引用本文： 徐源通, 胡宗強, 陳剛, 江杰, 陳家川. 乙型肝炎病毒基因型與肝細胞癌發生關系的研究現狀. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(1): 107-111. doi: 10.7507/1007-9424.202103013 復制
乙型肝炎病毒（HBV）是一類主要侵犯肝臟并引起病毒性肝炎的病毒。HBV DNA 的結構特殊，是部分雙鏈環狀 DNA，2 條鏈的長度不一致，長鏈為負鏈，有固定的長度，約含 3 200 個核苷酸；短鏈為正鏈，長度為負鏈的 50%～100% 不等。HBV 的負鏈 DNA 含有 4 個開放讀碼框（open reading frame，ORF），分別稱為 S、C、P 和 X 區。各 ORF 相互重疊，使基因組的利用率得以提高。X 區編碼的 HBV X 抗原（HBxAg）是一種多功能蛋白質，具有廣泛的反式激活作用，可反式激活細胞內的原癌基因、HBV 基因及多種信號通路，并具有與 p53 基因相互作用、影響細胞周期等活性，因此，HBxAg 與肝細胞癌的發生發展有密切的關系。目前根據 HBV 基因組的差異，可將 HBV 分為至少 A～J 10 個基因型，各個基因型又可分為不同亞型。不同地區流行的基因型又有所不同，A 型主要見于美國和西歐，D 型主要見于中東、北非和南歐，E 型見于非洲，我國及亞洲地區流行的主要是 B 型和 C 型。HBV 基因型特異性發病機制可能導致世界范圍內慢性乙型肝炎患者的不同臨床結局。例如，HBV 基因型 C 和 D 感染的患者自發 HBeAg 血清轉化率較低。此外，與基因型 A 和 B 相比，HBV 基因型 C 和 D 具有更高的核心啟動子和 pre-S 突變頻率。基因型 C 和 D 也比基因型 A 和 B 具有更高的肝硬化和肝細胞癌發生的終生風險。筆者現將系統論述 HBxAg 與肝細胞癌發生的關系以及與基因型所存在的關系。
1 X 蛋白與 HBV 病毒復制
有研究[1-2]表明，乙型肝炎 X 蛋白在病毒的復制中有著重要作用。HBV 生命周期中有兩個環節對病毒的復制和慢性感染的發展至關重要：一個是在感染的細胞核內建立病毒小染色體，即共價閉合環狀（ccc）DNA；另一個是調節 HBV 的 X 蛋白表達。其中的機制在近些年的研究中逐漸清晰。cccDNA 代表了病毒的持久性[3]，消除 cccDNA 將成為治愈慢性乙型肝炎的核心[4]。染色質結構維持（structural maintenance of chromosome， Smc）5/6復合物是宿主細胞的一種保護因子，它可以識別 HBV 基因組，從而發揮保護作用。從肝細胞癌中分離出的大多數 HBV 調節蛋白 X（HBx）變異保留了支持 HBV-cccDNA 轉錄和降解 Smc 5/6 的能力[5]，從而促進了病毒的復制甚至是肝細胞癌的發生。HBx 可與宿主 DNA 損傷結合蛋白 1（DDB1）結合，影響 Smc 5/6 的結構維持，從而激活 cccDNA 的病毒轉錄[6-8]。在有關研究[9]中發現，4 個氨基酸殘基為 55–60 和 121–126 的 HBx 突變體的 HBx-cccDNA 關聯度低于野生型（平均輸入量: 0.02%～0.64%，野生型為 3.08%）。HBx 氨基酸殘基 55–60 和 121–126 通過阻礙與 cccDNA 的相互作用和改變組蛋白修飾酶對 cccDNA 的補充，可能在 HBV 轉錄調控中起重要作用。此外，miR-146a-5p 作為 miR-146a 家族中主要成員之一，根據其作用靶基因的性質常被標記為腫瘤促進因子或腫瘤抑制因子，并在惡性腫瘤的發生發展中發揮重要作用。人們在研究 miR-146a-5p 介導自噬和 HBV 復制的機制時發現：HBV 核心蛋白（HBc）和 HBx 通過核因子 kappa B 途徑影響 miR-146a-5p 的表達，從而證明 miR-146a-5p 通過靶向于 X 連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）介導的鼠雙微基因 2（MDM2）/p53 軸調節自噬誘導的 HBV 復制而介導正反饋環[10]。HBV 的 T1719G 突變是一種常見的變異，與肝病的進展和惡性程度有關。有研究者[11]將攜帶 HBV1.2x 質粒的野生型和 T1719G 突變分別轉染 Huh7 和 HepG2 細胞，同時將 HBx 或 HBx-mut（T1719G）質粒共轉染，觀察 HBx 對病毒復制的影響，結果發現，與野生型相比，T1719G 突變降低了增強子Ⅱ（Enh-Ⅱ）的活性，降低了肝細胞核因子 3β（HNF3beta）與 Enh-Ⅱ的結合能力，而由 T1719G 突變引起的 HNF3beta 與 Enh-Ⅱ的結合能力的下降可以被 HBx 蛋白所挽救，結果提示，T1719G 突變可能通過改變 HBx 蛋白和 Enh-Ⅱ活性從而降低 HBV 的復制能力。MDM2 是 p53 的下游調節基因之一，p53 激活 MDM2 轉錄，MDM2 反過來抑制 p53 活性，二者形成自動調節反饋環，以保持正常情況下 p53 處于低水平狀態。在相關研究[12]中還發現，HBx 還可通過抑制 MDM2 介導的蛋白酶體依賴性降解而誘導 DExH-box RNA 螺旋酶 9（DHX9）表達上調，DHX9 可通過其螺旋酶活性和核定位與 98 KDA 核孔蛋白（Nup98）相互作用。Nup98 是相對分子質量為 98×103的核孔素蛋白，主要參與核內外 RNA 和蛋白質的轉運。
在人們發現 X 蛋白與 HBV 復制的關系后，便開始尋找可抑制 X 蛋白表達的藥物。人們從香豆素的微粒體中分離出七葉皂苷，對其研究后發現，在人肝細胞癌 2.2.15 細胞株（HepG2.2.15）中，七葉皂苷能抑制 HBV 抗原和 HBV DNA 的表達，且七葉皂苷對 HBV 的 HBx 蛋白表達的抑制作用呈劑量依賴性[13]。此外，經美國食品藥品監督管理局（FDA）批準用于治療原生動物腸炎的噻唑類抗感染藥物硝唑尼特（nitazoxanide，NTZ）也被發現能有效抑制 HBx 與 DDB1 相互作用。NTZ 能顯著恢復 HBV 微環系統和自然感染 HBV 的人原代肝細胞中的 Smc5 蛋白水平，抑制病毒轉錄和病毒蛋白生成[9]。
綜上所述，HBx 可以通過多種途徑影響 HBV 的復制。HBx 影響cccDNA 的建立，降解宿主的保護因子，如復合體 Smc 5/6；HBV 的多種突變也同樣證明了 HBx 蛋白影響著 HBV 的復制能力，如氨基酸殘基為 55–60 和 121–126 的 HBx 突變體、T1719G 突變體等；HBx 還可以通過影響轉錄調控、蛋白質轉運、生成等來促進病毒的轉錄和病毒蛋白的生成。人們可利用 HBx 與 HBV 復制的關系，從中尋找治療靶點和治療藥物。
2 X 蛋白與肝細胞癌
HBV 的慢性感染與肝細胞癌發病率的增加有關。X 蛋白可干擾多種細胞活動，除病毒復制外，還有基因表達、組蛋白修飾、基因組的穩定性等。近年的研究[14]證實，HBx 是 7 個 HBV 編碼的蛋白中唯一對抗宿主清除的病毒因子，HBx 的抗逆轉錄作用可致肝細胞的同源重組缺陷和基因組的不穩定，并且有助于宿主肝細胞癌的發生。除此之外，蛋白酶體激活劑 28γ（PA28γ）在肝細胞癌中呈高表達。有研究[15]發現，HBx 含有 Ser-101 而不是 Pro-101 的自然變異，增加了線粒體中的活性氧物種水平，激活了核內共濟失調毛細血管擴張突變/檢查點激酶 2 通路，導致 p53 在 Ser-15 和 Ser-20 處磷酸化并隨后上調其蛋白水平。因此，含有 Ser-101 的 HBx 變異體誘導人肝癌細胞 PA28γ 表達的 p53 依賴性激活。BRG1 基因相關因子 155(BRG1-associated factor 155，BAF155) 已經被證明[16]可以通過減弱其蛋白酶體降解來穩定切換為交配型/蔗糖非發酵型（switch in mating type/sucrose non fermentation，SWI/SNF）染色質重塑復合物的其他成員。進一步研究[17]還證明了 BAF155 的過表達可增強 HBx 的轉錄激活功能，激活原癌基因的表達，抑制肝癌細胞的克隆性。
HBx 可影響多種信號途徑，從而在肝細胞癌發生的過程中發揮重要作用。樁蛋白（paxillin，PXN）磷酸化通過激活 JNK 信號通路促進細胞遷移，但 PXN 過表達與肝細胞癌患者預后不良無關。但進一步研究[18]發現，HBx 在絲氨酸 178（pS178）-PXN 處磷酸化 PXN，可能通過 HBx 介導的 JNK 激活促進肝癌細胞的侵襲性。免疫組化分析顯示腫瘤組織中 pS178-PXN 與 HBx 表達水平呈正相關，提示 HBx 介導的 JNK 激活對 PXN 在pS178 處的磷酸化可能在 HBV 感染的肝細胞癌的侵襲性和預后不良中起重要作用[18]。在 cAMP 信號通路中，皮層肌動蛋白（cortatin，CTTN）作為一種新的 HBx 相互作用蛋白參與其中。HBx 可通過上調 cAMP 反應元件結合蛋白（CREB1）及其下游靶點，如細胞周期蛋白 D1 和組織基質金屬蛋白（MMP-9）的表達，HBx 和 CTTN 相互作用通過抑制細胞周期阻滯維持對細胞增殖和遷移的促進作用，提示 HBx 通過與 CTTN 相互作用和調節 CTTN 和 CREB1 的表達，促進肝癌細胞的遷移和增殖[19]。長鏈非編碼 RNA（lncRNAs）可調控肝細胞癌的生長和轉移。FEZ 家族鋅指 1 反義 RNA1（lncRNA F11-AS1）通過與 miR-211-5p 結合而上調核受體亞家族 1第一組成員 3（NR1I3）的表達，lncRNA F11-AS1 的高表達降低了 HepG2.2.15 細胞的增殖、遷移和侵襲，但誘導了 HepG2.2.15 細胞凋亡，miR-211-5p 的高表達可抑制其凋亡，lncRNA F11-AS1 過表達或 miR-211-5p 抑制均可降低 HepG2.2.15 細胞的體內生長和轉移能力，因此 lncRNA F11-AS1 的低表達與 HBV 相關性肝細胞癌患者預后不良相關，但其下調是由 HBx 蛋白引起的[20]，其間接說明了 HBx 與肝細胞癌的關系。WD 重復結構域 5 蛋白（WDR5）是組蛋白 H3-賴氨酸 4-甲基轉移酶復合物的核心亞單位，它可以催化組蛋白 H3-賴氨酸 4-三甲基化（H3K4me3）修飾的產生，在 HBV 相關肝細胞癌中高表達，而 HBx 又可以通過 WDR5 發揮其促腫瘤作用，因此 HBx-WDR5-H3K4me3 軸也作為 HBV 發病的潛在治療靶點[21]。中心體 P4.1 相關蛋白（CPAP）是 HBV 編碼的非結構蛋白 HBx 介導的活化 B 細胞核因子 kappa 輕鏈增強子（NF-kappaB）活化所必需的。CPAP 與 HBx 的相互作用通過增強 NF-kappaB 的活化、炎癥細胞因子的產生和腫瘤的發生，為肝細胞癌的發生發展提供了微環境[22]。除此之外，有關研究[23]還證明了腫瘤抑制因子 miR-18b 對核仁紡錘體相關蛋白 1（NUSAP1）mRNA 的靶向作用是受宿主病毒相互作用中 HBx 調控啟動子甲基化的控制，從而導致肝細胞癌的發生。
綜上所述，HBx 與肝細胞癌的關系包括：① HBx 的抗逆轉錄作用可致肝細胞的同源重組缺陷和基因組的不穩定，并且有助于宿主肝細胞癌的發生。② HBV 含有 Ser-101 突變，而含有 Ser-101 的 HBx 變異體可誘導人肝癌細胞 PA28γ 表達的 p53 依賴性激活。③ HBx 可影響多種信號途徑，從而在肝細胞癌的發生過程中發揮重要作用，如 HBx 介導的 JNK 激活對 PXN 在絲氨酸 178 處的磷酸化可能在 HBV 感染的肝細胞癌的侵襲性和預后不良中起重要作用；lncRNA F11-AS1 的低表達與 HBV 相關性肝細胞癌患者的預后不良相關，但其下調是由 HBx 蛋白引起的[20]，這也間接說明了 HBx 與肝細胞癌的關系。④ HBx 可通過 WDR5 發揮其促腫瘤作用；CPAP 與 HBx 的相互作用通過增強 NF-kappaB 的活化、炎癥細胞因子的產生和腫瘤的發生，為肝細胞癌的發生發展提供了微環境。上述結果均說明了 HBx 和肝細胞癌的發生、發展、遷徙、轉移之間的關系。
3 肝細胞癌與 HBV 的基因型
HBV 分為 10 個基因型和許多亞基因型（sgt）。HBV 不同基因型或亞型的肝細胞癌，其預后也有所差異。其中拉丁美洲本土的 sgtF1b 和 sgtF4 與臨床和病毒學特征的差異有關。有研究[24]分析了 X 基因和編碼的 X 蛋白在 sgtF1b 和 sgtF4 復制中的作用：轉染 HBx 缺陷基因后，sgtF1b 和 sgtF4 突變體的復制能力存在顯著差異，HBx 沉默使 sgtF1b X（X基因沉默）的轉錄和復制比野生型增加 2.5 倍以上，而 sgtF4 X（X基因沉默）的轉錄和復制比野生型減少 3 倍以上。HBV 基礎核心啟動子（BCP）雙突變 ［T（1762）A（1764）］ 是肝細胞癌發生中 B、C 基因型的強混雜因素，HBV 的 C 基因型對肝細胞癌發生發展的影響在野生型和 BCP 雙突變型之間存在差異，這也提示并非所有感染 C 基因型 HBV 的人都有肝細胞癌發生的危險[25]。通過建立統計學模型[26]研究了 1983–2012 年間確診的慢性 HBV 感染者后，發現 HBV 基因型與肝細胞癌危險性獨立相關，A、C 和 F 基因型的人比 B 或 D 基因型的人發生肝細胞癌的風險更高。大約有 75% 的肝細胞癌發生在亞洲，這也使得亞洲在分析 HBV 基因型與肝細胞癌的發生關系方面具有獨特的優勢。有研究[27]在調查了柬埔寨暹粒省 35 例乙肝表面抗原（HBsAg）陽性居民中 26 個全長 HBV 基因組的特征后發現：① C1 基因型占優勢（92.3%，24/26），B2 和 B4 各 1 例；24 株柬埔寨 C1 菌株發生多重突變，其中 18 株（75.0%）A1762T/G1764A 雙突變，14 株（58.3%）C1653T 和（或）T1753V 和 A1762T/G1764A 聯合突變。② 在系統發育分析中，24 個分離株中有 16 個位于老撾、泰國和馬來西亞。③ GenBank 登記的 340 株 C1 菌株中，有 113 株（33.2%）存在聯合突變，其中 ASC、慢性肝炎和肝硬化/肝細胞癌分別為 16.5%、34.2% 和 95.2%（P<0.01）。④ 24 株柬埔寨 C1 菌株突變豐富，GenBank 的 340 株 C1 菌株的 C1 基因型突變為肝硬化/肝細胞癌的發生提供了很高的可能性。因此可以認為柬埔寨人感染基因 C1 型 HBV 有很高的肝細胞癌發生的可能性。亞洲地區主要流行 B 型和 C 型，這個規律也同樣適用于日本，但在對 295 例 HBsAg 陽性攜帶者中 241 例隨訪后發現，HBV 亞型從長遠來看與肝細胞癌的發生率無關[28-30]。這與之前的一些研究結果有所不同，因此有待進一步研究。
我國學者[31]也對其中的聯系進行了研究，通過對國內外 17 篇文獻、16 288 例患者、其中肝癌患者 3 613 例的 meta 分析發現，HBV C 基因型的患者較其他基因型的患者發生肝癌的風險更高。在印度 2018 年的相關研究[32]中，研究者收集了國內 3 所醫院 141 例 HBV 相關性肝癌患者，結果在 70 例 HBV-DNA陽性的肝細胞癌患者中，有 40 例（57.1%）檢測到基因型，D 基因型 20 例（50.0%），A 基因型 10 例（25.0%），C 基因型 10 例（25.0%），提示雖然印度 HBV 基因型主要是 D 型，但在肝細胞癌患者中檢測到 HBV 基因型 C 表明印度的病毒流行病學正在發生變化。除此之外，在關于阿拉斯加土著年輕人的研究[33]中，確定了感染 F1b 基因型在當地人群中阿拉斯加特異性核心突變與肝細胞癌發生之間的相關性。在基因型 F1b 慢性感染過程中，這些核心突變的積累將有助于阿拉斯加土著人生命早期的肝細胞癌的發展。在對尼日利亞人的相關研究[34-35]中分離出的 HBV E 型中發現了與疫苗逃逸、隱匿性感染和不良肝細胞癌預后相關的突變。
4 小結
HBx、肝細胞癌和 HBV 基因亞型之間的關系錯綜復雜，迄今為止的相關研究也都證明了其相關性，但其具體的關系有待進一步的探索。不同地區 HBV 的基因型有所差異，而不同的基因型又導致了疾病進展的不同，X 蛋白在疾病的進展中扮演了舉足輕重的角色。因此，探討 HBV 基因型、X 蛋白和肝細胞癌三者之間的關系的工作就變得尤為重要，通過進一步的研究對發現新的治療靶點和藥物，推動乙型肝炎、肝硬化和肝癌的診斷與治療，以及為患者提供更為個體化的干預手段具有重要的作用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們聲明彼此間沒有利益沖突。
作者貢獻聲明：徐源通負責文獻檢索、撰寫文章；陳剛、江杰和陳家川參與文獻檢索；胡宗強負責寫作指導和文章審校。
乙型肝炎病毒（HBV）是一類主要侵犯肝臟并引起病毒性肝炎的病毒。HBV DNA 的結構特殊，是部分雙鏈環狀 DNA，2 條鏈的長度不一致，長鏈為負鏈，有固定的長度，約含 3 200 個核苷酸；短鏈為正鏈，長度為負鏈的 50%～100% 不等。HBV 的負鏈 DNA 含有 4 個開放讀碼框（open reading frame，ORF），分別稱為 S、C、P 和 X 區。各 ORF 相互重疊，使基因組的利用率得以提高。X 區編碼的 HBV X 抗原（HBxAg）是一種多功能蛋白質，具有廣泛的反式激活作用，可反式激活細胞內的原癌基因、HBV 基因及多種信號通路，并具有與 p53 基因相互作用、影響細胞周期等活性，因此，HBxAg 與肝細胞癌的發生發展有密切的關系。目前根據 HBV 基因組的差異，可將 HBV 分為至少 A～J 10 個基因型，各個基因型又可分為不同亞型。不同地區流行的基因型又有所不同，A 型主要見于美國和西歐，D 型主要見于中東、北非和南歐，E 型見于非洲，我國及亞洲地區流行的主要是 B 型和 C 型。HBV 基因型特異性發病機制可能導致世界范圍內慢性乙型肝炎患者的不同臨床結局。例如，HBV 基因型 C 和 D 感染的患者自發 HBeAg 血清轉化率較低。此外，與基因型 A 和 B 相比，HBV 基因型 C 和 D 具有更高的核心啟動子和 pre-S 突變頻率。基因型 C 和 D 也比基因型 A 和 B 具有更高的肝硬化和肝細胞癌發生的終生風險。筆者現將系統論述 HBxAg 與肝細胞癌發生的關系以及與基因型所存在的關系。
1 X 蛋白與 HBV 病毒復制
有研究[1-2]表明，乙型肝炎 X 蛋白在病毒的復制中有著重要作用。HBV 生命周期中有兩個環節對病毒的復制和慢性感染的發展至關重要：一個是在感染的細胞核內建立病毒小染色體，即共價閉合環狀（ccc）DNA；另一個是調節 HBV 的 X 蛋白表達。其中的機制在近些年的研究中逐漸清晰。cccDNA 代表了病毒的持久性[3]，消除 cccDNA 將成為治愈慢性乙型肝炎的核心[4]。染色質結構維持（structural maintenance of chromosome， Smc）5/6復合物是宿主細胞的一種保護因子，它可以識別 HBV 基因組，從而發揮保護作用。從肝細胞癌中分離出的大多數 HBV 調節蛋白 X（HBx）變異保留了支持 HBV-cccDNA 轉錄和降解 Smc 5/6 的能力[5]，從而促進了病毒的復制甚至是肝細胞癌的發生。HBx 可與宿主 DNA 損傷結合蛋白 1（DDB1）結合，影響 Smc 5/6 的結構維持，從而激活 cccDNA 的病毒轉錄[6-8]。在有關研究[9]中發現，4 個氨基酸殘基為 55–60 和 121–126 的 HBx 突變體的 HBx-cccDNA 關聯度低于野生型（平均輸入量: 0.02%～0.64%，野生型為 3.08%）。HBx 氨基酸殘基 55–60 和 121–126 通過阻礙與 cccDNA 的相互作用和改變組蛋白修飾酶對 cccDNA 的補充，可能在 HBV 轉錄調控中起重要作用。此外，miR-146a-5p 作為 miR-146a 家族中主要成員之一，根據其作用靶基因的性質常被標記為腫瘤促進因子或腫瘤抑制因子，并在惡性腫瘤的發生發展中發揮重要作用。人們在研究 miR-146a-5p 介導自噬和 HBV 復制的機制時發現：HBV 核心蛋白（HBc）和 HBx 通過核因子 kappa B 途徑影響 miR-146a-5p 的表達，從而證明 miR-146a-5p 通過靶向于 X 連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）介導的鼠雙微基因 2（MDM2）/p53 軸調節自噬誘導的 HBV 復制而介導正反饋環[10]。HBV 的 T1719G 突變是一種常見的變異，與肝病的進展和惡性程度有關。有研究者[11]將攜帶 HBV1.2x 質粒的野生型和 T1719G 突變分別轉染 Huh7 和 HepG2 細胞，同時將 HBx 或 HBx-mut（T1719G）質粒共轉染，觀察 HBx 對病毒復制的影響，結果發現，與野生型相比，T1719G 突變降低了增強子Ⅱ（Enh-Ⅱ）的活性，降低了肝細胞核因子 3β（HNF3beta）與 Enh-Ⅱ的結合能力，而由 T1719G 突變引起的 HNF3beta 與 Enh-Ⅱ的結合能力的下降可以被 HBx 蛋白所挽救，結果提示，T1719G 突變可能通過改變 HBx 蛋白和 Enh-Ⅱ活性從而降低 HBV 的復制能力。MDM2 是 p53 的下游調節基因之一，p53 激活 MDM2 轉錄，MDM2 反過來抑制 p53 活性，二者形成自動調節反饋環，以保持正常情況下 p53 處于低水平狀態。在相關研究[12]中還發現，HBx 還可通過抑制 MDM2 介導的蛋白酶體依賴性降解而誘導 DExH-box RNA 螺旋酶 9（DHX9）表達上調，DHX9 可通過其螺旋酶活性和核定位與 98 KDA 核孔蛋白（Nup98）相互作用。Nup98 是相對分子質量為 98×103的核孔素蛋白，主要參與核內外 RNA 和蛋白質的轉運。
在人們發現 X 蛋白與 HBV 復制的關系后，便開始尋找可抑制 X 蛋白表達的藥物。人們從香豆素的微粒體中分離出七葉皂苷，對其研究后發現，在人肝細胞癌 2.2.15 細胞株（HepG2.2.15）中，七葉皂苷能抑制 HBV 抗原和 HBV DNA 的表達，且七葉皂苷對 HBV 的 HBx 蛋白表達的抑制作用呈劑量依賴性[13]。此外，經美國食品藥品監督管理局（FDA）批準用于治療原生動物腸炎的噻唑類抗感染藥物硝唑尼特（nitazoxanide，NTZ）也被發現能有效抑制 HBx 與 DDB1 相互作用。NTZ 能顯著恢復 HBV 微環系統和自然感染 HBV 的人原代肝細胞中的 Smc5 蛋白水平，抑制病毒轉錄和病毒蛋白生成[9]。
綜上所述，HBx 可以通過多種途徑影響 HBV 的復制。HBx 影響cccDNA 的建立，降解宿主的保護因子，如復合體 Smc 5/6；HBV 的多種突變也同樣證明了 HBx 蛋白影響著 HBV 的復制能力，如氨基酸殘基為 55–60 和 121–126 的 HBx 突變體、T1719G 突變體等；HBx 還可以通過影響轉錄調控、蛋白質轉運、生成等來促進病毒的轉錄和病毒蛋白的生成。人們可利用 HBx 與 HBV 復制的關系，從中尋找治療靶點和治療藥物。
2 X 蛋白與肝細胞癌
HBV 的慢性感染與肝細胞癌發病率的增加有關。X 蛋白可干擾多種細胞活動，除病毒復制外，還有基因表達、組蛋白修飾、基因組的穩定性等。近年的研究[14]證實，HBx 是 7 個 HBV 編碼的蛋白中唯一對抗宿主清除的病毒因子，HBx 的抗逆轉錄作用可致肝細胞的同源重組缺陷和基因組的不穩定，并且有助于宿主肝細胞癌的發生。除此之外，蛋白酶體激活劑 28γ（PA28γ）在肝細胞癌中呈高表達。有研究[15]發現，HBx 含有 Ser-101 而不是 Pro-101 的自然變異，增加了線粒體中的活性氧物種水平，激活了核內共濟失調毛細血管擴張突變/檢查點激酶 2 通路，導致 p53 在 Ser-15 和 Ser-20 處磷酸化并隨后上調其蛋白水平。因此，含有 Ser-101 的 HBx 變異體誘導人肝癌細胞 PA28γ 表達的 p53 依賴性激活。BRG1 基因相關因子 155(BRG1-associated factor 155，BAF155) 已經被證明[16]可以通過減弱其蛋白酶體降解來穩定切換為交配型/蔗糖非發酵型（switch in mating type/sucrose non fermentation，SWI/SNF）染色質重塑復合物的其他成員。進一步研究[17]還證明了 BAF155 的過表達可增強 HBx 的轉錄激活功能，激活原癌基因的表達，抑制肝癌細胞的克隆性。
HBx 可影響多種信號途徑，從而在肝細胞癌發生的過程中發揮重要作用。樁蛋白（paxillin，PXN）磷酸化通過激活 JNK 信號通路促進細胞遷移，但 PXN 過表達與肝細胞癌患者預后不良無關。但進一步研究[18]發現，HBx 在絲氨酸 178（pS178）-PXN 處磷酸化 PXN，可能通過 HBx 介導的 JNK 激活促進肝癌細胞的侵襲性。免疫組化分析顯示腫瘤組織中 pS178-PXN 與 HBx 表達水平呈正相關，提示 HBx 介導的 JNK 激活對 PXN 在pS178 處的磷酸化可能在 HBV 感染的肝細胞癌的侵襲性和預后不良中起重要作用[18]。在 cAMP 信號通路中，皮層肌動蛋白（cortatin，CTTN）作為一種新的 HBx 相互作用蛋白參與其中。HBx 可通過上調 cAMP 反應元件結合蛋白（CREB1）及其下游靶點，如細胞周期蛋白 D1 和組織基質金屬蛋白（MMP-9）的表達，HBx 和 CTTN 相互作用通過抑制細胞周期阻滯維持對細胞增殖和遷移的促進作用，提示 HBx 通過與 CTTN 相互作用和調節 CTTN 和 CREB1 的表達，促進肝癌細胞的遷移和增殖[19]。長鏈非編碼 RNA（lncRNAs）可調控肝細胞癌的生長和轉移。FEZ 家族鋅指 1 反義 RNA1（lncRNA F11-AS1）通過與 miR-211-5p 結合而上調核受體亞家族 1第一組成員 3（NR1I3）的表達，lncRNA F11-AS1 的高表達降低了 HepG2.2.15 細胞的增殖、遷移和侵襲，但誘導了 HepG2.2.15 細胞凋亡，miR-211-5p 的高表達可抑制其凋亡，lncRNA F11-AS1 過表達或 miR-211-5p 抑制均可降低 HepG2.2.15 細胞的體內生長和轉移能力，因此 lncRNA F11-AS1 的低表達與 HBV 相關性肝細胞癌患者預后不良相關，但其下調是由 HBx 蛋白引起的[20]，其間接說明了 HBx 與肝細胞癌的關系。WD 重復結構域 5 蛋白（WDR5）是組蛋白 H3-賴氨酸 4-甲基轉移酶復合物的核心亞單位，它可以催化組蛋白 H3-賴氨酸 4-三甲基化（H3K4me3）修飾的產生，在 HBV 相關肝細胞癌中高表達，而 HBx 又可以通過 WDR5 發揮其促腫瘤作用，因此 HBx-WDR5-H3K4me3 軸也作為 HBV 發病的潛在治療靶點[21]。中心體 P4.1 相關蛋白（CPAP）是 HBV 編碼的非結構蛋白 HBx 介導的活化 B 細胞核因子 kappa 輕鏈增強子（NF-kappaB）活化所必需的。CPAP 與 HBx 的相互作用通過增強 NF-kappaB 的活化、炎癥細胞因子的產生和腫瘤的發生，為肝細胞癌的發生發展提供了微環境[22]。除此之外，有關研究[23]還證明了腫瘤抑制因子 miR-18b 對核仁紡錘體相關蛋白 1（NUSAP1）mRNA 的靶向作用是受宿主病毒相互作用中 HBx 調控啟動子甲基化的控制，從而導致肝細胞癌的發生。
綜上所述，HBx 與肝細胞癌的關系包括：① HBx 的抗逆轉錄作用可致肝細胞的同源重組缺陷和基因組的不穩定，并且有助于宿主肝細胞癌的發生。② HBV 含有 Ser-101 突變，而含有 Ser-101 的 HBx 變異體可誘導人肝癌細胞 PA28γ 表達的 p53 依賴性激活。③ HBx 可影響多種信號途徑，從而在肝細胞癌的發生過程中發揮重要作用，如 HBx 介導的 JNK 激活對 PXN 在絲氨酸 178 處的磷酸化可能在 HBV 感染的肝細胞癌的侵襲性和預后不良中起重要作用；lncRNA F11-AS1 的低表達與 HBV 相關性肝細胞癌患者的預后不良相關，但其下調是由 HBx 蛋白引起的[20]，這也間接說明了 HBx 與肝細胞癌的關系。④ HBx 可通過 WDR5 發揮其促腫瘤作用；CPAP 與 HBx 的相互作用通過增強 NF-kappaB 的活化、炎癥細胞因子的產生和腫瘤的發生，為肝細胞癌的發生發展提供了微環境。上述結果均說明了 HBx 和肝細胞癌的發生、發展、遷徙、轉移之間的關系。
3 肝細胞癌與 HBV 的基因型
HBV 分為 10 個基因型和許多亞基因型（sgt）。HBV 不同基因型或亞型的肝細胞癌，其預后也有所差異。其中拉丁美洲本土的 sgtF1b 和 sgtF4 與臨床和病毒學特征的差異有關。有研究[24]分析了 X 基因和編碼的 X 蛋白在 sgtF1b 和 sgtF4 復制中的作用：轉染 HBx 缺陷基因后，sgtF1b 和 sgtF4 突變體的復制能力存在顯著差異，HBx 沉默使 sgtF1b X（X基因沉默）的轉錄和復制比野生型增加 2.5 倍以上，而 sgtF4 X（X基因沉默）的轉錄和復制比野生型減少 3 倍以上。HBV 基礎核心啟動子（BCP）雙突變 ［T（1762）A（1764）］ 是肝細胞癌發生中 B、C 基因型的強混雜因素，HBV 的 C 基因型對肝細胞癌發生發展的影響在野生型和 BCP 雙突變型之間存在差異，這也提示并非所有感染 C 基因型 HBV 的人都有肝細胞癌發生的危險[25]。通過建立統計學模型[26]研究了 1983–2012 年間確診的慢性 HBV 感染者后，發現 HBV 基因型與肝細胞癌危險性獨立相關，A、C 和 F 基因型的人比 B 或 D 基因型的人發生肝細胞癌的風險更高。大約有 75% 的肝細胞癌發生在亞洲，這也使得亞洲在分析 HBV 基因型與肝細胞癌的發生關系方面具有獨特的優勢。有研究[27]在調查了柬埔寨暹粒省 35 例乙肝表面抗原（HBsAg）陽性居民中 26 個全長 HBV 基因組的特征后發現：① C1 基因型占優勢（92.3%，24/26），B2 和 B4 各 1 例；24 株柬埔寨 C1 菌株發生多重突變，其中 18 株（75.0%）A1762T/G1764A 雙突變，14 株（58.3%）C1653T 和（或）T1753V 和 A1762T/G1764A 聯合突變。② 在系統發育分析中，24 個分離株中有 16 個位于老撾、泰國和馬來西亞。③ GenBank 登記的 340 株 C1 菌株中，有 113 株（33.2%）存在聯合突變，其中 ASC、慢性肝炎和肝硬化/肝細胞癌分別為 16.5%、34.2% 和 95.2%（P<0.01）。④ 24 株柬埔寨 C1 菌株突變豐富，GenBank 的 340 株 C1 菌株的 C1 基因型突變為肝硬化/肝細胞癌的發生提供了很高的可能性。因此可以認為柬埔寨人感染基因 C1 型 HBV 有很高的肝細胞癌發生的可能性。亞洲地區主要流行 B 型和 C 型，這個規律也同樣適用于日本，但在對 295 例 HBsAg 陽性攜帶者中 241 例隨訪后發現，HBV 亞型從長遠來看與肝細胞癌的發生率無關[28-30]。這與之前的一些研究結果有所不同，因此有待進一步研究。
我國學者[31]也對其中的聯系進行了研究，通過對國內外 17 篇文獻、16 288 例患者、其中肝癌患者 3 613 例的 meta 分析發現，HBV C 基因型的患者較其他基因型的患者發生肝癌的風險更高。在印度 2018 年的相關研究[32]中，研究者收集了國內 3 所醫院 141 例 HBV 相關性肝癌患者，結果在 70 例 HBV-DNA陽性的肝細胞癌患者中，有 40 例（57.1%）檢測到基因型，D 基因型 20 例（50.0%），A 基因型 10 例（25.0%），C 基因型 10 例（25.0%），提示雖然印度 HBV 基因型主要是 D 型，但在肝細胞癌患者中檢測到 HBV 基因型 C 表明印度的病毒流行病學正在發生變化。除此之外，在關于阿拉斯加土著年輕人的研究[33]中，確定了感染 F1b 基因型在當地人群中阿拉斯加特異性核心突變與肝細胞癌發生之間的相關性。在基因型 F1b 慢性感染過程中，這些核心突變的積累將有助于阿拉斯加土著人生命早期的肝細胞癌的發展。在對尼日利亞人的相關研究[34-35]中分離出的 HBV E 型中發現了與疫苗逃逸、隱匿性感染和不良肝細胞癌預后相關的突變。
4 小結
HBx、肝細胞癌和 HBV 基因亞型之間的關系錯綜復雜，迄今為止的相關研究也都證明了其相關性，但其具體的關系有待進一步的探索。不同地區 HBV 的基因型有所差異，而不同的基因型又導致了疾病進展的不同，X 蛋白在疾病的進展中扮演了舉足輕重的角色。因此，探討 HBV 基因型、X 蛋白和肝細胞癌三者之間的關系的工作就變得尤為重要，通過進一步的研究對發現新的治療靶點和藥物，推動乙型肝炎、肝硬化和肝癌的診斷與治療，以及為患者提供更為個體化的干預手段具有重要的作用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們聲明彼此間沒有利益沖突。
作者貢獻聲明：徐源通負責文獻檢索、撰寫文章；陳剛、江杰和陳家川參與文獻檢索；胡宗強負責寫作指導和文章審校。