引用本文： 馮海玲, 范長玲, 潘中軍, 何圣科. TXNIP/NLRP3 通路在乳腺癌發生發展中的作用機制研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(11): 1418-1425. doi: 10.7507/1007-9424.202102050 復制
乳腺癌嚴重威脅全世界女性的生命健康[1]。目前乳腺癌發生發展機制仍不明確[2]。故了解乳腺癌的分子機制對改善其診斷和臨床治療結果有潛在的臨床意義。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體 3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體可調節各種炎癥因子如白細胞介素（interleukin，IL）-1β 及 IL-18 的表達，并參與腫瘤發生發展過程[3]。但 NLRP3 在乳腺癌中的發病機制還不甚明確。硫氧還蛋白結合蛋白（thioredoxin binding protein，TXNIP）是一種有效的腫瘤抑制因子，在人類各類型腫瘤中表達均降低[4]，且近年來有研究[5]發現 TXNIP 參與三陰性乳腺癌的代謝重編過程。但也有研究[6]發現，增強 TXNIP-NLRP3 的相互作用，激活 NLRP3 炎癥小體，促進 IL-1β 水平升高可誘導肺腺癌細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用。TXNIP-NLRP3 介導的炎性反應在乳腺癌發生發展過程中的調控機制還不甚明確。本研究擬通過上調 MDA-MB231 癌細胞系中的 TXNIP 的表達，探究其對乳腺癌生長、侵襲以及遷移的影響，以期揭示 TXNIP-NLRP3 軸在乳腺癌發生發展中的作用機制，為乳腺癌的靶向治療提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 乳腺癌組織、癌旁組織及細胞株
收集 2019 年 9 月至 2020 年 6 月期間于筆者所在醫院行手術切除的 15 例女性乳腺癌組織及距離其邊緣 5 cm 的癌旁組織，所有組織均用 4% 多聚甲醛固定后用石蠟包埋保存。病例納入標準：① 臨床診斷為乳腺浸潤性導管癌；② 年齡 38～65 歲；③ 伴有淋巴結轉移；④ 組織學分級為Ⅱ～Ⅲ級；⑤ 資料完整。排除標準：① 近 2 周內有感染疾病史；② 有基礎心、肝、腎、肺功能異常基礎疾病史；③ 有糖尿病、風濕性關節炎等疾病史；④ 有長期激素類藥物使用史及其他可能影響免疫系統的疾病史；⑤ 有結核、梅毒、人類免疫缺陷病毒感染等疾病史；⑥ 臨床無法分期及組織標本分子受體免疫組化檢測不全者。本研究通過了儋州市人民醫院醫學倫理委員會的審批（批文編號：IACUC-104093），且所有患者知情同意。
1.1.2 主要材料、試劑與儀器
3 種乳腺癌細胞系（MDA-MB231、MCF-7 和 SKBR3）以及正常乳腺上皮細胞（HMEC）均購自中國科學院典型培養物保藏中心；RPMI 1640 培養基（貨號：PM150110）和鏈霉素（貨號：PB180123）購自武漢益普生物科技有限公司；改良 Eagle 培養液（貨號：01-025-1A）購自上海研卉生物科技有限公司；10%胎牛血清（貨號：A31608-02）購自上海偉進生物科技有限公司；重組腺病毒（Ad-GFP）、攜帶 TXNIP 及 NLRP3 基因的腺病毒載體（Ad-TXNIP、Ad-NLRP3）均由何通川教授團隊構建并饋贈；CCK-8 試劑盒（貨號：CK04-2）購自上海經科化學科技有限公司；TXNIP、NLRP3、增殖標志蛋白Ki-67、凋亡蛋白caspase-1、血管內皮生長因子（VEGF）、IL-1β、IL-18、caspase-1 前體蛋白（pro-caspase-1）抗體（ab188865、ab214185、ab16667、ab74279、ab32152、ab239517、ab243295 和 ab179515）均購自美國 Abcam 公司；Matrigel 基質膠（貨號：JK-R5450）購自上海晶抗生物工程有限公司；ECL 顯色試劑盒（貨號：RBX-82680）購自上海榕柏生物技術有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號：PD-BCA-500）購自上海炎熙生物科技有限公司；酶標儀（型號：HBS-1096A）購自上海研卉生物科技有限公司；光學顯微鏡（型號：E100），日本尼康。裸鼠，體質量（20±2）g，鼠齡 3～4 周，購自于中國食品藥品檢定研究院，生產許可證號：SCXK（京）2019-0017。
1.2 方法
1.2.1 乳腺癌組織及其癌旁組織中 TXNIP 和 NLRP3 蛋白表達檢測
采用免疫組化法檢測。取乳腺癌組織及其癌旁組織石蠟塊，參照 TXNIP 及 NLRP3 免疫組化試劑盒說明書進行操作，于光鏡下觀察并拍照，用 Image Pro-Plus 6.0 軟件進行累積吸光度值（A 值）測量以反映 TXNIP 和 NLRP 蛋白表達水平。
1.2.2 細胞培養
取 MDA-MB231 和 SKBR3 細胞株，37 ℃ 水浴復蘇后，向細胞懸液中加入 RPMI 1640 培養液（含 10%胎牛血清、100 mg/mL 鏈霉素和 100 U/mL 青霉素）9 mL；取 MCF-7 細胞系和 HMEC 細胞系，37 ℃ 水浴復蘇后，向細胞懸液中加入改良 Eagle 培養液（含 10%胎牛血清、100 mg/mL 鏈霉素和 100 U/mL 青霉素） 9 mL。將所取細胞置于 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，當細胞培養至密度達 80%～90% 時，每 3 天用 10% 磷酸緩沖溶液和 0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）/0.5%胰蛋白酶傳代培養。
1.2.3 不同細胞系中 TXNIP 及 NLRP3 蛋白相對表達水平檢測
采用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測。取對數期細胞，待細胞生長密度達 50%～60% 后，用細胞培養液重懸成單個細胞懸液（1×105個/mL），取 1 mL 細胞懸液，加入細胞裂解液，冰上研磨粉碎后，用蛋白抽提試劑盒提取各細胞系中的總蛋白，用 BCA 試劑盒檢測總蛋白濃度，取 50 μg蛋白樣品行電泳及半干法轉膜反應；脫脂奶粉封閉 3 h 后，加入一抗（TXNIP、NLRP3 及 GAPDH 抗體，稀釋倍數均為 1∶2 000），4 ℃ 下孵育過夜后加入含辣根過氧化物酶綴合的二抗（1∶2 000）于室溫下孵育 2 h。用 ECL 試劑盒顯色及化學發光成像分析系統進行拍照，以 Image-J 軟件分析蛋白相對表達水平。每組實驗重復 6 次。
1.2.4 細胞轉染及分組處理
取對數期 MDA-MB231 細胞，待細胞生長密度達 50%～60% 后，用 RPMI 1640 培養液制成單個細胞懸液并計數，以 2×104 個/孔的密度接種到 96 孔板中，并分為空白對照組（正常培養不做任何處理）、TXNIP 過表達組（Ad-TXNIP 組，轉染攜帶 TXNIP 過表達序列的腺病毒載體）、Ad-TXNIP 陰性對照組（Ad-eGFP1 組，轉染不含 TXNIP 過表達序列的腺病毒空載體）、NLRP3 過表達組（Ad-NLRP3 組，轉染含 NLRP3 過表達序列的腺病毒載體）、TXNIP 和 NLRP3 過表達共轉染組（Ad-TXNIP+Ad-NLRP3 組，共轉染攜帶 TXNIP 和 NLRP3 過表達序列的腺病毒載體）以及 TXNIP 過表達和 Ad-NLRP3 陰性對照（Ad-eGFP2）共轉染組（Ad-TXNIP+Ad-eGFP2 組，共轉染攜帶 TXNIP 過表達序列和不含 NLRP3 過表達序列的腺病毒空載體），共 6 組，每組設置 6 個復孔。各組細胞轉染后，在 37 ℃、5% CO2 中孵育 24 h 后進行后續實驗。
1.2.5 細胞增殖活性檢測
取 1.2.4 項下轉染后的各組細胞，參考 CCK-8 檢測試劑盒說明書方法加入 10% 的 CCK-8 溶液培養 2 h 后，在酶標儀上于 450 nm 波長下檢測各組細胞的吸光度值（A 值），以 A 值大小代表細胞增殖活性。
1.2.6 細胞侵襲能力檢測
取 1.2.4 項下轉染后的各組細胞，用不含胎牛血清的培養基重懸成單細胞懸液，取細胞懸液 100 μL（濃度為 1×108個/mL）接種到 Transwell 小室上室，取 600 μL 含 20% 胎牛血清的培養基至 Transwell 小室下室，室溫培養 24 h 后，下室用 4% 多聚甲醛 37 ℃ 固定 30 min、磷酸緩沖液洗滌、甲醇固定 10 min 后，用 0.1% 結晶紫 37 ℃ 染色 35 min 后于光鏡下觀察，計算穿過微孔膜的細胞數來反映細胞的侵襲能力。實驗重復6 次。
1.2.7 細胞遷移能力檢測
在 Transwell 小室上室鋪 50 μL（Matrigel 膠∶培養基=1∶8）的普通 Matrigel 膠工作液，37 ℃ 恒溫培養箱過夜，待 Matrigel 膠凝固后，其余步驟與 1.2.6 實驗相同，用穿膜細胞數反映細胞遷移能力。實驗重復 6 次。
1.2.8 各組細胞在動物體內成瘤能力檢測
收集 1.2.4 項下培養 24 h 后的各組細胞，使用磷酸緩沖溶液重懸稀釋后，取 100 μL 濃度為 2×106 個/mL 的細胞懸液，分別接種于 6 只裸鼠右前肢腋下皮膚組織，觀察腫瘤形成情況并于 20 d 后麻醉處死裸鼠，分離瘤體并稱重。
1.2.9 各組細胞各蛋白表達水平檢測
收集 1.2.4 項下培養 24 h 后的各組細胞，用蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測總蛋白濃度，取 50 μg 蛋白樣品行電泳及半干法轉膜反應；脫脂奶粉封閉 3 h 后，分別加入一抗（TXNIP、NLRP3、Ki-67、VEGF、caspase-1、IL-1β、IL-18 和 pro-caspase-1 抗體）和內參抗體 GAPDH，稀釋倍數均為 1∶2 000，4 ℃ 下孵育過夜后加入含辣根過氧化物酶綴合的二抗（1∶2 000），于室溫下孵育 2 h。用 ECL 試劑盒顯色及化學發光成像分析系統進行分析檢測。每組實驗重復 6 次。
1.3 統計學方法
用 SPSS 24.0 進行統計學分析。采用 Shapiro-Wilk 方法檢驗計量資料是否符合正態分布；符合正態分布的計量資料用均數±標準差（
±s）表示，2 組比較行配對 t 檢驗；多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用 SNK-q 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 乳腺癌組織及其癌旁組織中 TXNIP 和 NLRP3 蛋白表達結果
TXNIP 蛋白在癌旁組織上皮細胞胞漿中呈紅棕色強陽性表達，在乳腺癌組織中呈弱陽性表達；NLRP3 蛋白在乳腺癌組織細胞胞漿中呈棕黃色強陽性表達，其在癌旁組織中呈弱陽性表達。見圖1。與癌旁組織相比，乳腺癌組織中 TXNIP 蛋白相對表達水平降低（0.36±0.08 比 1.09±0.10，P<0.05），NLRP3 蛋白相對表達水平升高（1.05±0.16 比 0.33±0.02，P<0.05）。
圖1
示乳腺癌組織及其癌旁組織中 TXNIP 和 NLRP3 蛋白的表達（免疫組化染色 ×200）
a：癌旁組織中 TXNIP 蛋白呈強陽性表達；b：乳腺癌組織中 TXNIP 蛋白呈弱陽性表達；c：癌旁組織中 NLRP3 蛋白呈弱陽性表達；d：乳腺癌組織中 NLRP3 蛋白呈強陽性表達
2.2 各細胞系中 TXNIP 及 NLRP3 蛋白表達水平檢測結果
與 HMEC 細胞系相比，MDA-MB231、MCF-7 和 SKBR3 乳腺癌細胞系中 TXNIP 蛋白相對表達水平降低（P<0.05），NLRP3 蛋白相對表達水平升高（P<0.05），其中 MDA-MB231 細胞系中 TXNIP 蛋白相對表達水平最低、NLRP3 蛋白相對表達水平最高（圖2 和表1）。
圖2
示 Wester blot 法檢測各細胞系中 TXNIP 和 NLRP3 蛋白表達的電泳圖
表1
各細胞系中 TXNIP 及 NLRP3 蛋白相對表達水平（
）
2.3 TXNIP 及 NLRP3 過表達腺病毒轉染后對 MDA-MB231 細胞增殖活性的影響
與空白對照組相比，Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞增殖活性均降低（P<0.05）；與 Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組相比，Ad-TXNIP+Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞增殖活性進一步降低（P<0.05），見表2。
表2
TXNIP及NLRP3過表達腺病毒轉染后對MDA-MB231細胞增殖活性及細胞遷移侵襲能力的影響（
）
2.4 TXNIP 及 NLRP3 過表達腺病毒轉染后對 MDA-MB231 細胞遷移侵襲能力的影響
與空白對照組相比，Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞的遷移和侵襲能力均降低（P<0.05）；與 Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組相比，Ad-TXNIP+Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞的遷移和侵襲能力進一步降低（P<0.05），見圖3 及表2。
圖3
示各組 MDA-MB231 細胞遷移和侵襲能力的檢測結果（結晶紫染色 ×200）
2.5 TXNIP 及 NLRP3 過表達腺病毒轉染后對 MDA-MB231 細胞在體成瘤能力的影響
與空白對照組相比，Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞接種的裸鼠體內瘤體的質量降低（P<0.05）；與 Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組相比，Ad-TXNIP+Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞接種的裸鼠體內瘤體的質量進一步降低（P<0.05），見表2。
2.6 TXNIP 及 NLRP3 過表達腺病毒轉染后對 MDA-MB231 細胞中各蛋白表達的影響
與空白對照組相比，Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞中 TXNIP、NLRP3、IL-1β、IL-18、pro-caspase-1 和 caspase-1 蛋白相對表達量升高（P<0.05），Ki-67 和 VEGF 蛋白相對表達量降低（P<0.05）；與 Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組相比，Ad-TXNIP+Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞中 TXNIP、NLRP3、IL-1β、IL-18、pro-caspase-1 和 caspase-1 蛋白相對表達量進一步升高（P<0.05），Ki-67 和 VEGF 蛋白相對表達量進一步降低（P<0.05）。見圖4 和表3。
圖4
示 Western blot 法檢測各組 MDA-MB231 細胞中各蛋白表達的電泳圖
A：空白對照組；B：Ad-TXNIP 組；C：Ad-NLRP3 組；D：Ad-TXNIP+Ad-NLRP3 組；E：Ad-eGFP1 組；F：Ad-TXNIP+Ad-eGFP2 組
表3
各組 MDA-MB231 細胞中各蛋白的相對表達量檢測結果（
）
3 討論
乳腺癌位于女性惡性腫瘤發病率的第 1 位，每年約有 15% 女性腫瘤患者因乳腺癌而死亡[7]。乳腺癌具有較高的發病率及轉移率，且治愈率較低[8]。尋找乳腺癌發病進程中的分子機制及放化療治療的靶標分子，對改善患者預后及提高治療效果有重要的臨床價值。
TXNIP 也稱為維生素 D3 上調蛋白 1[9]。Li 等[10]研究認為，TXNIP 是氧化還原的關鍵調節器，能夠與硫氧還蛋白結合來抑制硫氧還蛋白的抗氧化功能，還能夠抑制細胞葡萄糖吸收及代謝重編過程來調控細胞的生長。但近年來的研究[11-12]發現，TXNIP 可作為腫瘤抑制基因，在肺癌、胃癌和結腸癌中均呈低表達。Huang 等[13]研究認為，TXNIP 具有較好的促氧化應激及促凋亡作用，干預 TXNIP 表達可能是抗腫瘤的潛在治療策略。Park 等[14]研究發現，TXNIP 能抑制高增殖活性的乳腺癌細胞的增殖，提示 TXNIP 在人類乳腺癌的發生發展過程中也可能扮演重要的角色。本研究發現，TXNIP 在乳腺癌組織中的相對表達水平低于癌旁組織，且 3 種乳腺癌細胞系（MDA-MB231、MCF-7 和 SKBR3）中 TXNIP 蛋白的相對表達水平低于正常乳腺上皮細胞（HMEC），提示 TXNIP 低表達可能與乳腺癌的發生有關。另外，TXNIP 蛋白在 MDA-MB231 細胞中的相對表達水平最低，故后續選擇了 MDA-MB231 細胞進行 TXNIP 蛋白過表達研究。TXNIP 敲低可使腫瘤細胞增殖標志蛋白 Ki-67 表達升高[14]并表現出高增殖活性。Cai 等[15]發現，在 Ki-67 高表達的惡性腦膜瘤組織中，TXNIP 蛋白的表達低于 Ki-67 低表達的良性腫瘤組織，提示 TXNIP 蛋白低表達可能是腫瘤預后的危險因素。Baldan 等[16]及 Iqbal 等[17]發現，TXNIP 敲低可導致體外和體內乳腺癌細胞生長的增加，并伴隨周期調節蛋白（p27）的減少，從而使乳腺癌不受控制地增長。MDA-MB231 細胞為高轉移性惡性乳腺癌細胞系，本研究使 MDA-MB231 細胞過表達 TXNIP 后，細胞增殖標志蛋白 Ki-67 相對表達量降低，促凋亡蛋白 caspase-1 相對表達量增高，MDA-MB231 細胞的遷移、侵襲能力及裸鼠體內成瘤能力也降低，提示上調 TXNIP 蛋白表達可能是治療乳腺癌的潛在策略。
另外，NLRP3 亦與乳腺癌的發生發展關系密切。Zhang 等[18]及 Ershaid 等[19]的研究證實，NLRP3 活化可促進 NLRP3 下游靶分子 IL-1β、IL-18 及 VEGF 的表達，促進機體免疫抑制及腫瘤血管生成，促進腫瘤的侵襲與轉移；而抑制 NLRP3 表達，可降低體內外乳腺癌的生長和免疫抑制。本研究檢測到 NLRP3 蛋白在乳腺癌組織及乳腺癌細胞系中的相對表達量高于癌旁組織及正常乳腺細胞，提示 NLRP3 過表達可能與乳腺癌的發生有關。本研究進一步檢測發現，過表達 NLRP3 后，MDA-MB231 細胞中 NLRP3 及其介導的 IL-1β 和 IL-18 蛋白相對表達量均進一步升高的同時，細胞增殖活性及 VEGF 表達并未像文獻[18-19]中所示的升高，而是顯示出較低的增殖活性及侵襲、遷移能力，提示 NLRP3 高表達可抑制腫瘤的增殖，這與 Zhang 等[18]及 Ershaid 等[19]的 NLRP3 活化促進腫瘤的侵襲與轉移觀點相矛盾。深入研究發現，NLRP3 炎癥小體可誘導腫瘤細胞焦亡。曾琬琴等[20]研究發現，NLRP3 等炎癥小體可激活 pro-caspase-1 的活化，活化的 pro-caspase-1 可切割細胞焦亡關鍵蛋白-底物蛋白（GSDMD）形成具有膜毒性的 GSDMD-N 端 p30 片段，并靶向定位于細胞膜脂質雙分子層上，使細胞膜形成孔洞，進而破壞細胞膜的完整性、降低膜內外的離子濃度梯度，導致細胞腫脹、破裂及內容物（溶酶體、炎性因子等）大量釋放，最終導致細胞焦亡。Chen 等[21]及 Kofahi 等[22]研究發現，肝癌患者癌組織中存在 NLRP3 活化及細胞焦亡，且 NLRP3 高表達可引起肝癌細胞焦亡，caspase-1 抑制劑可逆轉細胞焦亡引起的癌細胞損傷。本研究檢測到 NLRP3 過表達后，細胞中與焦亡相關的 caspase-1 和 pro-caspase-1 蛋白相對表達量高于空白對照組，乳腺癌細胞表現出更低的增殖、侵襲和遷移能力以及成瘤能力，提示 NLRP3 活化介導的細胞焦亡也可能參與了乳腺癌細胞增殖、侵襲、遷移過程。另外，Liu 等[6]研究發現，TXNIP 可與 NLRP3 相互作用，激活 NLRP3 炎癥小體，使炎癥因子 IL-1β 分泌增加并誘導 caspase-3 活化來促進肺腺癌細胞焦亡。本研究也在 TXNIP 過表達組檢測到 NLRP3 和 pro-caspase-1 蛋白相對表達量高于空白對照組，提示 TXNIP 過表達可促進 NLRP3 活化，使細胞焦亡途徑激活，這可能是 TXNIP 抑制腫瘤生長、侵襲和遷移的可能機制，與肺腺癌中 TXNIP-NLRP3 介導的炎癥反應激活，增加細胞凋亡的報道一致[6]。本研究還發現，在 TXNIP 與 NLRP3 過表達共轉染組細胞中，隨著 TXNIP 及 NLRP3 蛋白表達的進一步升高，pro-caspase-1 和 caspase-1 蛋白的表達也進一步升高，細胞表現出更低的增殖、侵襲和遷移能力，且成瘤能力也進一步降低，提示 NLRP3 活化可促進 TXNIP 對乳腺癌細胞增殖、侵襲與遷移的抑制作用。
綜上所述，在乳腺癌組織及乳腺癌細胞系中，TXNIP 蛋白呈低表達，NLRP3 蛋白呈高表達。TXNIP 與 NLRP3 可相互作用共同促進細胞焦亡，抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲與遷移，可能為闡明 TXNIP 抑制腫瘤惡性行為的機制提供一定參考依據。但本研究還存在一定的不足，TXNIP/NLRP3參與腫瘤細胞焦亡過程的靶向基因調控機制復雜且不明確，NLRP3 炎癥小體在乳腺癌中的調控作用還存在爭議，還有待進一步驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：馮海玲負責課題設計、方案實施、撰寫論文；范長玲負責實施研究、收集數據；潘中軍負責收集數據、統計分析、查閱文獻；何圣科負責撰寫論文、整理修改等。
倫理聲明：本研究通過了儋州市人民醫院醫學倫理委員會的審批（批文編號：IACUC-104093）。
乳腺癌嚴重威脅全世界女性的生命健康[1]。目前乳腺癌發生發展機制仍不明確[2]。故了解乳腺癌的分子機制對改善其診斷和臨床治療結果有潛在的臨床意義。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體 3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體可調節各種炎癥因子如白細胞介素（interleukin，IL）-1β 及 IL-18 的表達，并參與腫瘤發生發展過程[3]。但 NLRP3 在乳腺癌中的發病機制還不甚明確。硫氧還蛋白結合蛋白（thioredoxin binding protein，TXNIP）是一種有效的腫瘤抑制因子，在人類各類型腫瘤中表達均降低[4]，且近年來有研究[5]發現 TXNIP 參與三陰性乳腺癌的代謝重編過程。但也有研究[6]發現，增強 TXNIP-NLRP3 的相互作用，激活 NLRP3 炎癥小體，促進 IL-1β 水平升高可誘導肺腺癌細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用。TXNIP-NLRP3 介導的炎性反應在乳腺癌發生發展過程中的調控機制還不甚明確。本研究擬通過上調 MDA-MB231 癌細胞系中的 TXNIP 的表達，探究其對乳腺癌生長、侵襲以及遷移的影響，以期揭示 TXNIP-NLRP3 軸在乳腺癌發生發展中的作用機制，為乳腺癌的靶向治療提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 乳腺癌組織、癌旁組織及細胞株
收集 2019 年 9 月至 2020 年 6 月期間于筆者所在醫院行手術切除的 15 例女性乳腺癌組織及距離其邊緣 5 cm 的癌旁組織，所有組織均用 4% 多聚甲醛固定后用石蠟包埋保存。病例納入標準：① 臨床診斷為乳腺浸潤性導管癌；② 年齡 38～65 歲；③ 伴有淋巴結轉移；④ 組織學分級為Ⅱ～Ⅲ級；⑤ 資料完整。排除標準：① 近 2 周內有感染疾病史；② 有基礎心、肝、腎、肺功能異常基礎疾病史；③ 有糖尿病、風濕性關節炎等疾病史；④ 有長期激素類藥物使用史及其他可能影響免疫系統的疾病史；⑤ 有結核、梅毒、人類免疫缺陷病毒感染等疾病史；⑥ 臨床無法分期及組織標本分子受體免疫組化檢測不全者。本研究通過了儋州市人民醫院醫學倫理委員會的審批（批文編號：IACUC-104093），且所有患者知情同意。
1.1.2 主要材料、試劑與儀器
3 種乳腺癌細胞系（MDA-MB231、MCF-7 和 SKBR3）以及正常乳腺上皮細胞（HMEC）均購自中國科學院典型培養物保藏中心；RPMI 1640 培養基（貨號：PM150110）和鏈霉素（貨號：PB180123）購自武漢益普生物科技有限公司；改良 Eagle 培養液（貨號：01-025-1A）購自上海研卉生物科技有限公司；10%胎牛血清（貨號：A31608-02）購自上海偉進生物科技有限公司；重組腺病毒（Ad-GFP）、攜帶 TXNIP 及 NLRP3 基因的腺病毒載體（Ad-TXNIP、Ad-NLRP3）均由何通川教授團隊構建并饋贈；CCK-8 試劑盒（貨號：CK04-2）購自上海經科化學科技有限公司；TXNIP、NLRP3、增殖標志蛋白Ki-67、凋亡蛋白caspase-1、血管內皮生長因子（VEGF）、IL-1β、IL-18、caspase-1 前體蛋白（pro-caspase-1）抗體（ab188865、ab214185、ab16667、ab74279、ab32152、ab239517、ab243295 和 ab179515）均購自美國 Abcam 公司；Matrigel 基質膠（貨號：JK-R5450）購自上海晶抗生物工程有限公司；ECL 顯色試劑盒（貨號：RBX-82680）購自上海榕柏生物技術有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號：PD-BCA-500）購自上海炎熙生物科技有限公司；酶標儀（型號：HBS-1096A）購自上海研卉生物科技有限公司；光學顯微鏡（型號：E100），日本尼康。裸鼠，體質量（20±2）g，鼠齡 3～4 周，購自于中國食品藥品檢定研究院，生產許可證號：SCXK（京）2019-0017。
1.2 方法
1.2.1 乳腺癌組織及其癌旁組織中 TXNIP 和 NLRP3 蛋白表達檢測
采用免疫組化法檢測。取乳腺癌組織及其癌旁組織石蠟塊，參照 TXNIP 及 NLRP3 免疫組化試劑盒說明書進行操作，于光鏡下觀察并拍照，用 Image Pro-Plus 6.0 軟件進行累積吸光度值（A 值）測量以反映 TXNIP 和 NLRP 蛋白表達水平。
1.2.2 細胞培養
取 MDA-MB231 和 SKBR3 細胞株，37 ℃ 水浴復蘇后，向細胞懸液中加入 RPMI 1640 培養液（含 10%胎牛血清、100 mg/mL 鏈霉素和 100 U/mL 青霉素）9 mL；取 MCF-7 細胞系和 HMEC 細胞系，37 ℃ 水浴復蘇后，向細胞懸液中加入改良 Eagle 培養液（含 10%胎牛血清、100 mg/mL 鏈霉素和 100 U/mL 青霉素） 9 mL。將所取細胞置于 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，當細胞培養至密度達 80%～90% 時，每 3 天用 10% 磷酸緩沖溶液和 0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）/0.5%胰蛋白酶傳代培養。
1.2.3 不同細胞系中 TXNIP 及 NLRP3 蛋白相對表達水平檢測
采用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測。取對數期細胞，待細胞生長密度達 50%～60% 后，用細胞培養液重懸成單個細胞懸液（1×105個/mL），取 1 mL 細胞懸液，加入細胞裂解液，冰上研磨粉碎后，用蛋白抽提試劑盒提取各細胞系中的總蛋白，用 BCA 試劑盒檢測總蛋白濃度，取 50 μg蛋白樣品行電泳及半干法轉膜反應；脫脂奶粉封閉 3 h 后，加入一抗（TXNIP、NLRP3 及 GAPDH 抗體，稀釋倍數均為 1∶2 000），4 ℃ 下孵育過夜后加入含辣根過氧化物酶綴合的二抗（1∶2 000）于室溫下孵育 2 h。用 ECL 試劑盒顯色及化學發光成像分析系統進行拍照，以 Image-J 軟件分析蛋白相對表達水平。每組實驗重復 6 次。
1.2.4 細胞轉染及分組處理
取對數期 MDA-MB231 細胞，待細胞生長密度達 50%～60% 后，用 RPMI 1640 培養液制成單個細胞懸液并計數，以 2×104 個/孔的密度接種到 96 孔板中，并分為空白對照組（正常培養不做任何處理）、TXNIP 過表達組（Ad-TXNIP 組，轉染攜帶 TXNIP 過表達序列的腺病毒載體）、Ad-TXNIP 陰性對照組（Ad-eGFP1 組，轉染不含 TXNIP 過表達序列的腺病毒空載體）、NLRP3 過表達組（Ad-NLRP3 組，轉染含 NLRP3 過表達序列的腺病毒載體）、TXNIP 和 NLRP3 過表達共轉染組（Ad-TXNIP+Ad-NLRP3 組，共轉染攜帶 TXNIP 和 NLRP3 過表達序列的腺病毒載體）以及 TXNIP 過表達和 Ad-NLRP3 陰性對照（Ad-eGFP2）共轉染組（Ad-TXNIP+Ad-eGFP2 組，共轉染攜帶 TXNIP 過表達序列和不含 NLRP3 過表達序列的腺病毒空載體），共 6 組，每組設置 6 個復孔。各組細胞轉染后，在 37 ℃、5% CO2 中孵育 24 h 后進行后續實驗。
1.2.5 細胞增殖活性檢測
取 1.2.4 項下轉染后的各組細胞，參考 CCK-8 檢測試劑盒說明書方法加入 10% 的 CCK-8 溶液培養 2 h 后，在酶標儀上于 450 nm 波長下檢測各組細胞的吸光度值（A 值），以 A 值大小代表細胞增殖活性。
1.2.6 細胞侵襲能力檢測
取 1.2.4 項下轉染后的各組細胞，用不含胎牛血清的培養基重懸成單細胞懸液，取細胞懸液 100 μL（濃度為 1×108個/mL）接種到 Transwell 小室上室，取 600 μL 含 20% 胎牛血清的培養基至 Transwell 小室下室，室溫培養 24 h 后，下室用 4% 多聚甲醛 37 ℃ 固定 30 min、磷酸緩沖液洗滌、甲醇固定 10 min 后，用 0.1% 結晶紫 37 ℃ 染色 35 min 后于光鏡下觀察，計算穿過微孔膜的細胞數來反映細胞的侵襲能力。實驗重復6 次。
1.2.7 細胞遷移能力檢測
在 Transwell 小室上室鋪 50 μL（Matrigel 膠∶培養基=1∶8）的普通 Matrigel 膠工作液，37 ℃ 恒溫培養箱過夜，待 Matrigel 膠凝固后，其余步驟與 1.2.6 實驗相同，用穿膜細胞數反映細胞遷移能力。實驗重復 6 次。
1.2.8 各組細胞在動物體內成瘤能力檢測
收集 1.2.4 項下培養 24 h 后的各組細胞，使用磷酸緩沖溶液重懸稀釋后，取 100 μL 濃度為 2×106 個/mL 的細胞懸液，分別接種于 6 只裸鼠右前肢腋下皮膚組織，觀察腫瘤形成情況并于 20 d 后麻醉處死裸鼠，分離瘤體并稱重。
1.2.9 各組細胞各蛋白表達水平檢測
收集 1.2.4 項下培養 24 h 后的各組細胞，用蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測總蛋白濃度，取 50 μg 蛋白樣品行電泳及半干法轉膜反應；脫脂奶粉封閉 3 h 后，分別加入一抗（TXNIP、NLRP3、Ki-67、VEGF、caspase-1、IL-1β、IL-18 和 pro-caspase-1 抗體）和內參抗體 GAPDH，稀釋倍數均為 1∶2 000，4 ℃ 下孵育過夜后加入含辣根過氧化物酶綴合的二抗（1∶2 000），于室溫下孵育 2 h。用 ECL 試劑盒顯色及化學發光成像分析系統進行分析檢測。每組實驗重復 6 次。
1.3 統計學方法
用 SPSS 24.0 進行統計學分析。采用 Shapiro-Wilk 方法檢驗計量資料是否符合正態分布；符合正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，2 組比較行配對 t 檢驗；多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用 SNK-q 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 乳腺癌組織及其癌旁組織中 TXNIP 和 NLRP3 蛋白表達結果
TXNIP 蛋白在癌旁組織上皮細胞胞漿中呈紅棕色強陽性表達，在乳腺癌組織中呈弱陽性表達；NLRP3 蛋白在乳腺癌組織細胞胞漿中呈棕黃色強陽性表達，其在癌旁組織中呈弱陽性表達。見圖1。與癌旁組織相比，乳腺癌組織中 TXNIP 蛋白相對表達水平降低（0.36±0.08 比 1.09±0.10，P<0.05），NLRP3 蛋白相對表達水平升高（1.05±0.16 比 0.33±0.02，P<0.05）。
圖1
示乳腺癌組織及其癌旁組織中 TXNIP 和 NLRP3 蛋白的表達（免疫組化染色 ×200）
a：癌旁組織中 TXNIP 蛋白呈強陽性表達；b：乳腺癌組織中 TXNIP 蛋白呈弱陽性表達；c：癌旁組織中 NLRP3 蛋白呈弱陽性表達；d：乳腺癌組織中 NLRP3 蛋白呈強陽性表達
2.2 各細胞系中 TXNIP 及 NLRP3 蛋白表達水平檢測結果
與 HMEC 細胞系相比，MDA-MB231、MCF-7 和 SKBR3 乳腺癌細胞系中 TXNIP 蛋白相對表達水平降低（P<0.05），NLRP3 蛋白相對表達水平升高（P<0.05），其中 MDA-MB231 細胞系中 TXNIP 蛋白相對表達水平最低、NLRP3 蛋白相對表達水平最高（圖2 和表1）。
圖2
示 Wester blot 法檢測各細胞系中 TXNIP 和 NLRP3 蛋白表達的電泳圖
表1
各細胞系中 TXNIP 及 NLRP3 蛋白相對表達水平（）
2.3 TXNIP 及 NLRP3 過表達腺病毒轉染后對 MDA-MB231 細胞增殖活性的影響
與空白對照組相比，Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞增殖活性均降低（P<0.05）；與 Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組相比，Ad-TXNIP+Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞增殖活性進一步降低（P<0.05），見表2。
表2
TXNIP及NLRP3過表達腺病毒轉染后對MDA-MB231細胞增殖活性及細胞遷移侵襲能力的影響（）
2.4 TXNIP 及 NLRP3 過表達腺病毒轉染后對 MDA-MB231 細胞遷移侵襲能力的影響
與空白對照組相比，Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞的遷移和侵襲能力均降低（P<0.05）；與 Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組相比，Ad-TXNIP+Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞的遷移和侵襲能力進一步降低（P<0.05），見圖3 及表2。
圖3
示各組 MDA-MB231 細胞遷移和侵襲能力的檢測結果（結晶紫染色 ×200）
2.5 TXNIP 及 NLRP3 過表達腺病毒轉染后對 MDA-MB231 細胞在體成瘤能力的影響
與空白對照組相比，Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞接種的裸鼠體內瘤體的質量降低（P<0.05）；與 Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組相比，Ad-TXNIP+Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞接種的裸鼠體內瘤體的質量進一步降低（P<0.05），見表2。
2.6 TXNIP 及 NLRP3 過表達腺病毒轉染后對 MDA-MB231 細胞中各蛋白表達的影響
與空白對照組相比，Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞中 TXNIP、NLRP3、IL-1β、IL-18、pro-caspase-1 和 caspase-1 蛋白相對表達量升高（P<0.05），Ki-67 和 VEGF 蛋白相對表達量降低（P<0.05）；與 Ad-TXNIP 組及 Ad-NLRP3 組相比，Ad-TXNIP+Ad-NLRP3 組 MDA-MB231 細胞中 TXNIP、NLRP3、IL-1β、IL-18、pro-caspase-1 和 caspase-1 蛋白相對表達量進一步升高（P<0.05），Ki-67 和 VEGF 蛋白相對表達量進一步降低（P<0.05）。見圖4 和表3。
圖4
示 Western blot 法檢測各組 MDA-MB231 細胞中各蛋白表達的電泳圖
A：空白對照組；B：Ad-TXNIP 組；C：Ad-NLRP3 組；D：Ad-TXNIP+Ad-NLRP3 組；E：Ad-eGFP1 組；F：Ad-TXNIP+Ad-eGFP2 組
表3
各組 MDA-MB231 細胞中各蛋白的相對表達量檢測結果（）
3 討論
乳腺癌位于女性惡性腫瘤發病率的第 1 位，每年約有 15% 女性腫瘤患者因乳腺癌而死亡[7]。乳腺癌具有較高的發病率及轉移率，且治愈率較低[8]。尋找乳腺癌發病進程中的分子機制及放化療治療的靶標分子，對改善患者預后及提高治療效果有重要的臨床價值。
TXNIP 也稱為維生素 D3 上調蛋白 1[9]。Li 等[10]研究認為，TXNIP 是氧化還原的關鍵調節器，能夠與硫氧還蛋白結合來抑制硫氧還蛋白的抗氧化功能，還能夠抑制細胞葡萄糖吸收及代謝重編過程來調控細胞的生長。但近年來的研究[11-12]發現，TXNIP 可作為腫瘤抑制基因，在肺癌、胃癌和結腸癌中均呈低表達。Huang 等[13]研究認為，TXNIP 具有較好的促氧化應激及促凋亡作用，干預 TXNIP 表達可能是抗腫瘤的潛在治療策略。Park 等[14]研究發現，TXNIP 能抑制高增殖活性的乳腺癌細胞的增殖，提示 TXNIP 在人類乳腺癌的發生發展過程中也可能扮演重要的角色。本研究發現，TXNIP 在乳腺癌組織中的相對表達水平低于癌旁組織，且 3 種乳腺癌細胞系（MDA-MB231、MCF-7 和 SKBR3）中 TXNIP 蛋白的相對表達水平低于正常乳腺上皮細胞（HMEC），提示 TXNIP 低表達可能與乳腺癌的發生有關。另外，TXNIP 蛋白在 MDA-MB231 細胞中的相對表達水平最低，故后續選擇了 MDA-MB231 細胞進行 TXNIP 蛋白過表達研究。TXNIP 敲低可使腫瘤細胞增殖標志蛋白 Ki-67 表達升高[14]并表現出高增殖活性。Cai 等[15]發現，在 Ki-67 高表達的惡性腦膜瘤組織中，TXNIP 蛋白的表達低于 Ki-67 低表達的良性腫瘤組織，提示 TXNIP 蛋白低表達可能是腫瘤預后的危險因素。Baldan 等[16]及 Iqbal 等[17]發現，TXNIP 敲低可導致體外和體內乳腺癌細胞生長的增加，并伴隨周期調節蛋白（p27）的減少，從而使乳腺癌不受控制地增長。MDA-MB231 細胞為高轉移性惡性乳腺癌細胞系，本研究使 MDA-MB231 細胞過表達 TXNIP 后，細胞增殖標志蛋白 Ki-67 相對表達量降低，促凋亡蛋白 caspase-1 相對表達量增高，MDA-MB231 細胞的遷移、侵襲能力及裸鼠體內成瘤能力也降低，提示上調 TXNIP 蛋白表達可能是治療乳腺癌的潛在策略。
另外，NLRP3 亦與乳腺癌的發生發展關系密切。Zhang 等[18]及 Ershaid 等[19]的研究證實，NLRP3 活化可促進 NLRP3 下游靶分子 IL-1β、IL-18 及 VEGF 的表達，促進機體免疫抑制及腫瘤血管生成，促進腫瘤的侵襲與轉移；而抑制 NLRP3 表達，可降低體內外乳腺癌的生長和免疫抑制。本研究檢測到 NLRP3 蛋白在乳腺癌組織及乳腺癌細胞系中的相對表達量高于癌旁組織及正常乳腺細胞，提示 NLRP3 過表達可能與乳腺癌的發生有關。本研究進一步檢測發現，過表達 NLRP3 后，MDA-MB231 細胞中 NLRP3 及其介導的 IL-1β 和 IL-18 蛋白相對表達量均進一步升高的同時，細胞增殖活性及 VEGF 表達并未像文獻[18-19]中所示的升高，而是顯示出較低的增殖活性及侵襲、遷移能力，提示 NLRP3 高表達可抑制腫瘤的增殖，這與 Zhang 等[18]及 Ershaid 等[19]的 NLRP3 活化促進腫瘤的侵襲與轉移觀點相矛盾。深入研究發現，NLRP3 炎癥小體可誘導腫瘤細胞焦亡。曾琬琴等[20]研究發現，NLRP3 等炎癥小體可激活 pro-caspase-1 的活化，活化的 pro-caspase-1 可切割細胞焦亡關鍵蛋白-底物蛋白（GSDMD）形成具有膜毒性的 GSDMD-N 端 p30 片段，并靶向定位于細胞膜脂質雙分子層上，使細胞膜形成孔洞，進而破壞細胞膜的完整性、降低膜內外的離子濃度梯度，導致細胞腫脹、破裂及內容物（溶酶體、炎性因子等）大量釋放，最終導致細胞焦亡。Chen 等[21]及 Kofahi 等[22]研究發現，肝癌患者癌組織中存在 NLRP3 活化及細胞焦亡，且 NLRP3 高表達可引起肝癌細胞焦亡，caspase-1 抑制劑可逆轉細胞焦亡引起的癌細胞損傷。本研究檢測到 NLRP3 過表達后，細胞中與焦亡相關的 caspase-1 和 pro-caspase-1 蛋白相對表達量高于空白對照組，乳腺癌細胞表現出更低的增殖、侵襲和遷移能力以及成瘤能力，提示 NLRP3 活化介導的細胞焦亡也可能參與了乳腺癌細胞增殖、侵襲、遷移過程。另外，Liu 等[6]研究發現，TXNIP 可與 NLRP3 相互作用，激活 NLRP3 炎癥小體，使炎癥因子 IL-1β 分泌增加并誘導 caspase-3 活化來促進肺腺癌細胞焦亡。本研究也在 TXNIP 過表達組檢測到 NLRP3 和 pro-caspase-1 蛋白相對表達量高于空白對照組，提示 TXNIP 過表達可促進 NLRP3 活化，使細胞焦亡途徑激活，這可能是 TXNIP 抑制腫瘤生長、侵襲和遷移的可能機制，與肺腺癌中 TXNIP-NLRP3 介導的炎癥反應激活，增加細胞凋亡的報道一致[6]。本研究還發現，在 TXNIP 與 NLRP3 過表達共轉染組細胞中，隨著 TXNIP 及 NLRP3 蛋白表達的進一步升高，pro-caspase-1 和 caspase-1 蛋白的表達也進一步升高，細胞表現出更低的增殖、侵襲和遷移能力，且成瘤能力也進一步降低，提示 NLRP3 活化可促進 TXNIP 對乳腺癌細胞增殖、侵襲與遷移的抑制作用。
綜上所述，在乳腺癌組織及乳腺癌細胞系中，TXNIP 蛋白呈低表達，NLRP3 蛋白呈高表達。TXNIP 與 NLRP3 可相互作用共同促進細胞焦亡，抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲與遷移，可能為闡明 TXNIP 抑制腫瘤惡性行為的機制提供一定參考依據。但本研究還存在一定的不足，TXNIP/NLRP3參與腫瘤細胞焦亡過程的靶向基因調控機制復雜且不明確，NLRP3 炎癥小體在乳腺癌中的調控作用還存在爭議，還有待進一步驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：馮海玲負責課題設計、方案實施、撰寫論文；范長玲負責實施研究、收集數據；潘中軍負責收集數據、統計分析、查閱文獻；何圣科負責撰寫論文、整理修改等。
倫理聲明：本研究通過了儋州市人民醫院醫學倫理委員會的審批（批文編號：IACUC-104093）。
