引用本文： 唐云輝, 侯令密, 錢雙強, 陳璟泰, 蒲虹羽, 高硯春. IL-8 在三陰性乳腺癌中的差異性表達及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(11): 1462-1468. doi: 10.7507/1007-9424.202103026 復制
乳腺癌是發生在乳腺腺上皮組織的一種生物學特性高度異質性的惡性腫瘤，全球乳腺癌發病率自 20 世紀 70 年代末開始一直呈上升趨勢[1]。據國際癌癥研究所（IARC）發布的 2020 年全球癌癥報告（Global Cancer Report 2020）最新數據[2]顯示：乳腺癌位居女性惡性腫瘤之首，2020 年全球新發病例 210 萬例，每年約 52.2 萬患者死于乳腺癌。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指進行腫瘤免疫組織化學檢查的結果顯示雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體-2（HER-2）的表達均呈陰性的一種特殊類型的乳腺癌，其發病率占乳腺癌的 20%～25%[3]。由于缺乏相應的受體，TNBC 患者不能從傳統的內分泌及抗 HER-2 靶向治療中獲益；同時，TNBC 具有侵襲性強、易轉移、易復發及患者的預后差的特點。近年來，針對 TNBC 靶向治療的研究層出不窮，但均尚無定論，因此在 TNBC 患者臨床治療的選擇上仍需進一步探索。
白細胞介素 8（interleukin 8，IL-8）又名 CXC 趨化因子配體 8（CXC chemokine ligand 8，CXCL8），是最早發現的一種趨化細胞因子，由巨噬細胞、上皮細胞和呼吸道平滑肌細胞分泌[4]。IL-8 在生理狀態下幾乎檢測不到，但可由促炎性細胞因子如腫瘤壞死因子 α（TNF-α）和白細胞介素-1b（IL-1b）迅速誘導。在體內，其主要通過與其受體 IL-8RA ［CXC 趨化因子受體 1（CXC chemokine receptor1，CXCR1）］ 和 IL-8RB ［CXC 趨化因子受體 2（CXC chemokine receptor2，CXCR2） ］ 特異性結合[5]，發揮促炎性生物學作用。隨著研究的深入，IL-8 在多種惡性腫瘤如骨肉瘤[6]、腎癌[7]、結腸癌[8]、卵巢癌[9]、食管癌[10]等中均檢測到呈高表達，并發現其與腫瘤的生長、浸潤和轉移都具有顯著相關性。此外，在朱江等[11]的報道中，也表明了 IL-8 表達與乳腺癌的發生發展密切相關。Bendrik 等[12]發現，IL-8 在 ER 陰性的乳腺癌細胞株中呈過度表達，而在 ER 陽性的乳腺癌細胞株中則呈低表達。Cho 等[13]報道 IL-8 在 TNBC 細胞中有更高分泌量，而與此對應的患者預后相對較差。綜上，進一步闡明 IL-8 在 TNBC 發生、發展中的作用及其機制已成為研究熱點且具有一定的臨床意義。本研究通過檢測 TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白的差異性表達，分析其與 TNBC 患者臨床病理特征之間的關系，為進一步探討 IL-8 的臨床意義和機制研究提供依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
本研究病例納入標準：① 年齡大于 18 周歲，均在川北醫學院附屬醫院行穿刺或局部切除術后病理學檢查診斷為原發性乳腺癌。② 臨床病例資料及隨訪記錄完整，石蠟組織保存完整。③ 穿刺和切除的腫瘤組織免疫組化檢查均為 ER（–）、PR（–）和 HER-2（–）；若 HER-2（+）而行熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）檢測為基因未擴增，同時有川北醫學院附屬醫院病理科出具的 Ki-67 指數及 WHO 分級檢測報告。④ 未合并其他惡性腫瘤。排除標準：① 病理類型為原位癌。② 男性乳腺癌。③ 合并其他惡性腫瘤。④ 免疫組化染色 HER-2（+），但未行 FISH 檢測。⑤ 既往病理檢測指標不全。
根據上述納入和排除標準，本研究回顧性收集了川北醫學院附屬醫院 2010 年 1 月至 2018 年 12 月期間的 80 例 TNBC 患者的病理活檢標本，并收集患者相關的臨床資料（包括患者一般資料、腫瘤病理資料、Ki-67 指數以及相對表達量等）。所有患者均為女性，年齡 30～79 歲，中位年齡為 50 歲。其中>50 歲 33 例，≤50 歲 47 例；無淋巴結轉移 45 例，1～3 枚淋巴結轉移 24 例，≥4 枚淋巴結轉移 11 例。入組患者中非特殊類型浸潤性癌 70 例，非特殊類型浸潤性癌伴導管原位癌 8 例，化生性癌 1 例，皮脂腺樣癌 1 例。根據美國腫瘤聯合會（AJCC）癌癥分期手冊[14]，TNM 分期為Ⅰ期 16 例，Ⅱ期 49 例，Ⅲ期 15 例，本研究無Ⅳ期患者納入。WHO 分級[15]為 1 級 10 例，2 級 40 例，3 級 30 例。14 例（17.5%）患者術前行新輔助化療且順利完成所有化療周期，66 例（82.5%）患者術后予以輔助化療，其中 3 例（3.8%）患者因身體狀況、個人原因或者化療不耐受拒絕化療或中途停止化療；27 例（33.8%）患者術后序貫口服卡培他濱片治療。所有患者均行單純乳腺切除術、乳腺癌改良根治術或乳腺重建手術。本研究納入病例的末次隨訪時間為 2020 年 8 月 10 日。本研究方案通過了川北醫學院附屬醫院倫理委員會的批準 ［批文編號：2021ER（A）010］。
1.2 檢測指標及方法
1.2.1 IL-8 蛋白的表達
采用免疫組織化學染色 SP 法檢測 IL-8 蛋白在 TNBC 腫瘤組織中的表達。IL-8 一抗購自美國 Abcam 公司，二抗及 DAB 顯色劑購自中國上海優寧維公司。切片經 60 ℃ 烤箱烤片 2 h后脫蠟水化，置于 3% 過氧化氫溶液中 20 min 阻斷內源性過氧化物酶活性后，在 1×檸檬酸鈉抗原修復液（中國上海優寧維公司）中經微波修復，室溫冷卻，10% 山羊血清（中國上海優寧維公司）封閉 20 min。然后加入小鼠抗人 IL-8 單克隆一抗（稀釋比 1∶50）4 ℃ 冰箱孵育過夜，室溫下滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗鼠多克隆抗體 IgG，37 ℃ 恒溫箱孵育 20 min，之后通過 DAB 顯色，蘇木精復染、脫水、中性樹膠固定封片。用 PBS 代替一抗作陰性對照。
1.2.2 染色結果判
保持顯微鏡攝片曝光時間及相關背景參數設定，光學顯微鏡（200 倍）下觀察切片，細胞漿染色呈棕黃色或棕褐色顆粒表示染色陽性。每張切片隨機選取 3 個視野拍照，用 Image J 圖像分析軟件對每張切片的 3 個隨機視野計算陽性面積所占比例（陽性面積率），取均值表示每張切片的 IL-8 蛋白表達水平，對 IL-8 蛋白的表達水平行半定量分析。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 24.0 軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布，用均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用獨立樣本比較的 t 檢驗；采用獨立樣本 Person 卡方檢驗和 Fisher 精確檢驗分析 IL-8 蛋白表達強度與 TNBC 臨床病理特征以及無病生存率（DFS）之間的關系。采用 Kaplan-Meier 繪制生存曲線，用 log-rank 檢驗分析 IL-8 蛋白高表達者與低表達者之間的生存差異。多因素 Cox 比例風險回歸分析腫瘤 T 分期、組織學分級、Ki-67 表達情況、淋巴結轉移數目、臨床分期及 IL-8 蛋白表達強度對患者腫瘤復發和轉移的影響，其變量賦值見表 1。檢驗水準 α=0.05。
表1
TNBC 患者無病生存期 Cox 比例風險回歸分析變量賦值
2 結果
2.1 TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白表達檢測結果
80 例 TNBC 腫瘤組織的免疫組化檢測結果顯示有不同程度的 IL-8 蛋白表達，細胞質中有棕黃色顆粒為陽性染色（圖 1a、1b）。利用 X-tile 軟件計算反映 IL-8 蛋白表達水平的平均陽性面積率的最佳截斷值為 19.5%，將平均陽性面積率≥19.5% 界定為 IL-8 高表達組，平均陽性面積率<19.5% 界定為 IL-8 低表達組。80 例 TNBC 患者中，IL-8 蛋白高表達者 18 例、占比 22.5%，低表達者 62 例、占比 77.5%。
圖1
示 TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白的表達檢測結果及其與 Ki-67 表達以及患者 DFS 的相關性分析結果
a、b：示 TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白的高表達（a）和低表達（b）結果（SP ×200）；c、d：示 Ki-67 高表達組（c）和低表達組（d）的 IL-8 蛋白表達情況（SP ×200）；e：不同 Ki-67 表達水平組 IL-8 蛋白的表達情況；f：不同 IL-8 蛋白表達水平組 Ki-67 的表達情況；g：IL-8 蛋白相對表達水平與 TNBC 患者 DFS 的關系
2.2 TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白表達與其臨床病理特征的關系
TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白的表達水平與患者年齡、月經狀態、腫瘤病理類型和是否接受過新輔助化療均無關（P>0.05），但與腫瘤的 T 分期、臨床分期、淋巴結轉移情況、WHO 分級和 Ki-67 指數具有相關性（P<0.05），且 IL-8 蛋白的高表達與患者臨床分期、淋巴結轉移情況及 WHO 分級呈平行關系。具體見表 2。
表2
TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白表達與其臨床病理特征的關系［例（%） ］
2.3 TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白表達與 Ki-67 指數的關系
收集本研究納入研究的 80 例 TNBC 患者的 Ki-67 指數，且以 14% 為界值[16]將 Ki-67 表達劃分為高表達組（n=58）和低表達組（n=22），Ki-67 高表達組中 IL-8 蛋白高表達者 17 例（29.3%），Ki-67 低表達組中 IL-8 蛋白高表達者 1 例（4.5%），經 Fisher 精確檢驗，2 組間的差異具有統計學意義（P=0.037）。IL-8 蛋白高表達組的 Ki-67 相對表達量為 48.890±24.227，IL-8 低表達組的 Ki-67 相對表達量為 37.190±25.810，其差異無統計學意義（t=1.715，P=0.090）。具體見圖 1c-1f。
2.4 TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白表達與患者 DFS 的關系
納入本研究的 80 例患者均獲隨訪，隨訪時間為 2～99 個月，中位隨訪時間為 36 個月。以復發、轉移或死亡作為終點事件，對隨訪資料進行分析。其分析結果顯示：80 例患者中有 8 例患者發生了終點事件，其中 1 例發生雙側鎖骨上淋巴結轉移，5 例出現胸壁腫瘤復發，1 例發生鎖骨下淋巴結轉移，1 例合并骨轉移、胸壁腫瘤復發和頸部Ⅳ區淋巴結轉移。終點事件的發生時間在手術治療結束后 2～96 個月，中位復發/轉移時間為 18 個月。本組患者的 2 年累積 DFS 為 90.0%（72/80）。在發生終點事件的 8 例患者中 IL-8 高表達組有 7 例（87.5%），其 2 年累積 DFS 為 61.1%（11/18）；IL-8 低表達組有 1 例（12.5%），其 2 年累積 DFS 為 98.4%（61/62）。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，并采用log-rank檢驗進行比較，結果顯示，IL-8 高表達組患者的 DFS 差于 IL-8 低表達組（P<0.05），見圖 1g。
2.5 多因素 Cox 比例風險回歸分析 IL-8 蛋白表達水平與 TNBC 患者預后的關系
本研究對 80 例 TNBC 患者預后影響因素進行 Cox 比例風險回歸模型分析。其結果顯示：淋巴結轉移情況、腫瘤 T 分期和 WHO 分級與 TNBC 患者的 DFS 無關；IL-8 蛋白的表達水平以及 TNBC 的臨床分期是影響 TNBC 患者 DFS 的獨立指標（表 3）。
表3
影響 80 例 TNBC 患者 DFS 的 Cox 比例風險回歸分析結果
3 討論
TNBC 作為乳腺癌預后不良、5 年復發率高和總體生存率低的一組亞型，臨床治療的選擇有限。基因治療是腫瘤治療的新模式，為其尋找新的靶點治療，具有較大的臨床意義。
IL-8 作為第 1 個被發現的趨化性細胞因子，可以通過對中性粒細胞和 T 細胞的趨化、激活、脫顆粒等作用誘發炎癥反應和誘導細胞增殖，達到殺菌和殺滅細胞的作用，與類風濕性關節炎、牙周炎、腎小球腎炎等疾病密切相關[17]。近年來，有研究[18]報道 IL-8 在腫瘤細胞中表達明顯升高；有研究[19]顯示，IL-8 可以通過自分泌和旁分泌兩種方式促進腫瘤的進展；已有報道證實其在多種實體腫瘤如胃癌[20]、肺小細胞癌[21]、黑色素瘤[22]等腫瘤的發生、轉移過程中發揮了重要作用。相繼有報道顯示，通過 Elisa 法檢測乳腺癌患者血清中 IL-6 和 IL-8 的表達水平，發現二者在乳腺癌中表達高于正常人群，且 IL-6/IL-8 表達水平與疾病的進展呈正相關[23]。牟成金等[4]通過噻唑藍（MTT）干擾 IL-8 基因表達，發現乳腺癌 MDA-MB-231 細胞活力并未下降，但明顯抑制其侵襲、遷移能力。Cho 等[13]報道 IL-8 在 TNBC 細胞中表達量更高，而與此對應的患者預后相對較差。
3.1 IL-8 表達水平與 TNBC 患者臨床病理特征的關系
Ki-67 是一種增殖細胞相關抗原，并且可能是細胞增殖所必需的核蛋白，反映了腫瘤細胞增殖速度。在乳腺癌中，Ki-67 表達水平升高與患者不良預后獨立相關[24]。本研究將 14% 作為 Ki-67 表達強度的臨界值[16]，結果顯示在 Ki-67>14% 的 TNBC 患者中，IL-8 高表達率也較高，可能是通過調節細胞增殖、分化過程，IL-8 與 Ki-67 發揮協同作用。有報道[25]顯示，IL-8 與乳腺癌患者淋巴結狀態和 TNM 分期相關，淋巴結有轉移并且 TNM 分期較晚的患者，IL-8 表達水平高。在本研究中，IL-8 蛋白的表達與 TNBC 患者淋巴結轉移情況相關（P<0.05），有淋巴結轉移患者的 IL-8 蛋白高表達者的占比增高，尤其在淋巴結轉移數目≥4 枚的患者中，IL-8 蛋白高表達者的占比明顯增高（0 枚、1～3 枚和≥4 枚淋巴結轉移者 IL-8 蛋白高表達者的占比分別為 13.3%、29.2% 和 45.5%），該結果與既往報道的一致。淋巴結轉移是乳腺癌轉移方式中最常見的一種，文獻[26]報道血管內皮生長因子-C（VEGF-C）作為一種淋巴管生長刺激因子，可誘導乳腺淋巴管生成，可能是乳腺癌淋巴結轉移高發的重要原因。
乳腺癌的病理組織形態繁綜錯雜，類型較多，各種類型乳腺癌臨床治療方案及患者的預后大相徑庭，臨床上制定治療方案時必須綜合考慮腫瘤的病理類型和組織學分級。本研究采用國際乳腺癌病理分類[27]，將納入的患者分為 4 類，結果顯示在非特殊性浸潤性癌、非特殊性浸潤性癌伴導管原位癌、化生性癌和皮脂腺樣癌中，IL-8 蛋白高低表達者所占比例差異無統計學意義（P>0.05），提示 TNBC 的病理類型與 IL-8 蛋白表達無相關性。導致該結果的可能原因是納入研究的患者數量較少，其中 87.5%（70/80）的患者為非特殊性浸潤性癌，其他病理類型患者占比很低，其中化生性癌與皮脂腺樣癌的患者均只有 1 例，存在數據偏倚可能。因此尚需大樣本的研究來進一步驗證。
3.2 IL-8 表達水平與 TNBC 患者預后的關系
本研究結果顯示：IL-8 高表達組患者的 DFS 低于 IL-8 低表達組。IL-8 高表達組的復發轉移率高達 87.5%，提示 IL-8 作為炎癥因子對腫瘤的增殖、轉移發揮重要作用。多因素回歸分析結果顯示，臨床分期是影響 TNBC 患者預后的獨立危險因素。臨床Ⅲ期患者發生復發轉移的風險是臨床Ⅰ ～Ⅱ期患者的 39.759 倍，意味著臨床分期越晚，患者的預后越差，復發轉移或者死亡的概率越大。IL-8 對 TNBC 患者預后生存也有獨立的預測作用，IL-8 蛋白高表達者較低表達者面臨的疾病進展風險高。
3.3 IL-8 在 TNBC 中的潛在臨床價值
已有研究表明，IL-8 可以通過增加乳腺癌干細胞數量以增強對化療的耐受和抵抗：黃琳等[28]的研究顯示，TNBC 患者出現的臨床化療耐受和抵抗與體內乳腺癌干細胞數量直接相關。隨后，陸續開展了探索二者具體作用機制的研究，也展開了關于 IL-8 拮抗劑以及抑制 CXCR1/2 介導的信號內傳導的相關研究[29]，并取得初步進展。其中最常見的兩種 IL-8 中和抗體 ABX-IL8 和 HumX-IL8[30]，通過拮抗 IL-8 的信號轉導可以明顯抑制腫瘤血管的生成以及腫瘤細胞的生長和轉移。在 David 等[31]的研究中發現，CXCR1 被 CXCR1 特異性阻斷抗體或小分子 CXCR1 抑制劑阻斷，能夠選擇性地殺滅人乳腺癌干細胞，從而明顯改善患者的化療抵抗，表明 CXCR1/2 有望成為轉移性 TNBC 的潛在治療靶點。此外，一些研究表明 IL-8 異常表達可能通過 TNBC 細胞中 EGFR/MEK/ERK 途徑來調節細胞的生物活性。Dey 等[32]的研究結果顯示：應用特異性 EGFR 抑制劑作用于 TNBC 細胞株后，細胞分泌的 IL-8 顯著降低，證明在 TNBC 細胞中 IL-8 的異常表達可能由 EGFR 途徑調節；在實驗中觀察到了 AKT、ERK 和 STAT3 的磷酸化，證明 IL-8 異常表達可能通過 TNBC 細胞中 EGFR/MEK/ERK 途徑來調節細胞的生物活性[33-34]。近年來，在許多實體腫瘤中也發現絲氨酸/蘇氨酸激酶雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路的過度激活，其中在乳腺癌中大概有 70% 的患者該條通路呈激活狀態，與此對應的患者往往臨床預后差，在 TNBC 中此通路尤為重要[35-36]。Lehmann 等[37]的體外實驗研究發現，與基底樣亞型細胞株相比，LAR 亞型 TNBC 細胞株對 PI3K/mTOR 抑制劑 NVP-BEZ235 的敏感度更高，說明對 TNBC 按分子亞型分層研究，更有利于精準治療和個體化治療。
本研究通過免疫組化方法檢測到 IL-8 蛋白在不同臨床病理特征的 TNBC 患者中存在差異性表達，IL-8 蛋白表達陽性面積率與 TNBC 的病理組織學分級、淋巴結轉移情況以及臨床分期具有相關性；IL-8 可聯合臨床病理資料更加精確地判斷患者的預后，為 TNBC 患者提供治療依據。通過多因素 Cox 比例風險回歸分析，IL-8 可作為 TNBC 患者預后的獨立風險預測指標。在復發轉移患者中，有 87.5% 的患者其 IL-8 蛋白呈高表達，這可為尋找TNBC 患者新的治療靶點提供一定的理論基礎。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的相關政策聲明，我們之間沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：唐云輝參與了研究設計、文獻檢索、實驗操作以及文章撰寫；侯令密參與了課題的設計、實驗指導以及文章的審閱和指導；陳璟泰和錢雙強參與了標本的收集以及相關數據的提取；蒲虹羽參與了數據的統計分析以及制圖；高硯春參與了研究設計及文章的審閱與修改。
倫理聲明：該研究方案經過川北醫學院附屬醫院倫理委員會批準［批文編號：2021ER（A）010］。
乳腺癌是發生在乳腺腺上皮組織的一種生物學特性高度異質性的惡性腫瘤，全球乳腺癌發病率自 20 世紀 70 年代末開始一直呈上升趨勢[1]。據國際癌癥研究所（IARC）發布的 2020 年全球癌癥報告（Global Cancer Report 2020）最新數據[2]顯示：乳腺癌位居女性惡性腫瘤之首，2020 年全球新發病例 210 萬例，每年約 52.2 萬患者死于乳腺癌。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指進行腫瘤免疫組織化學檢查的結果顯示雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體-2（HER-2）的表達均呈陰性的一種特殊類型的乳腺癌，其發病率占乳腺癌的 20%～25%[3]。由于缺乏相應的受體，TNBC 患者不能從傳統的內分泌及抗 HER-2 靶向治療中獲益；同時，TNBC 具有侵襲性強、易轉移、易復發及患者的預后差的特點。近年來，針對 TNBC 靶向治療的研究層出不窮，但均尚無定論，因此在 TNBC 患者臨床治療的選擇上仍需進一步探索。
白細胞介素 8（interleukin 8，IL-8）又名 CXC 趨化因子配體 8（CXC chemokine ligand 8，CXCL8），是最早發現的一種趨化細胞因子，由巨噬細胞、上皮細胞和呼吸道平滑肌細胞分泌[4]。IL-8 在生理狀態下幾乎檢測不到，但可由促炎性細胞因子如腫瘤壞死因子 α（TNF-α）和白細胞介素-1b（IL-1b）迅速誘導。在體內，其主要通過與其受體 IL-8RA ［CXC 趨化因子受體 1（CXC chemokine receptor1，CXCR1）］ 和 IL-8RB ［CXC 趨化因子受體 2（CXC chemokine receptor2，CXCR2） ］ 特異性結合[5]，發揮促炎性生物學作用。隨著研究的深入，IL-8 在多種惡性腫瘤如骨肉瘤[6]、腎癌[7]、結腸癌[8]、卵巢癌[9]、食管癌[10]等中均檢測到呈高表達，并發現其與腫瘤的生長、浸潤和轉移都具有顯著相關性。此外，在朱江等[11]的報道中，也表明了 IL-8 表達與乳腺癌的發生發展密切相關。Bendrik 等[12]發現，IL-8 在 ER 陰性的乳腺癌細胞株中呈過度表達，而在 ER 陽性的乳腺癌細胞株中則呈低表達。Cho 等[13]報道 IL-8 在 TNBC 細胞中有更高分泌量，而與此對應的患者預后相對較差。綜上，進一步闡明 IL-8 在 TNBC 發生、發展中的作用及其機制已成為研究熱點且具有一定的臨床意義。本研究通過檢測 TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白的差異性表達，分析其與 TNBC 患者臨床病理特征之間的關系，為進一步探討 IL-8 的臨床意義和機制研究提供依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
本研究病例納入標準：① 年齡大于 18 周歲，均在川北醫學院附屬醫院行穿刺或局部切除術后病理學檢查診斷為原發性乳腺癌。② 臨床病例資料及隨訪記錄完整，石蠟組織保存完整。③ 穿刺和切除的腫瘤組織免疫組化檢查均為 ER（–）、PR（–）和 HER-2（–）；若 HER-2（+）而行熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）檢測為基因未擴增，同時有川北醫學院附屬醫院病理科出具的 Ki-67 指數及 WHO 分級檢測報告。④ 未合并其他惡性腫瘤。排除標準：① 病理類型為原位癌。② 男性乳腺癌。③ 合并其他惡性腫瘤。④ 免疫組化染色 HER-2（+），但未行 FISH 檢測。⑤ 既往病理檢測指標不全。
根據上述納入和排除標準，本研究回顧性收集了川北醫學院附屬醫院 2010 年 1 月至 2018 年 12 月期間的 80 例 TNBC 患者的病理活檢標本，并收集患者相關的臨床資料（包括患者一般資料、腫瘤病理資料、Ki-67 指數以及相對表達量等）。所有患者均為女性，年齡 30～79 歲，中位年齡為 50 歲。其中>50 歲 33 例，≤50 歲 47 例；無淋巴結轉移 45 例，1～3 枚淋巴結轉移 24 例，≥4 枚淋巴結轉移 11 例。入組患者中非特殊類型浸潤性癌 70 例，非特殊類型浸潤性癌伴導管原位癌 8 例，化生性癌 1 例，皮脂腺樣癌 1 例。根據美國腫瘤聯合會（AJCC）癌癥分期手冊[14]，TNM 分期為Ⅰ期 16 例，Ⅱ期 49 例，Ⅲ期 15 例，本研究無Ⅳ期患者納入。WHO 分級[15]為 1 級 10 例，2 級 40 例，3 級 30 例。14 例（17.5%）患者術前行新輔助化療且順利完成所有化療周期，66 例（82.5%）患者術后予以輔助化療，其中 3 例（3.8%）患者因身體狀況、個人原因或者化療不耐受拒絕化療或中途停止化療；27 例（33.8%）患者術后序貫口服卡培他濱片治療。所有患者均行單純乳腺切除術、乳腺癌改良根治術或乳腺重建手術。本研究納入病例的末次隨訪時間為 2020 年 8 月 10 日。本研究方案通過了川北醫學院附屬醫院倫理委員會的批準 ［批文編號：2021ER（A）010］。
1.2 檢測指標及方法
1.2.1 IL-8 蛋白的表達
采用免疫組織化學染色 SP 法檢測 IL-8 蛋白在 TNBC 腫瘤組織中的表達。IL-8 一抗購自美國 Abcam 公司，二抗及 DAB 顯色劑購自中國上海優寧維公司。切片經 60 ℃ 烤箱烤片 2 h后脫蠟水化，置于 3% 過氧化氫溶液中 20 min 阻斷內源性過氧化物酶活性后，在 1×檸檬酸鈉抗原修復液（中國上海優寧維公司）中經微波修復，室溫冷卻，10% 山羊血清（中國上海優寧維公司）封閉 20 min。然后加入小鼠抗人 IL-8 單克隆一抗（稀釋比 1∶50）4 ℃ 冰箱孵育過夜，室溫下滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗鼠多克隆抗體 IgG，37 ℃ 恒溫箱孵育 20 min，之后通過 DAB 顯色，蘇木精復染、脫水、中性樹膠固定封片。用 PBS 代替一抗作陰性對照。
1.2.2 染色結果判
保持顯微鏡攝片曝光時間及相關背景參數設定，光學顯微鏡（200 倍）下觀察切片，細胞漿染色呈棕黃色或棕褐色顆粒表示染色陽性。每張切片隨機選取 3 個視野拍照，用 Image J 圖像分析軟件對每張切片的 3 個隨機視野計算陽性面積所占比例（陽性面積率），取均值表示每張切片的 IL-8 蛋白表達水平，對 IL-8 蛋白的表達水平行半定量分析。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 24.0 軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布，用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本比較的 t 檢驗；采用獨立樣本 Person 卡方檢驗和 Fisher 精確檢驗分析 IL-8 蛋白表達強度與 TNBC 臨床病理特征以及無病生存率（DFS）之間的關系。采用 Kaplan-Meier 繪制生存曲線，用 log-rank 檢驗分析 IL-8 蛋白高表達者與低表達者之間的生存差異。多因素 Cox 比例風險回歸分析腫瘤 T 分期、組織學分級、Ki-67 表達情況、淋巴結轉移數目、臨床分期及 IL-8 蛋白表達強度對患者腫瘤復發和轉移的影響，其變量賦值見表 1。檢驗水準 α=0.05。
表1
TNBC 患者無病生存期 Cox 比例風險回歸分析變量賦值
2 結果
2.1 TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白表達檢測結果
80 例 TNBC 腫瘤組織的免疫組化檢測結果顯示有不同程度的 IL-8 蛋白表達，細胞質中有棕黃色顆粒為陽性染色（圖 1a、1b）。利用 X-tile 軟件計算反映 IL-8 蛋白表達水平的平均陽性面積率的最佳截斷值為 19.5%，將平均陽性面積率≥19.5% 界定為 IL-8 高表達組，平均陽性面積率<19.5% 界定為 IL-8 低表達組。80 例 TNBC 患者中，IL-8 蛋白高表達者 18 例、占比 22.5%，低表達者 62 例、占比 77.5%。
圖1
示 TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白的表達檢測結果及其與 Ki-67 表達以及患者 DFS 的相關性分析結果
a、b：示 TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白的高表達（a）和低表達（b）結果（SP ×200）；c、d：示 Ki-67 高表達組（c）和低表達組（d）的 IL-8 蛋白表達情況（SP ×200）；e：不同 Ki-67 表達水平組 IL-8 蛋白的表達情況；f：不同 IL-8 蛋白表達水平組 Ki-67 的表達情況；g：IL-8 蛋白相對表達水平與 TNBC 患者 DFS 的關系
2.2 TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白表達與其臨床病理特征的關系
TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白的表達水平與患者年齡、月經狀態、腫瘤病理類型和是否接受過新輔助化療均無關（P>0.05），但與腫瘤的 T 分期、臨床分期、淋巴結轉移情況、WHO 分級和 Ki-67 指數具有相關性（P<0.05），且 IL-8 蛋白的高表達與患者臨床分期、淋巴結轉移情況及 WHO 分級呈平行關系。具體見表 2。
表2
TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白表達與其臨床病理特征的關系［例（%） ］
2.3 TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白表達與 Ki-67 指數的關系
收集本研究納入研究的 80 例 TNBC 患者的 Ki-67 指數，且以 14% 為界值[16]將 Ki-67 表達劃分為高表達組（n=58）和低表達組（n=22），Ki-67 高表達組中 IL-8 蛋白高表達者 17 例（29.3%），Ki-67 低表達組中 IL-8 蛋白高表達者 1 例（4.5%），經 Fisher 精確檢驗，2 組間的差異具有統計學意義（P=0.037）。IL-8 蛋白高表達組的 Ki-67 相對表達量為 48.890±24.227，IL-8 低表達組的 Ki-67 相對表達量為 37.190±25.810，其差異無統計學意義（t=1.715，P=0.090）。具體見圖 1c-1f。
2.4 TNBC 腫瘤組織中 IL-8 蛋白表達與患者 DFS 的關系
納入本研究的 80 例患者均獲隨訪，隨訪時間為 2～99 個月，中位隨訪時間為 36 個月。以復發、轉移或死亡作為終點事件，對隨訪資料進行分析。其分析結果顯示：80 例患者中有 8 例患者發生了終點事件，其中 1 例發生雙側鎖骨上淋巴結轉移，5 例出現胸壁腫瘤復發，1 例發生鎖骨下淋巴結轉移，1 例合并骨轉移、胸壁腫瘤復發和頸部Ⅳ區淋巴結轉移。終點事件的發生時間在手術治療結束后 2～96 個月，中位復發/轉移時間為 18 個月。本組患者的 2 年累積 DFS 為 90.0%（72/80）。在發生終點事件的 8 例患者中 IL-8 高表達組有 7 例（87.5%），其 2 年累積 DFS 為 61.1%（11/18）；IL-8 低表達組有 1 例（12.5%），其 2 年累積 DFS 為 98.4%（61/62）。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，并采用log-rank檢驗進行比較，結果顯示，IL-8 高表達組患者的 DFS 差于 IL-8 低表達組（P<0.05），見圖 1g。
2.5 多因素 Cox 比例風險回歸分析 IL-8 蛋白表達水平與 TNBC 患者預后的關系
本研究對 80 例 TNBC 患者預后影響因素進行 Cox 比例風險回歸模型分析。其結果顯示：淋巴結轉移情況、腫瘤 T 分期和 WHO 分級與 TNBC 患者的 DFS 無關；IL-8 蛋白的表達水平以及 TNBC 的臨床分期是影響 TNBC 患者 DFS 的獨立指標（表 3）。
表3
影響 80 例 TNBC 患者 DFS 的 Cox 比例風險回歸分析結果
3 討論
TNBC 作為乳腺癌預后不良、5 年復發率高和總體生存率低的一組亞型，臨床治療的選擇有限。基因治療是腫瘤治療的新模式，為其尋找新的靶點治療，具有較大的臨床意義。
IL-8 作為第 1 個被發現的趨化性細胞因子，可以通過對中性粒細胞和 T 細胞的趨化、激活、脫顆粒等作用誘發炎癥反應和誘導細胞增殖，達到殺菌和殺滅細胞的作用，與類風濕性關節炎、牙周炎、腎小球腎炎等疾病密切相關[17]。近年來，有研究[18]報道 IL-8 在腫瘤細胞中表達明顯升高；有研究[19]顯示，IL-8 可以通過自分泌和旁分泌兩種方式促進腫瘤的進展；已有報道證實其在多種實體腫瘤如胃癌[20]、肺小細胞癌[21]、黑色素瘤[22]等腫瘤的發生、轉移過程中發揮了重要作用。相繼有報道顯示，通過 Elisa 法檢測乳腺癌患者血清中 IL-6 和 IL-8 的表達水平，發現二者在乳腺癌中表達高于正常人群，且 IL-6/IL-8 表達水平與疾病的進展呈正相關[23]。牟成金等[4]通過噻唑藍（MTT）干擾 IL-8 基因表達，發現乳腺癌 MDA-MB-231 細胞活力并未下降，但明顯抑制其侵襲、遷移能力。Cho 等[13]報道 IL-8 在 TNBC 細胞中表達量更高，而與此對應的患者預后相對較差。
3.1 IL-8 表達水平與 TNBC 患者臨床病理特征的關系
Ki-67 是一種增殖細胞相關抗原，并且可能是細胞增殖所必需的核蛋白，反映了腫瘤細胞增殖速度。在乳腺癌中，Ki-67 表達水平升高與患者不良預后獨立相關[24]。本研究將 14% 作為 Ki-67 表達強度的臨界值[16]，結果顯示在 Ki-67>14% 的 TNBC 患者中，IL-8 高表達率也較高，可能是通過調節細胞增殖、分化過程，IL-8 與 Ki-67 發揮協同作用。有報道[25]顯示，IL-8 與乳腺癌患者淋巴結狀態和 TNM 分期相關，淋巴結有轉移并且 TNM 分期較晚的患者，IL-8 表達水平高。在本研究中，IL-8 蛋白的表達與 TNBC 患者淋巴結轉移情況相關（P<0.05），有淋巴結轉移患者的 IL-8 蛋白高表達者的占比增高，尤其在淋巴結轉移數目≥4 枚的患者中，IL-8 蛋白高表達者的占比明顯增高（0 枚、1～3 枚和≥4 枚淋巴結轉移者 IL-8 蛋白高表達者的占比分別為 13.3%、29.2% 和 45.5%），該結果與既往報道的一致。淋巴結轉移是乳腺癌轉移方式中最常見的一種，文獻[26]報道血管內皮生長因子-C（VEGF-C）作為一種淋巴管生長刺激因子，可誘導乳腺淋巴管生成，可能是乳腺癌淋巴結轉移高發的重要原因。
乳腺癌的病理組織形態繁綜錯雜，類型較多，各種類型乳腺癌臨床治療方案及患者的預后大相徑庭，臨床上制定治療方案時必須綜合考慮腫瘤的病理類型和組織學分級。本研究采用國際乳腺癌病理分類[27]，將納入的患者分為 4 類，結果顯示在非特殊性浸潤性癌、非特殊性浸潤性癌伴導管原位癌、化生性癌和皮脂腺樣癌中，IL-8 蛋白高低表達者所占比例差異無統計學意義（P>0.05），提示 TNBC 的病理類型與 IL-8 蛋白表達無相關性。導致該結果的可能原因是納入研究的患者數量較少，其中 87.5%（70/80）的患者為非特殊性浸潤性癌，其他病理類型患者占比很低，其中化生性癌與皮脂腺樣癌的患者均只有 1 例，存在數據偏倚可能。因此尚需大樣本的研究來進一步驗證。
3.2 IL-8 表達水平與 TNBC 患者預后的關系
本研究結果顯示：IL-8 高表達組患者的 DFS 低于 IL-8 低表達組。IL-8 高表達組的復發轉移率高達 87.5%，提示 IL-8 作為炎癥因子對腫瘤的增殖、轉移發揮重要作用。多因素回歸分析結果顯示，臨床分期是影響 TNBC 患者預后的獨立危險因素。臨床Ⅲ期患者發生復發轉移的風險是臨床Ⅰ ～Ⅱ期患者的 39.759 倍，意味著臨床分期越晚，患者的預后越差，復發轉移或者死亡的概率越大。IL-8 對 TNBC 患者預后生存也有獨立的預測作用，IL-8 蛋白高表達者較低表達者面臨的疾病進展風險高。
3.3 IL-8 在 TNBC 中的潛在臨床價值
已有研究表明，IL-8 可以通過增加乳腺癌干細胞數量以增強對化療的耐受和抵抗：黃琳等[28]的研究顯示，TNBC 患者出現的臨床化療耐受和抵抗與體內乳腺癌干細胞數量直接相關。隨后，陸續開展了探索二者具體作用機制的研究，也展開了關于 IL-8 拮抗劑以及抑制 CXCR1/2 介導的信號內傳導的相關研究[29]，并取得初步進展。其中最常見的兩種 IL-8 中和抗體 ABX-IL8 和 HumX-IL8[30]，通過拮抗 IL-8 的信號轉導可以明顯抑制腫瘤血管的生成以及腫瘤細胞的生長和轉移。在 David 等[31]的研究中發現，CXCR1 被 CXCR1 特異性阻斷抗體或小分子 CXCR1 抑制劑阻斷，能夠選擇性地殺滅人乳腺癌干細胞，從而明顯改善患者的化療抵抗，表明 CXCR1/2 有望成為轉移性 TNBC 的潛在治療靶點。此外，一些研究表明 IL-8 異常表達可能通過 TNBC 細胞中 EGFR/MEK/ERK 途徑來調節細胞的生物活性。Dey 等[32]的研究結果顯示：應用特異性 EGFR 抑制劑作用于 TNBC 細胞株后，細胞分泌的 IL-8 顯著降低，證明在 TNBC 細胞中 IL-8 的異常表達可能由 EGFR 途徑調節；在實驗中觀察到了 AKT、ERK 和 STAT3 的磷酸化，證明 IL-8 異常表達可能通過 TNBC 細胞中 EGFR/MEK/ERK 途徑來調節細胞的生物活性[33-34]。近年來，在許多實體腫瘤中也發現絲氨酸/蘇氨酸激酶雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路的過度激活，其中在乳腺癌中大概有 70% 的患者該條通路呈激活狀態，與此對應的患者往往臨床預后差，在 TNBC 中此通路尤為重要[35-36]。Lehmann 等[37]的體外實驗研究發現，與基底樣亞型細胞株相比，LAR 亞型 TNBC 細胞株對 PI3K/mTOR 抑制劑 NVP-BEZ235 的敏感度更高，說明對 TNBC 按分子亞型分層研究，更有利于精準治療和個體化治療。
本研究通過免疫組化方法檢測到 IL-8 蛋白在不同臨床病理特征的 TNBC 患者中存在差異性表達，IL-8 蛋白表達陽性面積率與 TNBC 的病理組織學分級、淋巴結轉移情況以及臨床分期具有相關性；IL-8 可聯合臨床病理資料更加精確地判斷患者的預后，為 TNBC 患者提供治療依據。通過多因素 Cox 比例風險回歸分析，IL-8 可作為 TNBC 患者預后的獨立風險預測指標。在復發轉移患者中，有 87.5% 的患者其 IL-8 蛋白呈高表達，這可為尋找TNBC 患者新的治療靶點提供一定的理論基礎。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的相關政策聲明，我們之間沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：唐云輝參與了研究設計、文獻檢索、實驗操作以及文章撰寫；侯令密參與了課題的設計、實驗指導以及文章的審閱和指導；陳璟泰和錢雙強參與了標本的收集以及相關數據的提取；蒲虹羽參與了數據的統計分析以及制圖；高硯春參與了研究設計及文章的審閱與修改。
倫理聲明：該研究方案經過川北醫學院附屬醫院倫理委員會批準［批文編號：2021ER（A）010］。
