs 應答的生物標志物。有研究[16]顯示，T 細胞識別腫瘤抗原后，INFR信號轉導通路被激活釋放INF，誘導腫瘤細胞及腫瘤微環境細胞表達 PD-L1，從而抑制適應性免疫抵抗過程中的抗腫瘤免疫。該信號通路異常激活、 INF-γ 信號增強可能預示ICIs治療無效，這在腫瘤活檢標本中得到了證實。Harding 等[17]對接受 ICIs 的 HCC 患者進行前瞻性測序發現，在 10 例 Wnt-通路突變的患者中，無一例出現臨床應答（即所有患者在第 1 次間隔掃描時均有疾病進展）；而 17 例無 Wnt-通路突變的患者中有 9 例（53%）具有持久穩定（≥4 個月）或更好的臨床療效，表明 Wnt 改變/β-catenin 突變可能是預測 HCC 對 ICIs 應答的生物標志物之一。另外，Ma 等[18]對 9 例 HCC 患者進行的單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）研究表明，轉錄多樣性較高的 HCC 患者的免疫治療應答率及生存均較差。還有研究[19]表明，HCC 常見的突變基因如腫瘤蛋白 P53（TP53）、TERT 啟動子、β-catenin 1 蛋白編碼基因（CTNNB1）、含溴結構域蛋白 4（BRD4）、混合系白血病基因（MLL）等也可作為可靠的預測突變風險標志物并可指導 HCC 免疫治療的個體化方案選擇。
1.3 ILTs
ILTs 系指浸潤到腫瘤組織中的發揮抗腫瘤作用的 T 淋巴細胞，其密度、位置及表型均被認為與 HCC 的免疫治療療效有關。研究[20]表明，HCC 組織中所有 T 淋巴細胞的浸潤水平較癌周組織明顯降低，T 淋巴細胞浸潤減少下調了突變基因 TP53 的表達，該基因低表達與細胞周期進展和 T 淋巴細胞耗竭的發生密切相關。另一項對可切除的 HCC 患者進行圍手術期 ICIs 治療的免疫分析研究[21]表明，與治療前相比，治療后組織中以 CD8+ T 淋巴細胞浸潤更為顯著，T 淋巴細胞活化標志物 CD45RO 和顆粒酶 B（GzmB）的表達量分別增加了 2 倍和3 倍，免疫細胞上轉錄因子叉頭盒子 P3（Foxp3）和 PD-L1 的表達上調，這些增加的 T 淋巴細胞均參與了抗腫瘤反應。ICIs 應答者腫瘤組織中有較高數量的 CD8+ T 淋巴細胞、PD-1 和 PD-L1 表達細胞，且 PD-1 和 PD-L1 表達細胞的數量非常接近；CD8+ T 淋巴細胞則呈階梯式積聚，最初僅限于侵襲性邊緣，隨后進入腫瘤實質，位于侵襲性腫瘤邊緣的 CD8+ T 淋巴細胞是影響抗 PD-1 抗體療效的重要因素[22]。Kim 等[23]研究 HCC 耗竭 T 淋巴細胞的特征后發現，PD-1 高表達 CD8+ T 淋巴細胞中調控 T 淋巴細胞耗竭的基因水平高于 PD-1 中間表達細胞及低表達細胞，在抗 CD3 作用下，該細胞可表達 T 淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白分子 3（TIM3）和淋巴細胞活化基因-3（LAG3），產生低水平的 IFN-γ 和腫瘤壞死因子。針對免疫細胞特定表型的抗體治療，進一步恢復抗腫瘤免疫細胞的增殖及其細胞因子的產生，可能更容易從免疫檢查點阻斷療法中獲益。此外，其他免疫細胞亞群，如腫瘤組織中調節性 T 細胞（Treg）的耗竭也可有效地預測 PD-1 阻斷免疫治療中的腫瘤進展[24]。
2 瘤外組織生物標志物
瘤外組織生物標志物包括外周免疫細胞及細胞因子、循環腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，CtDNA）、腸道微生物菌群等。
2.1 外周血中的生物標志物
血液是液體活檢重要的生物組織標本，具有無創性、易重復性、可動態監測等優點，近年來在腫瘤的早期診斷、治療監測與預后中受到了極大的關注。
2.1.1 外周免疫細胞及細胞因子
血液中 CD8+ T 淋巴細胞的激活與整個腫瘤負荷與臨床預后相關，耗竭的 CD8+ T 淋巴細胞通過抗 PD-1 治療優先恢復活力，追蹤活化的 CD8+ T 淋巴細胞數量可預測抗PD-1 治療的療效。研究[25]表明，在由多種病因和基因組異質性引起的慢性炎癥環境中，PD-1 的表達上調，并促使活化的 CD8+ T 淋巴細胞發生功能障礙和耗竭，阻斷 PD-1/PD-L1 通路可促進免疫細胞增殖并改善抗病毒等治療的免疫應答。另外，免疫細胞表型及細胞因子也可作為免疫檢查點阻斷反應的一個潛在的生物標志物。循環 T 淋巴細胞與組織內浸潤的 T 淋巴細胞的腫瘤抗原特異性和 TCR 儲備相似，提示循環淋巴細胞監測可作為評估腫瘤常駐抗腫瘤淋巴細胞的窗口，外周 TCR 儲備譜也可作為免疫檢查點阻斷治療臨床療效的潛在生物標志物[26-27]。此外，有研究[10]表明，基線血漿轉化生長因子-β（TGF-β）≥200 ng/L 的 HCC 患者總生存期和無疾病進展期的中位數分別為 7 個月和 2 個月，而 TGF-β<200 ng/L 患者的中位數均>25 個月。在小鼠尿路上皮癌模型[28]中同樣發現，抗 TGF-β 抗體和抗 PD-L1 抗體聯合治療后 TGF-β 信號在基質細胞中的表達下調，且 T 細胞明顯向腫瘤中心浸潤，而單獨應用任一單抗治療時，T 淋巴細胞的定位都沒有發生改變。這些結果均表明低水平的基線血漿 TGF-β 通過促進免疫細胞的移位進而增強抗 PD-L1 抗體的抗腫瘤作用。最近有研究[29]表明，外周血 PD-L1 高表達與 HCC 死亡率和復發率增高有關，可作為一種方便的判斷 HCC 患者預后的血清標志物。
2.1.2 CtDNA
CtDNA 是包含了關于 HCC 或轉移性病變的癌細胞全部突變信息的 DNA 片段，能更準確、更敏感地反映腫瘤負荷并預測治療反應[30]。Cai 等[31]通過長期隨訪 HCC 患者的血漿標本發現，手術治療后 CtDNA 的拷貝數變異數（copy number variation，CNV）和單核苷酸變異數（single-nucleotide variation，SNV）明顯降低（術前：SNV 分數=0.472，CNV 分數=0.266；術后第 15 天：SNV 分數=0.002，CNV 分數=0；術后第 53 天：SNV 分數=0.012，CNV 分數=0）；從術后第 105 天到術后第 175 天，SNV 從 0.124 增加到 0.404，CNV 從 0.068 增加到 0.21，與 MRI 圖像上腫瘤體積的增大一致，這提示 CtDNA 水平的動態變化與患者的腫瘤負荷直接相關。Ikeda 等[32]動態分析了接受卡培他濱化療后因副作用和疾病進展而停藥患者的 CtDNA，結果顯示，突變等位基因 ARID1A 和 BRCA2 的比例降低，并出現了新的 BRCA1 和 TP53 基因突變，這種特征性的基因改變可能反映了化療對 HCC 療效及不良反應的影響。Khagi 等[33]通過高通量測序技術檢測了 69 例接受 ICIs 治療的實體腫瘤患者的 CtDNA，結果顯示 CtDNA 高突變組患者的客觀緩解率明顯高于低突變組（45% 比 15%）。也有研究[34]表明，晚期 HCC 中 CtDNA 突變最多的依次為 TERT 啟動子（51%）、TP53（32%）、CTNNB1（17%）、人第 10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN，8%），軸突蛋白 1（AXIN1，6%）、富 AT 交互域 2（ARID2，6%）、組蛋白賴氨酸 N-甲基轉移酶 2D（KMT2D，6%）和結節性硬化癥抑癌基因 2（TSC2，6%），與早期 HCC 的突變頻率相似，可作為系統治療原發耐藥的預測指標。
CtDNA 作為一種新的標志物，代表來自腫瘤或多個轉移部位的脫落 DNA，在 HCC 的早期診斷、療效預測或轉移監測等臨床實踐中展現出廣闊的應用前景，尤其是在分子靶向藥物和免疫治療參與的全身系統治療中。但目前納入 CtDNA 臨床試驗的 HCC 患者的數量仍然有限。此外，經導管動脈化療栓塞（TACE）誘導腫瘤細胞壞死后釋放出 CtDNA，聯合 TACE 治療是否影響 CtDNA 監測 HCC 病情變化的準確性也是需要考慮的問題之一。
2.2 腸道微生物群
越來越多的研究[35-36]表明腸道微生物在 HCC 的發生發展中起著重要的作用，調節腸道微生物群可能會影響對包括 HCC 在內的多種癌治療的療效。在小鼠異種移植模型中，Routy 等[37]觀察到廣譜抗生素治療或特定無菌環境明顯影響抗 PD-1 抗體或聯合抗細胞毒性 T 淋巴細胞相關蛋白 4（抗 CTLA-4）治療的療效，在非小細胞肺癌患者中也觀察到了類似的現象，推測使用抗生素引起腸道微生物失調可能會影響小鼠腫瘤模型和癌患者行 ICIs 治療的療效；該研究還對腸道微生物菌群的組成進行了宏基因組分析，結果發現嗜黏菌 A 與患者免疫治療的療效顯著相關。Zheng 等[38]用基因組測序法評價和分析接受帕博麗珠單抗治療的 HCC 患者腸道細菌特性的動態變化，結果顯示治療開始前，厚壁菌（Firmicutes）、擬桿菌（Bacteroidetes）和變形桿菌（Proteobacteria）在應答組（R，完全或部分反應，或疾病穩定持續 6 個月以上）和無應答組（NR，病情進展或病情穩定持續時間不超過 6 個月）的糞便微生物群中均占主導地位，這與健康成人的研究結果一致；隨著治療的進行，R 組的微生物菌群組成保持相對穩定；然而，在 NR 組中變形桿菌早在第 3 周就增加并在第 12 周成為優勢菌群，表明腸道微生物多樣性和組成的動態變化特征可能對藥物療效和疾病預后有明顯影響。Li 等[39]以乙肝病毒感染人群為研究對象，探討了晚期原發性 HCC 患者腸道微生物區系的特點，研究同樣表明對 ICIs 治療有反應的 HCC 患者中，腸道微生物群的多樣性明顯增加，柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium）高菌量患者的無進展生存時間（PFS）明顯延長，擬桿菌屬（Bacteroidales）高菌量患者的 PFS 則縮短。綜上所述，腸道微生物菌群組成可能是 HCC 免疫治療的療效預測標志物之一，通過菌群移植等方式調節腸道微生物群有望成為一種很有前途的腫瘤免疫治療的新輔助療法，但腸道微生物菌群與宿主對 HCC 患者免疫治療的反應之間的因果關系仍不清楚，還需要更多的研究進一步深入探討。
3 靶向聯合免疫治療療效的生物標志物
血管生成和免疫抑制是腫瘤微環境的兩大特征。腫瘤細胞分泌的血管內皮生成因子（VEGF）在腫瘤的發展中具有雙重功能：一是誘導異常血管形成，二是發揮免疫抑制因子的作用[40]。在侖伐替尼（Lenvatinib）與抗 PD-1 抗體聯合治療 HCC 小鼠的研究[41-42]中發現，Lenvatinib 不僅是一種有效的VEGF受體（VEGFR）和成纖維生長因子受體信號抑制劑，而且是一種有效的免疫調節劑，可通過減少腫瘤相關巨噬細胞（TAMS）、增加活化的 CD8+ T 淋巴細胞數目及其分泌的 INF-γ 和 GzmB 來調節腫瘤微環境中的腫瘤免疫，其與抗 PD-1 抗體聯合治療更進一步提高了活化 CD8+ T 淋巴細胞的百分比，這可能是靶向聯合免疫治療優于單藥治療的機制之一。還有研究[43]表明，抗 PD-1 抗體與抗 VEGFR-2 抗體聯合治療可通過增加 HCC 組織中活化的 CD8+ T 淋巴細胞數，降低 Treg、髓源性抑制細胞和 TAMS 的免疫抑制活性來重塑腫瘤免疫微環境。PD-L1 抑制劑阿替利珠單抗（Atezolizumab）聯合抗血管生成藥貝伐珠單抗（T+A 組合）對比一線標準治療的索拉菲尼，總生存期和 PFS 顯著改善，成為目前唯一獲得 FDA 批準治療無法切除或轉移性 HCC 的免疫治療方案。對患者的基因特征及免疫標志物進行分析發現，T+A 組合應答患者的 VEGFR-2、髓系細胞-1 受體（Trem-1）表達上調，髓系細胞、Treg 數量均明顯增高[44-45]。這些觀察結果與小鼠 HCC 模型臨床前研究中所涉及的機制是一致的。此外，有數據[43, 46]表明 VEGF/VEGFR-2 阻斷治療可減少腫瘤組織和外周血中 Treg 和髓源性抑制細胞數量，提示抗血管生成治療可以解除髓系細胞及 Treg 在PD-1/PD-L1 阻斷治療中的免疫抑制作用，但這需要更多研究進一步驗證。
總的來說，目前靶向聯合免疫治療相關生物標志物的數據多來源于抗血管生成治療增強免疫檢查點阻斷治療效果的機制研究，隨著雙免疫聯合、免疫聯合抗血管生成靶向藥物、免疫聯合放化療等不同組合方案的進展和突破，生物標志物的研究將更加復雜。
4 小結與展望
以 ICIs 為代表的免疫治療及 ICIs 靶向治療聯合方案相關的生物標志物對優勢人群的篩選、最佳聯合策略的選擇及療效評估均具有重要價值，這是一項必要且極具挑戰性的工作。遺傳、微環境和機體各因素之間的復雜相互作用決定了HCC 對免疫療法的反應狀況。現有的生物標志物可以識別小的、部分重疊或互補的患者亞組，但單個生物標志物并不是預測對 ICIs 治療反應的一個完美的指標。盡管目前靶向聯合免疫治療是 HCC 治療的主要方向，但對靶向和免疫單藥治療相關的生物標志物的探索同樣重要。根據免疫治療的特點來進行評估，深入研究腫瘤微環境中免疫檢查點的作用機制、靶向通路，及其與靶向治療等不同方式聯合治療策略的作用機制或其阻斷的分子和細胞效應均是必要的，且需要更多的前瞻性研究來證實這些生物標志物的預測價值，并建立一個多因素預測模型或免疫評分來篩選可能獲益的患者，這對 HCC 的精準免疫治療具有重要意義。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：何玲華負責文章的撰寫；陳剛負責文章內容的審閱及提出修改意見；劉凱敏、佟虹興和楊超負責文獻的補充查閱。
肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，我國每年的新發病例數及死亡病例數占全球的一半以上，嚴重威脅著國民的健康水平[1-2]。由于 HCC 起病隱匿、惡性程度高，約有 60% 的 HCC 患者確診時即已喪失手術機會[3]，因此如何提高中晚期不可切除患者的臨床療效成為 HCC 治療的關鍵。目前，以靶向程序性死亡受體 1 及其配體 1（PD-1/PD-L1）通路為代表的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitions，ICIs）治療是中晚期 HCC 轉化治療的研究熱點。CheckMate 040 研究[4]和 KEYNOTE-224 研究[5]分別評價了 Nivolumab 和 Pembrolizumab 單藥用于治療晚期 HCC 患者的有效性和安全性，結果顯示二者的中位生存期分別為 15.6 個月和 12.9 個月。基于這兩項Ⅱ期臨床試驗研究結果，2018 年 11 月 FDA 先后批準了 Nivolumab 和 Pembrolizumab 單藥用于晚期 HCC 的二線治療，開啟了 HCC 免疫治療的新時代。然而仍有相當一部分患者不能對單藥免疫治療產生應答，不同治療方式的聯合治療是當前 HCC 治療領域探索的熱點和重點，尤其是免疫治療聯合分子靶向治療正在改變著晚期 HCC 的一線治療模式，如何篩選優勢人群及確定最佳的聯合治療方案成為當前 HCC 治療面臨的一大挑戰。因此亟需尋找一種或多種與療效相關的生物標志物對 HCC 患者進行分層，區分應答者和無應答者，對預計不會對免疫療法作出反應的患者則推薦使用其他的替代治療，避免不必要的毒性。筆者現總結在 HCC 治療中，以 PD-1/PD-L1 抑制劑為主的 ICIs 單藥治療及其與靶向藥物聯合治療療效的相關生物標志物，為有效地判定 ICIs 的療效提供依據，并探討其在實現 HCC 精準免疫治療方面的發展方向。
1 腫瘤組織內生物標志物
免疫檢查點是 T 細胞表面的興奮性共刺激或協同抑制性分子，又被稱為“免疫細胞剎車”。T 細胞通過其抗原受體（TCR）識別腫瘤細胞表面的主要組織相容性復合體（MHC）分子而被活化，然后產生 γ-干擾素（INF-γ）與腫瘤細胞和腫瘤微環境中的其他細胞表面的 γ-干擾素受體（INF-γR）結合，通過非受體酪氨酸激酶-信號轉導子和轉錄激活子（JAK-STAT）信號通路誘導 PD-L1 和 PD-L2 在腫瘤細胞表面的反應性表達。PD-1 是活化的 CD4+ 和 CD8+ T 細胞、B 細胞、單核細胞、NK 細胞表面廣泛表達的協同抑制性分子，與腫瘤細胞表面的 PD-L1和 PD-L2 結合后可使試圖攻擊腫瘤的 T 細胞失活，包括抗 PD-1 和抗 PD-L1 抗體在內的 ICIs 即通過阻斷 PD-1/PD-L1 通路誘導細胞毒性 T 細胞增殖并向腫瘤內浸潤（圖1），從而發揮抗腫瘤的效應[6-8]。
圖1
示 ICIs 的阻斷治療機制
腫瘤組織內生物標志物包括 PD-L1 表達、腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）和腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating T cell，ILTs）。
1.1 PD-L1 表達
理論上，PD-L1 的表達是預測 PD-1/PD-L1 抑制劑療效最直接的標志物，但與其他惡性腫瘤不同，HCC 的發生常伴隨有肝炎或肝硬化，這使得 HCC 的腫瘤微環境更加復雜。HCC 組織中 PD-L1 的分類更復雜，且空間和細胞異質性水平更高，這可能會影響 PD-L1 作為 ICIs 療效的預測指標的可靠性和重復性[9]。在 CheckMate 040 研究[4]中，以 1% 的腫瘤細胞上有 PD-L1 的表達為界，PD-L1 陽性患者的客觀緩解率為 26%，陰性患者為 19%，提示 PD-L1 在腫瘤細胞上的陰性表達對抗 PD-1 治療的客觀反應率與 PD-L1 陽性患者相比無顯著性差異。在一項 Pembrolizumab 治療不可切除晚期 HCC 患者的Ⅱ期臨床試驗[10]中，6 例 PD-L1 染色陰性的 HCC 患者中 2 例為部分緩解（PR），4 例 PD-L1表達陽性者中 1 例為 PR，亦提示 PD-L1 陽性與治療反應之間無明顯相關性。
PD-L1 表達在預測 HCC ICIs的療效方面有重要作用，但其敏感性和特異性不高。其原因可能有：① 檢測模式不同，如組織類型（新鮮組織和存檔切片）、細胞類型（腫瘤細胞和免疫細胞）等都有很大的差異。② PD-L1 的表達受腫瘤微環境中多種分子途徑和免疫細胞的調控，其誘導免疫原性的能力可能因腫瘤類型不同而異，如宿主髓系細胞也可表達 PD-L1，并具有重要的抗腫瘤免疫功能，可作為潛在的生物標志物。③ 既往接受過免疫治療也可能影響 PD-L1 的表達[11-12]。因此，PD-L1 的表達目前在預測 HCC 療效方面存在較大爭議，尚不足以作為常規臨床應用的生物標志物來預測免疫治療的療效。
1.2 TMB
TMB 是指每百萬堿基中，體細胞基因編碼錯誤、堿基替換、基因插入或缺失錯誤的總數。腫瘤特異性突變產生的新抗原可能具有高度的免疫原性，可作為 T 細胞抗腫瘤免疫治療策略的最佳靶點和療效預測指標[13]。已有研究[14-15]表明，免疫治療療效與 CD8+ T 淋巴細胞浸潤程度呈正相關，以 TMB=4.2作為分界點，高 TMB 組的 CD8+ T 淋巴細胞浸潤率明顯高于低 TMB 組。此外，特異性基因突變也可以作為預測 ICIs 應答的生物標志物。有研究[16]顯示，T 細胞識別腫瘤抗原后，INFR信號轉導通路被激活釋放INF，誘導腫瘤細胞及腫瘤微環境細胞表達 PD-L1，從而抑制適應性免疫抵抗過程中的抗腫瘤免疫。該信號通路異常激活、 INF-γ 信號增強可能預示ICIs治療無效，這在腫瘤活檢標本中得到了證實。Harding 等[17]對接受 ICIs 的 HCC 患者進行前瞻性測序發現，在 10 例 Wnt-通路突變的患者中，無一例出現臨床應答（即所有患者在第 1 次間隔掃描時均有疾病進展）；而 17 例無 Wnt-通路突變的患者中有 9 例（53%）具有持久穩定（≥4 個月）或更好的臨床療效，表明 Wnt 改變/β-catenin 突變可能是預測 HCC 對 ICIs 應答的生物標志物之一。另外，Ma 等[18]對 9 例 HCC 患者進行的單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）研究表明，轉錄多樣性較高的 HCC 患者的免疫治療應答率及生存均較差。還有研究[19]表明，HCC 常見的突變基因如腫瘤蛋白 P53（TP53）、TERT 啟動子、β-catenin 1 蛋白編碼基因（CTNNB1）、含溴結構域蛋白 4（BRD4）、混合系白血病基因（MLL）等也可作為可靠的預測突變風險標志物并可指導 HCC 免疫治療的個體化方案選擇。
1.3 ILTs
ILTs 系指浸潤到腫瘤組織中的發揮抗腫瘤作用的 T 淋巴細胞，其密度、位置及表型均被認為與 HCC 的免疫治療療效有關。研究[20]表明，HCC 組織中所有 T 淋巴細胞的浸潤水平較癌周組織明顯降低，T 淋巴細胞浸潤減少下調了突變基因 TP53 的表達，該基因低表達與細胞周期進展和 T 淋巴細胞耗竭的發生密切相關。另一項對可切除的 HCC 患者進行圍手術期 ICIs 治療的免疫分析研究[21]表明，與治療前相比，治療后組織中以 CD8+ T 淋巴細胞浸潤更為顯著，T 淋巴細胞活化標志物 CD45RO 和顆粒酶 B（GzmB）的表達量分別增加了 2 倍和3 倍，免疫細胞上轉錄因子叉頭盒子 P3（Foxp3）和 PD-L1 的表達上調，這些增加的 T 淋巴細胞均參與了抗腫瘤反應。ICIs 應答者腫瘤組織中有較高數量的 CD8+ T 淋巴細胞、PD-1 和 PD-L1 表達細胞，且 PD-1 和 PD-L1 表達細胞的數量非常接近；CD8+ T 淋巴細胞則呈階梯式積聚，最初僅限于侵襲性邊緣，隨后進入腫瘤實質，位于侵襲性腫瘤邊緣的 CD8+ T 淋巴細胞是影響抗 PD-1 抗體療效的重要因素[22]。Kim 等[23]研究 HCC 耗竭 T 淋巴細胞的特征后發現，PD-1 高表達 CD8+ T 淋巴細胞中調控 T 淋巴細胞耗竭的基因水平高于 PD-1 中間表達細胞及低表達細胞，在抗 CD3 作用下，該細胞可表達 T 淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白分子 3（TIM3）和淋巴細胞活化基因-3（LAG3），產生低水平的 IFN-γ 和腫瘤壞死因子。針對免疫細胞特定表型的抗體治療，進一步恢復抗腫瘤免疫細胞的增殖及其細胞因子的產生，可能更容易從免疫檢查點阻斷療法中獲益。此外，其他免疫細胞亞群，如腫瘤組織中調節性 T 細胞（Treg）的耗竭也可有效地預測 PD-1 阻斷免疫治療中的腫瘤進展[24]。
2 瘤外組織生物標志物
瘤外組織生物標志物包括外周免疫細胞及細胞因子、循環腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，CtDNA）、腸道微生物菌群等。
2.1 外周血中的生物標志物
血液是液體活檢重要的生物組織標本，具有無創性、易重復性、可動態監測等優點，近年來在腫瘤的早期診斷、治療監測與預后中受到了極大的關注。
2.1.1 外周免疫細胞及細胞因子
血液中 CD8+ T 淋巴細胞的激活與整個腫瘤負荷與臨床預后相關，耗竭的 CD8+ T 淋巴細胞通過抗 PD-1 治療優先恢復活力，追蹤活化的 CD8+ T 淋巴細胞數量可預測抗PD-1 治療的療效。研究[25]表明，在由多種病因和基因組異質性引起的慢性炎癥環境中，PD-1 的表達上調，并促使活化的 CD8+ T 淋巴細胞發生功能障礙和耗竭，阻斷 PD-1/PD-L1 通路可促進免疫細胞增殖并改善抗病毒等治療的免疫應答。另外，免疫細胞表型及細胞因子也可作為免疫檢查點阻斷反應的一個潛在的生物標志物。循環 T 淋巴細胞與組織內浸潤的 T 淋巴細胞的腫瘤抗原特異性和 TCR 儲備相似，提示循環淋巴細胞監測可作為評估腫瘤常駐抗腫瘤淋巴細胞的窗口，外周 TCR 儲備譜也可作為免疫檢查點阻斷治療臨床療效的潛在生物標志物[26-27]。此外，有研究[10]表明，基線血漿轉化生長因子-β（TGF-β）≥200 ng/L 的 HCC 患者總生存期和無疾病進展期的中位數分別為 7 個月和 2 個月，而 TGF-β<200 ng/L 患者的中位數均>25 個月。在小鼠尿路上皮癌模型[28]中同樣發現，抗 TGF-β 抗體和抗 PD-L1 抗體聯合治療后 TGF-β 信號在基質細胞中的表達下調，且 T 細胞明顯向腫瘤中心浸潤，而單獨應用任一單抗治療時，T 淋巴細胞的定位都沒有發生改變。這些結果均表明低水平的基線血漿 TGF-β 通過促進免疫細胞的移位進而增強抗 PD-L1 抗體的抗腫瘤作用。最近有研究[29]表明，外周血 PD-L1 高表達與 HCC 死亡率和復發率增高有關，可作為一種方便的判斷 HCC 患者預后的血清標志物。
2.1.2 CtDNA
CtDNA 是包含了關于 HCC 或轉移性病變的癌細胞全部突變信息的 DNA 片段，能更準確、更敏感地反映腫瘤負荷并預測治療反應[30]。Cai 等[31]通過長期隨訪 HCC 患者的血漿標本發現，手術治療后 CtDNA 的拷貝數變異數（copy number variation，CNV）和單核苷酸變異數（single-nucleotide variation，SNV）明顯降低（術前：SNV 分數=0.472，CNV 分數=0.266；術后第 15 天：SNV 分數=0.002，CNV 分數=0；術后第 53 天：SNV 分數=0.012，CNV 分數=0）；從術后第 105 天到術后第 175 天，SNV 從 0.124 增加到 0.404，CNV 從 0.068 增加到 0.21，與 MRI 圖像上腫瘤體積的增大一致，這提示 CtDNA 水平的動態變化與患者的腫瘤負荷直接相關。Ikeda 等[32]動態分析了接受卡培他濱化療后因副作用和疾病進展而停藥患者的 CtDNA，結果顯示，突變等位基因 ARID1A 和 BRCA2 的比例降低，并出現了新的 BRCA1 和 TP53 基因突變，這種特征性的基因改變可能反映了化療對 HCC 療效及不良反應的影響。Khagi 等[33]通過高通量測序技術檢測了 69 例接受 ICIs 治療的實體腫瘤患者的 CtDNA，結果顯示 CtDNA 高突變組患者的客觀緩解率明顯高于低突變組（45% 比 15%）。也有研究[34]表明，晚期 HCC 中 CtDNA 突變最多的依次為 TERT 啟動子（51%）、TP53（32%）、CTNNB1（17%）、人第 10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN，8%），軸突蛋白 1（AXIN1，6%）、富 AT 交互域 2（ARID2，6%）、組蛋白賴氨酸 N-甲基轉移酶 2D（KMT2D，6%）和結節性硬化癥抑癌基因 2（TSC2，6%），與早期 HCC 的突變頻率相似，可作為系統治療原發耐藥的預測指標。
CtDNA 作為一種新的標志物，代表來自腫瘤或多個轉移部位的脫落 DNA，在 HCC 的早期診斷、療效預測或轉移監測等臨床實踐中展現出廣闊的應用前景，尤其是在分子靶向藥物和免疫治療參與的全身系統治療中。但目前納入 CtDNA 臨床試驗的 HCC 患者的數量仍然有限。此外，經導管動脈化療栓塞（TACE）誘導腫瘤細胞壞死后釋放出 CtDNA，聯合 TACE 治療是否影響 CtDNA 監測 HCC 病情變化的準確性也是需要考慮的問題之一。
2.2 腸道微生物群
越來越多的研究[35-36]表明腸道微生物在 HCC 的發生發展中起著重要的作用，調節腸道微生物群可能會影響對包括 HCC 在內的多種癌治療的療效。在小鼠異種移植模型中，Routy 等[37]觀察到廣譜抗生素治療或特定無菌環境明顯影響抗 PD-1 抗體或聯合抗細胞毒性 T 淋巴細胞相關蛋白 4（抗 CTLA-4）治療的療效，在非小細胞肺癌患者中也觀察到了類似的現象，推測使用抗生素引起腸道微生物失調可能會影響小鼠腫瘤模型和癌患者行 ICIs 治療的療效；該研究還對腸道微生物菌群的組成進行了宏基因組分析，結果發現嗜黏菌 A 與患者免疫治療的療效顯著相關。Zheng 等[38]用基因組測序法評價和分析接受帕博麗珠單抗治療的 HCC 患者腸道細菌特性的動態變化，結果顯示治療開始前，厚壁菌（Firmicutes）、擬桿菌（Bacteroidetes）和變形桿菌（Proteobacteria）在應答組（R，完全或部分反應，或疾病穩定持續 6 個月以上）和無應答組（NR，病情進展或病情穩定持續時間不超過 6 個月）的糞便微生物群中均占主導地位，這與健康成人的研究結果一致；隨著治療的進行，R 組的微生物菌群組成保持相對穩定；然而，在 NR 組中變形桿菌早在第 3 周就增加并在第 12 周成為優勢菌群，表明腸道微生物多樣性和組成的動態變化特征可能對藥物療效和疾病預后有明顯影響。Li 等[39]以乙肝病毒感染人群為研究對象，探討了晚期原發性 HCC 患者腸道微生物區系的特點，研究同樣表明對 ICIs 治療有反應的 HCC 患者中，腸道微生物群的多樣性明顯增加，柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium）高菌量患者的無進展生存時間（PFS）明顯延長，擬桿菌屬（Bacteroidales）高菌量患者的 PFS 則縮短。綜上所述，腸道微生物菌群組成可能是 HCC 免疫治療的療效預測標志物之一，通過菌群移植等方式調節腸道微生物群有望成為一種很有前途的腫瘤免疫治療的新輔助療法，但腸道微生物菌群與宿主對 HCC 患者免疫治療的反應之間的因果關系仍不清楚，還需要更多的研究進一步深入探討。
3 靶向聯合免疫治療療效的生物標志物
血管生成和免疫抑制是腫瘤微環境的兩大特征。腫瘤細胞分泌的血管內皮生成因子（VEGF）在腫瘤的發展中具有雙重功能：一是誘導異常血管形成，二是發揮免疫抑制因子的作用[40]。在侖伐替尼（Lenvatinib）與抗 PD-1 抗體聯合治療 HCC 小鼠的研究[41-42]中發現，Lenvatinib 不僅是一種有效的VEGF受體（VEGFR）和成纖維生長因子受體信號抑制劑，而且是一種有效的免疫調節劑，可通過減少腫瘤相關巨噬細胞（TAMS）、增加活化的 CD8+ T 淋巴細胞數目及其分泌的 INF-γ 和 GzmB 來調節腫瘤微環境中的腫瘤免疫，其與抗 PD-1 抗體聯合治療更進一步提高了活化 CD8+ T 淋巴細胞的百分比，這可能是靶向聯合免疫治療優于單藥治療的機制之一。還有研究[43]表明，抗 PD-1 抗體與抗 VEGFR-2 抗體聯合治療可通過增加 HCC 組織中活化的 CD8+ T 淋巴細胞數，降低 Treg、髓源性抑制細胞和 TAMS 的免疫抑制活性來重塑腫瘤免疫微環境。PD-L1 抑制劑阿替利珠單抗（Atezolizumab）聯合抗血管生成藥貝伐珠單抗（T+A 組合）對比一線標準治療的索拉菲尼，總生存期和 PFS 顯著改善，成為目前唯一獲得 FDA 批準治療無法切除或轉移性 HCC 的免疫治療方案。對患者的基因特征及免疫標志物進行分析發現，T+A 組合應答患者的 VEGFR-2、髓系細胞-1 受體（Trem-1）表達上調，髓系細胞、Treg 數量均明顯增高[44-45]。這些觀察結果與小鼠 HCC 模型臨床前研究中所涉及的機制是一致的。此外，有數據[43, 46]表明 VEGF/VEGFR-2 阻斷治療可減少腫瘤組織和外周血中 Treg 和髓源性抑制細胞數量，提示抗血管生成治療可以解除髓系細胞及 Treg 在PD-1/PD-L1 阻斷治療中的免疫抑制作用，但這需要更多研究進一步驗證。
總的來說，目前靶向聯合免疫治療相關生物標志物的數據多來源于抗血管生成治療增強免疫檢查點阻斷治療效果的機制研究，隨著雙免疫聯合、免疫聯合抗血管生成靶向藥物、免疫聯合放化療等不同組合方案的進展和突破，生物標志物的研究將更加復雜。
4 小結與展望
以 ICIs 為代表的免疫治療及 ICIs 靶向治療聯合方案相關的生物標志物對優勢人群的篩選、最佳聯合策略的選擇及療效評估均具有重要價值，這是一項必要且極具挑戰性的工作。遺傳、微環境和機體各因素之間的復雜相互作用決定了HCC 對免疫療法的反應狀況。現有的生物標志物可以識別小的、部分重疊或互補的患者亞組，但單個生物標志物并不是預測對 ICIs 治療反應的一個完美的指標。盡管目前靶向聯合免疫治療是 HCC 治療的主要方向，但對靶向和免疫單藥治療相關的生物標志物的探索同樣重要。根據免疫治療的特點來進行評估，深入研究腫瘤微環境中免疫檢查點的作用機制、靶向通路，及其與靶向治療等不同方式聯合治療策略的作用機制或其阻斷的分子和細胞效應均是必要的，且需要更多的前瞻性研究來證實這些生物標志物的預測價值，并建立一個多因素預測模型或免疫評分來篩選可能獲益的患者，這對 HCC 的精準免疫治療具有重要意義。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：何玲華負責文章的撰寫；陳剛負責文章內容的審閱及提出修改意見；劉凱敏、佟虹興和楊超負責文獻的補充查閱。
