引用本文： 任俊, 馮娟, 宋偉, 吳敬, 金田力, 付濤. 構建結腸癌預后的免疫相關基因風險標志物及其對結腸癌患者預后的預測. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(11): 1469-1476. doi: 10.7507/1007-9424.202103004 復制
結腸癌是男性中第 3 常見的腫瘤，在全球女性腫瘤中排名第 2[1]。傳統上，TNM 分期系統是評估疾病嚴重程度和預測結腸癌預后的有效工具[2]。然而，同一 TNM 分期的腫瘤患者常存在差異性預后[3]。因此，我們需要找到新的評價指標，以提高對結腸癌預后的預測能力。腫瘤免疫微環境（tumor immune microenvironment，TIME）通常與腫瘤患者的臨床結局有關，并已被用于評估腫瘤的預后[1]。研究[4]表明，TIME 與結腸癌的發生和發展關系密切。本研究通過分析免疫相關基因（immune related genes，IRGs）與結腸癌臨床病理特征之間的關系，期望構建能有效預測結腸癌預后的 IRGs 風險標志物。
1 資料與方法
1.1 數據來源
從癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫（
1.2 差異表達基因（DEGs）分析
所有的統計分析均使用 R 軟件（3.6.1 版）和 GraphPad7 軟件。使用“limma” 軟件包對納入患者的全基因表達量進行分析處理以篩選 DEGs，閾值設定為 |logFC| >2，P<0.05；使用“pheatmap” 軟件包進行熱圖分析；使用“beeswarm” 軟件包進行臨床病理特征相關性分析。檢驗水準 α=0.05。
1.3 IRGs 風險標志物的構建
采用單因素和多因素 Cox 比例風險回歸分析篩選影響結腸癌患者預后的相關基因，建立免疫基因標識。將單因素 Cox比例風險回歸分析結果中 P<0.05 的基因作為下一步的 Cox 比例風險回歸分析的候選基因。基因的風險值按基因相對表達水平乘以風險系數計算，每例患者的所有基因的風險值=（mRNA1 的風險系數×mRNA1 相對表達水平）+（mRNA2 的風險系數×mRNA2 相對表達水平）+……+（mRNAn 的風險系數×mRNAn 相對表達水平）。根據風險值的中位值，將結腸癌患者分為高風險組和低風險組。通過乘積極限法和時序檢驗比較和分析總生存時間（OS）的差異，診斷及預后預測模型的敏感度和特異度分別采用時間依賴的 ROC 曲線進行分析[6]和 ROC 曲線下面積（AUC）進行量化[7]。
1.4 統計學方法
所有統計分析由 SPSS 23.0 軟件完成。采用 R 軟件中的“survivalROC”軟件包計算出AUC，用以評估 IRGs 風險標志物的預測性能[8]。采用單因素和多因素 Cox 比例風險回歸分析以評估 IRGs 風險標志物的風險值是否是 OS 的獨立預后因素。采用卡方檢驗評價 IRGs 與結腸癌臨床病理特征及腫瘤浸潤性免疫細胞（TIICs）的關系。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 DEGs 分析結果及結腸癌患者的臨床病理資料
根據區分標準（P<0.05，|logFC| >2），在 TCGA 數據集中的結腸癌和正常結腸組織中共鑒定出 2 424 個 DEGs，包括 1 753 個上調基因和 671 個下調基因。結腸癌和正常結腸組織中 DEGs 的熱圖見圖1a，452 例結腸癌患者的臨床病理資料見表1。
圖1
示本研究數據庫資料分析結果
a：示 TCGA 數據中結腸癌和正常結腸組織中 DEGs 的熱圖，N 代表正常結腸組織，T 代表結腸癌組織；b、c：示 ImmPort 數據庫中差異表達的 IRGs 熱圖（b）和火山圖（c），圖中紅點代表上調基因，綠點代表下調基因，FDR 是錯誤發現率；d：示基于 IRGs 風險模型的分組分配；e：示高風險組和低風險組的生存狀態；f：高風險組和低風險組患者的生存曲線；g：示時間依賴的 ROC 曲線
表1
452 例結腸癌患者的臨床??病理資料
2.2 IRGs 風險標志物的構建
從 ImmPort 數據庫中下載了 IRGs 的免疫學數據庫和分析門戶（ImmPort），總共有 2 498 個 IRGs, 將其與來自 TCGA 數據庫的數據集取交集，在結腸癌和正常結腸組織中共識別出 206 個差異表達的 IRGs，其中 98 個上調基因，108 個下調基因。圖1b 和 1c 顯示了結腸癌和正常結腸組織中差異表達的 IRGs 的火山圖和熱圖。為了鑒別出與 OS 相關的 IRGs，將 206 個差異表達的 IRGs 進行了單因素 Cox比例風險回歸分析，其結果顯示有 19 個 IRGs 與 OS 相關（P<0.05），見表2。再通過多因素 Cox 比例風險回歸分析確定了與 OS 相關的 11 個 IRGs（表3），包括溶質載體家族 10 成員 2（SLC10A2）、C-X-C 基序趨化因子配體 5（CXCL5）、C-C 基序趨化因子配體（CCL28）、免疫球蛋白 kappa 變量 1D-42（IGKV1D-42）、嗜鉻粒蛋白 A（CHGA）、內皮細胞特異性分子 1（ESM1）、胃泌激素釋放肽（GRP）、斯鈣素 2 抗體（STC2）、尿皮質素（UCN）、催產素受體（OXTR）和免疫球蛋白重常數 γ 1（IGHG1），以此來構建 IRGs 風險標志物模型。其中 CCL28 和 IGHG1 基因雖然P>0.05，但考慮這 2 個基因可能與其他基因共同存在而發揮影響預后的作用，故也納入了 IRGs 風險標志物模型的構建。根據上面 1.3 項中的公式計算風險值，風險值的中位數為 0.896；452 例結腸癌患者中，將生存信息和表達量數據合并后，最終有 414 例患者納入分析。根據中位風險值，414 例患者中有 207 例被納入高風險組，207 例被納入低風險組。圖1d 和 1e 顯示了高、低風險組的風險值分布和患者的生存狀態，圖1f 為高風險組和低風險組 2 組患者的生存曲線，其結果顯示高風險組結腸癌患者的總生存情況差于低風險組（P<0.001）；圖1g 為時間依賴的 ROC，其AUC 為 0.754，提示 IRGs 風險標志物對結腸癌患者預后具有較好的預測能力。
表2
單因素 Cox 比例風險回歸分析結果所示的與 OS 相關的結腸癌組織中差異表達的IRGs
表3
多因素 Cox 比例風險回歸分析結果所示的與 OS 相關的結腸癌組織中差異表達的 IRGs
2.3 IRGs 風險標志物以及臨床病理特征與結腸癌患者 OS 的相關性分析結果
IRGs 基因模型的風險值以及結腸癌臨床病理特征與結腸癌患者 OS 關系的單因素 Cox 比例風險回歸分析結果（圖2a）顯示：IRGs 基因模型的風險值評分以及患者的年齡、臨床分期、T 分期、N 分期、M 分期與結腸癌患者的 OS 相關（P<0.05）；多因素 Cox 比例風險回歸分析結果（圖2b）顯示：IRGs 基因模型的風險值評分以及患者年齡和 T 分期與結腸癌患者的 OS 相關（P<0.05）。
圖2
示 IRGs 風險標志物以及臨床病理特征與結腸癌患者 OS 相關性的單因素（a）及多因素（b）分析結果的森林圖
2.4 11 個 IRGs 及其風險值評分與結腸癌臨床病理分期的關系
在本研究納入分析的 414 例患者中，將生存信息和表達量數據以及患者臨床病理特征數據合并后最終納入了 341 例患者進行分析。11 個 IRGs 及其風險值評分與結腸癌臨床病理分期（T、N、M 及臨床分期）的關系的分析結果見表4。由表4 可見：ESM1 高表達患者的 T 分期晚（P<0.05）；GRP 和 OXTR 高表達患者的 T、N、M 以及臨床分期晚（P<0.05）；IGHG1 低表達、 CXCL5 高表達患者的 M 分期晚（P<0.05）；SLC10A2 高表達患者的臨床分期晚（P<0.05）； IRGs 模型的風險值評分高，提示結腸癌患者的 T 、N、M 及臨床分期均晚（P<0.05）。
表4
11 個 IRGs 相對表達量及其風險值評分與結腸癌臨床病理分期的關系（例）
2.5 IRGs 風險值評分與結腸癌患者 TIICs 相關性分析結果
本研究分析了 TCGA 數據庫樣本中 TIICs 與 IRGs 基因模型風險值評分之間的關系，探討基于 IRGs 的預后標志物與TIME之間的關系。結果顯示：B 細胞、CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞與 IRGs 風險值評分的相關性系數均大于 0，IRGs 基因模型的評分越高，上述 5 種免疫細胞的浸潤密度越高（P<0.05）；但 IRGs 基因模型的評分與中細粒細胞的浸潤密度無相關性（P>0.05）。具體見圖3。
圖3
示 IRGs 基因模型風險值評分與結腸癌患者 TIICs 的相關性分析結果
a：B 細胞；b：CD4+ T 細胞；c：CD8+ T 細胞；d：樹突狀細胞；e：巨噬細胞；f：中細粒細胞
3 討論
眾所周知，免疫微環境在腫瘤的發生發展過程中具有重要作用[9]，但這些見解并未在常規臨床實踐中發揮重大作用。近年來，在一些腫瘤中建立了 IRGs 風險標志物，如腎乳頭狀細胞癌[10]、肺腺癌[11]、腎透明細胞癌[12]和膀胱癌[13]。本研究旨在構建 IRGs 風險標志物，以預測結腸癌患者的臨床預后。
3.1 基因模型中各種基因在腫瘤中的作用
本研究利用單因素 Cox比例風險回歸分析得到 19 個與結腸癌患者 OS 相關的 IRGs；再通過多因素 Cox 比例風險回歸分析發現這 19 個 IRGs 中有 11 個 IRGs 具有預測能力，這 11 種 IRGs 中的部分基因在各類腫瘤中已有報道，其中也有部分在結直腸癌中被報道。研究表明 ESM1 在乳腺癌[14]和胃癌[15]中存在差異表達。Kim 等[16]證實 ESM1 在結腸癌中高表達，他們認為 ESM1 是疾病復發和預后不佳的獨立預測因素。ESM1 通過激活 NF-κB 調控結直腸癌細胞的生長和轉移過程[17]。CXCL5 是一種趨化因子，與 G 蛋白偶聯受體趨化因子受體 2（CXCR2）結合，募集中性粒細胞，促進血管生成，重塑結締組織，在腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲中發揮作用[18]。研究[19]表明，CXCL5 在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、非小細胞肺癌等不同類型的惡性腫瘤中均呈高表達。此外，CXCL5 的過表達與腫瘤患者的生存、復發和轉移密切相關[20-21]。結直腸癌轉移組織中 CXCL5 的表達明顯高于癌旁組織[22-23]。Novillo 等[24]發現，CXCL5 的表達越高，結直腸癌患者的無進展生存期越短。有研究[25]表明，在結直腸癌組織中 STC2 明顯高表達，且與淋巴結轉移、脈管侵犯、浸潤深度、腫瘤大小、AJCC 分期和總體存活率低有關。Yang 等[26]發現，CCL28 通過胞外信號調節激酶/促分裂原活化的蛋白激酶（ERK/MAPK）通路介導的抗凋亡和轉移信號通路促進乳腺癌的生長和轉移。結腸腫瘤中的 CCL28 水平明顯高于直腸腫瘤患者[27]，這些差異可能表明，在結腸癌和直腸癌的發病過程中可能存在不同的機制和信號通路，從而差異促進 CCL28 的表達和分泌。目前對 CCL28 在結直腸癌患者組織中的表達水平和血漿濃度是否具有顯著的臨床相關性還需要進一步研究[27]。目前 SLC10A2 基因在結腸癌中的作用存在爭議，本研究結果表明，高風險組中 SLC10A2 高表達且臨床分期晚，是一種高風險基因。同時 Miao 等[28]認為，SLC10A2 的高表達顯著增加了患結腸癌的風險；而 Raufman 等[29]發現，SLC10A2 基因缺失小鼠糞便中內源性膽汁酸明顯升高并促進結腸癌的發生，但仍需進一步明確該基因在結腸癌中的具體作用機制。 Li 等[30]證實 IGHG1 促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，但是目前尚未有其在結腸癌中作用的研究。目前僅有關于 UCN-01 通過削弱 DNA 損傷反應增強伊立替康對結直腸癌干細胞的細胞毒作用[31]，無相關其在結直腸癌中作用機制的研究。尚無 OXTR、CHGA、GRP 和 IGKV1D-42 在結直腸癌中的相關報道，因此需要我們進一步去探討上述基因在結腸癌患者中的作用。
3.2 免疫細胞在腫瘤中的浸潤密度與結腸癌的關系
有證據表明，TIICs 與結腸癌的發生發展密切相關[32]。TIICs 參與構成TIME，調控腫瘤的生長，并影響患者的生存及抗腫瘤治療的療效。在本研究中，B 細胞、CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞與 IRGs 風險值評分的相關性最高。風險評分越高，免疫細胞浸潤密度越高。TIICs 的類型和密度不僅對患者的生存有預測價值，而且影響腫瘤對治療的反應，因此作為惡性腫瘤的臨床生物標志物具有巨大的潛力[33]。Hsu 等[34]認為，腫瘤相關樹突狀細胞的存在對結腸癌的預后有負面影響。此外，腫瘤相關巨噬細胞可抑制抗腫瘤免疫，促進腫瘤進展，與結直腸癌患者的預后呈負相關[35]。本研究中，IRGs 模型的風險值評分與中性粒細胞之間沒有明顯的相關性，這可能是由于亞組樣本數量有限所致。因此，需要更大樣本的研究來進一步驗證。
為驗證 IRGs 風險標志物模型對結腸癌預后預測的準確性，本研究根據篩選的 11 個 IRGs 的中位風險值（0.896）將結腸癌患者分為了高和低風險組，結果發現高風險組的 OS 差于低風險組，且時間依賴的 ROC 的AUC 為 0.754，提示 IRGs 風險模型可準確預測結腸癌患者的預后。本研究仍存在有局限性。首先，雖然 11 個 IRGs 在結腸癌中顯示出良好的預測能力，但該結果未在其他數據庫中進一步驗證。此外，其具體機制仍不明確，需進一步研究。其次，該研究是基于對公共數據庫的回顧性研究，尚需大樣本多區域的前瞻性研究。此外，還需進一步的體內和體外基礎實驗，來進一步研究這 11 個 IRGs 引起的異常免疫通路的復雜機制。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者均無利益沖突。
作者貢獻聲明：本文由通信作者（付濤）指導，第一作者（任俊）撰寫，其他作者（馮娟、宋偉、吳敬和金田力）負責數據的分析及整理。
結腸癌是男性中第 3 常見的腫瘤，在全球女性腫瘤中排名第 2[1]。傳統上，TNM 分期系統是評估疾病嚴重程度和預測結腸癌預后的有效工具[2]。然而，同一 TNM 分期的腫瘤患者常存在差異性預后[3]。因此，我們需要找到新的評價指標，以提高對結腸癌預后的預測能力。腫瘤免疫微環境（tumor immune microenvironment，TIME）通常與腫瘤患者的臨床結局有關，并已被用于評估腫瘤的預后[1]。研究[4]表明，TIME 與結腸癌的發生和發展關系密切。本研究通過分析免疫相關基因（immune related genes，IRGs）與結腸癌臨床病理特征之間的關系，期望構建能有效預測結腸癌預后的 IRGs 風險標志物。
1 資料與方法
1.1 數據來源
從癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫（
1.2 差異表達基因（DEGs）分析
所有的統計分析均使用 R 軟件（3.6.1 版）和 GraphPad7 軟件。使用“limma” 軟件包對納入患者的全基因表達量進行分析處理以篩選 DEGs，閾值設定為 |logFC| >2，P<0.05；使用“pheatmap” 軟件包進行熱圖分析；使用“beeswarm” 軟件包進行臨床病理特征相關性分析。檢驗水準 α=0.05。
1.3 IRGs 風險標志物的構建
采用單因素和多因素 Cox 比例風險回歸分析篩選影響結腸癌患者預后的相關基因，建立免疫基因標識。將單因素 Cox比例風險回歸分析結果中 P<0.05 的基因作為下一步的 Cox 比例風險回歸分析的候選基因。基因的風險值按基因相對表達水平乘以風險系數計算，每例患者的所有基因的風險值=（mRNA1 的風險系數×mRNA1 相對表達水平）+（mRNA2 的風險系數×mRNA2 相對表達水平）+……+（mRNAn 的風險系數×mRNAn 相對表達水平）。根據風險值的中位值，將結腸癌患者分為高風險組和低風險組。通過乘積極限法和時序檢驗比較和分析總生存時間（OS）的差異，診斷及預后預測模型的敏感度和特異度分別采用時間依賴的 ROC 曲線進行分析[6]和 ROC 曲線下面積（AUC）進行量化[7]。
1.4 統計學方法
所有統計分析由 SPSS 23.0 軟件完成。采用 R 軟件中的“survivalROC”軟件包計算出AUC，用以評估 IRGs 風險標志物的預測性能[8]。采用單因素和多因素 Cox 比例風險回歸分析以評估 IRGs 風險標志物的風險值是否是 OS 的獨立預后因素。采用卡方檢驗評價 IRGs 與結腸癌臨床病理特征及腫瘤浸潤性免疫細胞（TIICs）的關系。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 DEGs 分析結果及結腸癌患者的臨床病理資料
根據區分標準（P<0.05，|logFC| >2），在 TCGA 數據集中的結腸癌和正常結腸組織中共鑒定出 2 424 個 DEGs，包括 1 753 個上調基因和 671 個下調基因。結腸癌和正常結腸組織中 DEGs 的熱圖見圖1a，452 例結腸癌患者的臨床病理資料見表1。
圖1
示本研究數據庫資料分析結果
a：示 TCGA 數據中結腸癌和正常結腸組織中 DEGs 的熱圖，N 代表正常結腸組織，T 代表結腸癌組織；b、c：示 ImmPort 數據庫中差異表達的 IRGs 熱圖（b）和火山圖（c），圖中紅點代表上調基因，綠點代表下調基因，FDR 是錯誤發現率；d：示基于 IRGs 風險模型的分組分配；e：示高風險組和低風險組的生存狀態；f：高風險組和低風險組患者的生存曲線；g：示時間依賴的 ROC 曲線
表1
452 例結腸癌患者的臨床??病理資料
2.2 IRGs 風險標志物的構建
從 ImmPort 數據庫中下載了 IRGs 的免疫學數據庫和分析門戶（ImmPort），總共有 2 498 個 IRGs, 將其與來自 TCGA 數據庫的數據集取交集，在結腸癌和正常結腸組織中共識別出 206 個差異表達的 IRGs，其中 98 個上調基因，108 個下調基因。圖1b 和 1c 顯示了結腸癌和正常結腸組織中差異表達的 IRGs 的火山圖和熱圖。為了鑒別出與 OS 相關的 IRGs，將 206 個差異表達的 IRGs 進行了單因素 Cox比例風險回歸分析，其結果顯示有 19 個 IRGs 與 OS 相關（P<0.05），見表2。再通過多因素 Cox 比例風險回歸分析確定了與 OS 相關的 11 個 IRGs（表3），包括溶質載體家族 10 成員 2（SLC10A2）、C-X-C 基序趨化因子配體 5（CXCL5）、C-C 基序趨化因子配體（CCL28）、免疫球蛋白 kappa 變量 1D-42（IGKV1D-42）、嗜鉻粒蛋白 A（CHGA）、內皮細胞特異性分子 1（ESM1）、胃泌激素釋放肽（GRP）、斯鈣素 2 抗體（STC2）、尿皮質素（UCN）、催產素受體（OXTR）和免疫球蛋白重常數 γ 1（IGHG1），以此來構建 IRGs 風險標志物模型。其中 CCL28 和 IGHG1 基因雖然P>0.05，但考慮這 2 個基因可能與其他基因共同存在而發揮影響預后的作用，故也納入了 IRGs 風險標志物模型的構建。根據上面 1.3 項中的公式計算風險值，風險值的中位數為 0.896；452 例結腸癌患者中，將生存信息和表達量數據合并后，最終有 414 例患者納入分析。根據中位風險值，414 例患者中有 207 例被納入高風險組，207 例被納入低風險組。圖1d 和 1e 顯示了高、低風險組的風險值分布和患者的生存狀態，圖1f 為高風險組和低風險組 2 組患者的生存曲線，其結果顯示高風險組結腸癌患者的總生存情況差于低風險組（P<0.001）；圖1g 為時間依賴的 ROC，其AUC 為 0.754，提示 IRGs 風險標志物對結腸癌患者預后具有較好的預測能力。
表2
單因素 Cox 比例風險回歸分析結果所示的與 OS 相關的結腸癌組織中差異表達的IRGs
表3
多因素 Cox 比例風險回歸分析結果所示的與 OS 相關的結腸癌組織中差異表達的 IRGs
2.3 IRGs 風險標志物以及臨床病理特征與結腸癌患者 OS 的相關性分析結果
IRGs 基因模型的風險值以及結腸癌臨床病理特征與結腸癌患者 OS 關系的單因素 Cox 比例風險回歸分析結果（圖2a）顯示：IRGs 基因模型的風險值評分以及患者的年齡、臨床分期、T 分期、N 分期、M 分期與結腸癌患者的 OS 相關（P<0.05）；多因素 Cox 比例風險回歸分析結果（圖2b）顯示：IRGs 基因模型的風險值評分以及患者年齡和 T 分期與結腸癌患者的 OS 相關（P<0.05）。
圖2
示 IRGs 風險標志物以及臨床病理特征與結腸癌患者 OS 相關性的單因素（a）及多因素（b）分析結果的森林圖
2.4 11 個 IRGs 及其風險值評分與結腸癌臨床病理分期的關系
在本研究納入分析的 414 例患者中，將生存信息和表達量數據以及患者臨床病理特征數據合并后最終納入了 341 例患者進行分析。11 個 IRGs 及其風險值評分與結腸癌臨床病理分期（T、N、M 及臨床分期）的關系的分析結果見表4。由表4 可見：ESM1 高表達患者的 T 分期晚（P<0.05）；GRP 和 OXTR 高表達患者的 T、N、M 以及臨床分期晚（P<0.05）；IGHG1 低表達、 CXCL5 高表達患者的 M 分期晚（P<0.05）；SLC10A2 高表達患者的臨床分期晚（P<0.05）； IRGs 模型的風險值評分高，提示結腸癌患者的 T 、N、M 及臨床分期均晚（P<0.05）。
表4
11 個 IRGs 相對表達量及其風險值評分與結腸癌臨床病理分期的關系（例）
2.5 IRGs 風險值評分與結腸癌患者 TIICs 相關性分析結果
本研究分析了 TCGA 數據庫樣本中 TIICs 與 IRGs 基因模型風險值評分之間的關系，探討基于 IRGs 的預后標志物與TIME之間的關系。結果顯示：B 細胞、CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞與 IRGs 風險值評分的相關性系數均大于 0，IRGs 基因模型的評分越高，上述 5 種免疫細胞的浸潤密度越高（P<0.05）；但 IRGs 基因模型的評分與中細粒細胞的浸潤密度無相關性（P>0.05）。具體見圖3。
圖3
示 IRGs 基因模型風險值評分與結腸癌患者 TIICs 的相關性分析結果
a：B 細胞；b：CD4+ T 細胞；c：CD8+ T 細胞；d：樹突狀細胞；e：巨噬細胞；f：中細粒細胞
3 討論
眾所周知，免疫微環境在腫瘤的發生發展過程中具有重要作用[9]，但這些見解并未在常規臨床實踐中發揮重大作用。近年來，在一些腫瘤中建立了 IRGs 風險標志物，如腎乳頭狀細胞癌[10]、肺腺癌[11]、腎透明細胞癌[12]和膀胱癌[13]。本研究旨在構建 IRGs 風險標志物，以預測結腸癌患者的臨床預后。
3.1 基因模型中各種基因在腫瘤中的作用
本研究利用單因素 Cox比例風險回歸分析得到 19 個與結腸癌患者 OS 相關的 IRGs；再通過多因素 Cox 比例風險回歸分析發現這 19 個 IRGs 中有 11 個 IRGs 具有預測能力，這 11 種 IRGs 中的部分基因在各類腫瘤中已有報道，其中也有部分在結直腸癌中被報道。研究表明 ESM1 在乳腺癌[14]和胃癌[15]中存在差異表達。Kim 等[16]證實 ESM1 在結腸癌中高表達，他們認為 ESM1 是疾病復發和預后不佳的獨立預測因素。ESM1 通過激活 NF-κB 調控結直腸癌細胞的生長和轉移過程[17]。CXCL5 是一種趨化因子，與 G 蛋白偶聯受體趨化因子受體 2（CXCR2）結合，募集中性粒細胞，促進血管生成，重塑結締組織，在腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲中發揮作用[18]。研究[19]表明，CXCL5 在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、非小細胞肺癌等不同類型的惡性腫瘤中均呈高表達。此外，CXCL5 的過表達與腫瘤患者的生存、復發和轉移密切相關[20-21]。結直腸癌轉移組織中 CXCL5 的表達明顯高于癌旁組織[22-23]。Novillo 等[24]發現，CXCL5 的表達越高，結直腸癌患者的無進展生存期越短。有研究[25]表明，在結直腸癌組織中 STC2 明顯高表達，且與淋巴結轉移、脈管侵犯、浸潤深度、腫瘤大小、AJCC 分期和總體存活率低有關。Yang 等[26]發現，CCL28 通過胞外信號調節激酶/促分裂原活化的蛋白激酶（ERK/MAPK）通路介導的抗凋亡和轉移信號通路促進乳腺癌的生長和轉移。結腸腫瘤中的 CCL28 水平明顯高于直腸腫瘤患者[27]，這些差異可能表明，在結腸癌和直腸癌的發病過程中可能存在不同的機制和信號通路，從而差異促進 CCL28 的表達和分泌。目前對 CCL28 在結直腸癌患者組織中的表達水平和血漿濃度是否具有顯著的臨床相關性還需要進一步研究[27]。目前 SLC10A2 基因在結腸癌中的作用存在爭議，本研究結果表明，高風險組中 SLC10A2 高表達且臨床分期晚，是一種高風險基因。同時 Miao 等[28]認為，SLC10A2 的高表達顯著增加了患結腸癌的風險；而 Raufman 等[29]發現，SLC10A2 基因缺失小鼠糞便中內源性膽汁酸明顯升高并促進結腸癌的發生，但仍需進一步明確該基因在結腸癌中的具體作用機制。 Li 等[30]證實 IGHG1 促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，但是目前尚未有其在結腸癌中作用的研究。目前僅有關于 UCN-01 通過削弱 DNA 損傷反應增強伊立替康對結直腸癌干細胞的細胞毒作用[31]，無相關其在結直腸癌中作用機制的研究。尚無 OXTR、CHGA、GRP 和 IGKV1D-42 在結直腸癌中的相關報道，因此需要我們進一步去探討上述基因在結腸癌患者中的作用。
3.2 免疫細胞在腫瘤中的浸潤密度與結腸癌的關系
有證據表明，TIICs 與結腸癌的發生發展密切相關[32]。TIICs 參與構成TIME，調控腫瘤的生長，并影響患者的生存及抗腫瘤治療的療效。在本研究中，B 細胞、CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞與 IRGs 風險值評分的相關性最高。風險評分越高，免疫細胞浸潤密度越高。TIICs 的類型和密度不僅對患者的生存有預測價值，而且影響腫瘤對治療的反應，因此作為惡性腫瘤的臨床生物標志物具有巨大的潛力[33]。Hsu 等[34]認為，腫瘤相關樹突狀細胞的存在對結腸癌的預后有負面影響。此外，腫瘤相關巨噬細胞可抑制抗腫瘤免疫，促進腫瘤進展，與結直腸癌患者的預后呈負相關[35]。本研究中，IRGs 模型的風險值評分與中性粒細胞之間沒有明顯的相關性，這可能是由于亞組樣本數量有限所致。因此，需要更大樣本的研究來進一步驗證。
為驗證 IRGs 風險標志物模型對結腸癌預后預測的準確性，本研究根據篩選的 11 個 IRGs 的中位風險值（0.896）將結腸癌患者分為了高和低風險組，結果發現高風險組的 OS 差于低風險組，且時間依賴的 ROC 的AUC 為 0.754，提示 IRGs 風險模型可準確預測結腸癌患者的預后。本研究仍存在有局限性。首先，雖然 11 個 IRGs 在結腸癌中顯示出良好的預測能力，但該結果未在其他數據庫中進一步驗證。此外，其具體機制仍不明確，需進一步研究。其次，該研究是基于對公共數據庫的回顧性研究，尚需大樣本多區域的前瞻性研究。此外，還需進一步的體內和體外基礎實驗，來進一步研究這 11 個 IRGs 引起的異常免疫通路的復雜機制。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者均無利益沖突。
作者貢獻聲明：本文由通信作者（付濤）指導，第一作者（任俊）撰寫，其他作者（馮娟、宋偉、吳敬和金田力）負責數據的分析及整理。
